中藥材草龍中葒草苷、異葒草苷含量的測定

曾雨嫻，盧汝梅，劉美余，楊潔儀，廖廣鳳

（廣西中醫(yī)藥大學藥學院，南寧 530200）

草龍［Ludwigia hyssopifolia（G.Don）Exell］為柳葉菜科丁香蓼屬一年生草本植物，可全草入藥，味淡、性涼。分布于中國臺灣、廣東、海南、廣西和云南等省（自治區(qū)），野生資源十分豐富，具有清熱、解毒、利尿、涼血止血之功效［1］，抗菌作用明顯［2］。其在廣西壯族自治區(qū)（以下簡稱廣西）分布廣泛，是壯醫(yī)臨床和民間長期習用的解毒藥材，《廣西壯族自治區(qū)壯藥質量標準》記載其壯名為Gvahgya，常用于貧痧（感冒發(fā)熱）、貨煙媽（扁桃體炎）、口腔炎、屙瀉（泄瀉）、喯咁（疳癥）、唄膿（癰瘡）等疾病的治療［3，4］。

國內外對中藥材草龍的化學成分、藥理作用及其質量控制的研究較少。文獻報道中藥材草龍中主要含有黃酮、三萜、酚類、大環(huán)內酯、生物堿、香豆素等類型化學成分［5-7］。筆者所在的廣西中醫(yī)藥大學藥學院盧汝梅團隊前期從草龍中分離鑒定出異葒草苷、葒草苷、齊墩果酸、ozoroalide、de-O-methyllasiodiplodin 等40 多種化合物［5，6］。Rao 等［7］從草龍中分離出2α、3β、19α、6β、24-penta hydroxylurs-12-en-18-oic acid、xanthyletin 等6 種化合物，朱丹等［8］采用HPLC 法測定了不同產(chǎn)地草龍中沒食子酸的含量，11 批草龍藥材沒食子酸含量為0.52%～5.14%，平均為2.61%。壯藥質量標準中草龍TLC 鑒別法采用沒食子酸作為指標成分［9］，為草龍藥材的質量評價提供了一定的科學依據(jù)。受藥材產(chǎn)地、采收時間等因素影響，草龍藥材的化學成分種類、含量及藥理作用可能存在一定差異?！稄V西壯族自治區(qū)壯藥質量標準》規(guī)定草龍藥材中沒食子酸含量不得少于0.45%，但沒食子酸在中草藥中廣泛存在，并不具有特征性，作為草龍質量控制的指標性成分沒有專屬性，難以達到真正控制藥材質量的目的。

預試驗從草龍中分離得到的異葒草苷和葒草苷為黃酮碳苷，在其他植物中鮮見，葒草苷具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗凝血、抗菌等作用；異葒草苷具有抗氧化、抗炎、抗病毒、降血糖、抗腫瘤等藥理作用，都是清熱解毒的活性成分［10，11］，其藥理活性與草龍的功效和臨床用途直接相關。因此，為了提高草龍質量標準的專屬性和相關性，本研究以預試驗分離得到的異葒草苷和葒草苷作為測定指標，采用HPLC 法分別對廣西不同產(chǎn)地草龍的葒草苷及異葒草苷成分進行了含量測定，旨在為提升中藥材草龍的質量標準提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

Agilent 1100 型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；COSMOSIl5 C18-PAQ色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；SQP 萬分之一電子天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；KQ5200B 型超聲波清潔器（昆山市超聲儀器有限公司）；Direct-QR5UV 型自動純水蒸餾器（廣西南寧市博美生物科技有限公司）。

1.2 試藥

對照品葒草苷（批號28608-75-5，純度99.9%）、異葒草苷（批號4261-42-1，純度99.9%）均購自成都麥德生科技有限公司；甲醇、乙腈（色譜純，美國Fisher 公司）；乙醇、甲醇（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。草龍藥材采自廣西6 個不同產(chǎn)地，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學梁子寧教授鑒定為柳葉菜科丁香蓼屬植物草龍的干燥全草。樣品信息詳見表1。

表1 樣品信息

1.3 方法

1.3.1 供試品溶液的制備 精密稱定草龍藥材（L1）1.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇20 mL，提取2 次，每次超聲波1 h，補重、過濾，合并濾液，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，得到供試品溶液。

1.3.2 對照品溶液的制備 精密量取對照品葒草苷1.03 mg、異葒草苷1.19 mg，分別置于50 mL 容量瓶中，加70%乙醇溶解后稀釋至刻度，搖勻，得到0.020 6 mg/mL 的葒草苷、0.023 7 mg/mL 的異葒草苷對照品溶液。

1.3.3 色譜條件 色譜柱：COSMOSIl5C18-PAQ（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.2%甲酸水（15∶85）；等度洗脫40 min；流速1 mL/min；柱溫40 ℃；檢測波長340 nm；進樣量15 μL。

1.3.4 線性關系考察 分別精密吸取各對照品溶液0.4、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0 mL 于5 mL 容量瓶中，用70%乙醇溶液定容至刻度，搖勻，過濾，取濾液于樣品瓶后，按“1.3.3”色譜條件進樣分析，記錄峰面積。

1.3.5 穩(wěn)定性試驗 取同一批次樣品（L1）1.0 g，按照“1.3.1”方法制備供試品溶液。按“1.3.3”色譜條件，分別于0、4、6、8、12、20、24 h 測定，記錄峰面積，計算RSD。

1.3.6 精密度試驗 取同一批次樣品（L1）1.0 g，按照“1.3.1”方法制備供試品溶液。在“1.3.3”色譜條件下連續(xù)進樣6 次，記錄峰面積，計算RSD。

1.3.7 重復性試驗 取同一批次樣品（L1）6 份，每份1.0 g，分別按照“1.3.1”方法制備供試品溶液，按“1.3.3”色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算RSD。

1.3.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的同一批樣品（L1）6 份，每份0.500 0 g，分別加入與樣品含量等量的葒草苷（0.187 4 mg/mL）、異葒草苷（0.351 7 mg/mL）各1 mL 進行提取，按照“1.3.1”方法制備供試品溶液，在“1.3.3”色譜條件下進樣測定，記錄峰面積，計算回收率，計算RSD。

1.3.9 樣品含量測定 取6 批不同產(chǎn)地草龍藥材各3 份，每份1.0 g，精密稱定，按照“1.3.1”方法分別制備供試品溶液，按照“1.3.3”色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算葒草苷和異葒草苷的含量。

2 結果與分析

2.1 線性關系考察

樣品HPLC 色譜見圖1。以進樣質量濃度為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y），建立線性回歸方程，其線性范圍和相關系數(shù)（r）詳見表2。結果表明，葒草苷和異葒草苷分別在0.001 6～0.016 4 μg/μL、0.001 9～0.018 9 μg/μL 水平上線性關系良好。

圖1 樣品HPLC 色譜

表2 各成分線性關系

2.2 穩(wěn)定性試驗

經(jīng)測定，葒草苷和異葒草苷峰面積的RSD分別為0.89%、1.12%，表明供試品溶液在24 h 內穩(wěn)定性良好。

2.3 精密度試驗

經(jīng)測定，葒草苷和異葒草苷峰面積的RSD分別為0.89%、1.13%，表明該儀器的精密度良好。

2.4 重復性試驗

經(jīng)測定，葒草苷和異葒草苷峰面積RSD分別為2.74%、2.67%，表明該方法的重復性良好。

2.5 加樣回收率試驗

加樣回收試驗結果見表3。葒草苷和異葒草苷的平均回收率分別為109.37%、96.40%，RSD分別為1.96%、2.84%，說明該方法的回收率符合要求。

表3 各成分加樣回收率試驗結果（n=6）

2.6 樣品含量測定

樣品測定結果見表4。從表4 可以看出，6 批不同產(chǎn)地草龍藥材，葒草苷和異葒草苷的平均含量分別為0.148 3、0.246 7 mg/g。

表4 各成分含有量測定結果（n=3）（單位：mg/g）

3 討論

3.1 含量測定指標的選擇

鮮見草龍藥材相關質量控制研究，現(xiàn)行壯藥質量標準中草龍的TLC 鑒別方法采用沒食子酸作為指標成分。朱丹等［8］采用HPLC 法測定了不同產(chǎn)地草龍中沒食子酸的含量，但僅有沒食子酸的含有量測定，指標成分專屬性和相關性不強。需要建立草龍藥材安全、有效的質量控制方法和質量標準。黃酮類成分作為一類重要的天然有機化合物，廣泛存在于植物的根、莖、葉、花、果實等中，種類繁多，且結構類型復雜多樣，具有抗氧化、抑菌消炎、抗癌、降血壓和保護心血管等作用［12，13］。異葒草苷和葒草苷為黃酮碳苷，研究表明其藥理活性與草龍藥材的功效、臨床用途直接相關。故本研究采用預試驗分離得到的異葒草苷和葒草苷作為含有量測定指標，符合中藥質量標志（Q-marker）［14，15］的選擇條件。所建立的含量測定方法操作簡便、穩(wěn)定可靠，可用于草龍藥材的質量控制。

3.2 提取方法的選擇

不同因素對草龍的提取率影響不同。在提取方式方面，預試驗考察了超聲、回流、冷浸3 種不同的提取方式，發(fā)現(xiàn)超聲提取法的異葒草苷、葒草苷含量較高，所以本研究選擇超聲提取方法；在溶劑選擇方面，預試驗考察了60%、70%、80%乙醇和50%、60%、70%、80%甲醇，發(fā)現(xiàn)70%乙醇和60%甲醇的提取效果較好，二者提取率率相差不大，從安全和經(jīng)濟角度考慮，乙醇毒性較小、更安全，工業(yè)乙醇價格更便宜且易回收，故選擇70%乙醇作為提取溶劑；在料液比方面，預試驗考察了1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（m∶V，g/mL）4 個比例，發(fā)現(xiàn)隨著溶劑比例增加，提取率增大，在1∶20 時提取率最高；同時，隨著提取時間和提取次數(shù)的增加，提取率增加，在提取時間方面，預試驗考察了30、60、90、120 min 4 個時間，在提取次數(shù)方面，預試驗考察了1、2、3、4共4 個次數(shù)；結果顯示在90 min 和提取3 次時提取率開始下降，所以提取的最佳料液比為1∶20，提取時間為60 min，提取次數(shù)為2 次。

3.3 色譜條件的選擇

波長的選擇上，預試驗在DAD 信號檢測器下分別對葒草苷和異葒草苷進行全波長范圍掃描，結果顯示340 nm處為二者的最大吸收波長，故選擇340 nm作為檢測波長；柱溫的選擇上，考察了30、35、40 ℃對樣品檢測的影響，發(fā)現(xiàn)柱溫40 ℃時，分離度較好且峰面積較大，故柱溫選擇40 ℃；流動相的選擇上，預試驗考察了甲醇-純水、乙腈-純水、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.2%甲酸等流動相，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%甲酸與乙腈-0.2%甲酸等度洗脫效果較佳、分離度較好，但后者的峰面積較大，綜合考慮選擇乙腈-0.2%甲酸作為流動相；體積流量的選擇上，預試驗考察了0.8、1.0、1.2 mL/min 3種流速，發(fā)現(xiàn)流速為1.0 mL/min時，分離度與峰型較好且峰面積較大，因此選擇1.0 mL/min 作為洗脫流速；進樣量的選擇上，考察了10、15、20 μL 3 種進樣量，結果顯示隨著進樣量增大峰面積增大，但進樣量為20 μL 時色譜峰出現(xiàn)了明顯的前沿峰，而15 μL 的進樣量時峰型更好，以此選擇15 μL 進樣量。

4 小結

本研究通過對色譜條件和草龍藥材提取方式的考察，確定了最佳色譜條件：波長340 nm、流速1.0 mL/min、進樣量15 μL、柱溫40 ℃、流動相為乙腈-0.2%甲酸；最佳提取方式：70%乙醇，超聲波提取2 次，料液比1∶20，每次超聲波1 h。試驗還進行了方法學考察，發(fā)現(xiàn)其精密度、穩(wěn)定性、重復性RSD均小于3.0%，符合方法學試驗要求，加樣回收試驗結果在80%～120%的允許限之間，符合定量分析的要求。經(jīng)檢測，不同產(chǎn)地的草龍中異葒草苷和葒草苷的含量差異較大，其中南寧市邕寧區(qū)園博園樣品中的異葒草苷和葒草苷含量最大，靈山縣的2 種成分含量最小。這可能與草龍的生長環(huán)境、采收時間不同有關，且樣品中葒草苷和異葒草苷含量呈正相關。本研究建立的含量測定方法操作簡便、穩(wěn)定可靠，可用于中藥材草龍的質量控制。