貴州省正安縣不同養(yǎng)殖模式下雞H5、H7 和H9 亞型禽流感血清學(xué)調(diào)查

何 婭，錢 林，鄧位喜，王 娜，周 林，楊玉能，鮑 娟，孫寶盛，代佳娣，經(jīng)有林

（1.貴州省正安縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州遵義 563499；2.遵義職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州遵義 563000）

禽流行性感冒（Avian influenza，AI）俗稱禽流感，病原為正黏病毒科的禽流感病毒，其毒力因子除HA 和NA 外，還包括NP基因及聚合酶基因等表達(dá)產(chǎn)物的綜合作用［1］。未裂解的HA 無感染性，只有在靶器官呼吸道及腸道組織相應(yīng)的蛋白酶作用下，HA 裂解為HA1 和HA2，暴露融合肽段，通過融合進(jìn)人宿主細(xì)胞。已知高致病力毒株與低致病力毒株的H 裂解位點(diǎn)的氨基酸序列有差異，前者為－XX－精氨酸－X－精氨酸/賴氨酸－精氨酸－（X 為非堿性氨基酸），而低致病力毒株僅有單個(gè)精氨酸，切割率極低，不易裂解。能否裂解和融合不僅取決于毒株和組織，也與宿主種類有關(guān)。

分離的H5 亞型高致病性毒株對(duì)家養(yǎng)鴨、鵝及野生雁和天鵝等也具有強(qiáng)致病性［2］。除HA 富含堿性氨基酸之外，NA 莖部26 個(gè)氨基酸缺失變短及PB2 蛋白第627 位氨基酸由谷氨酸突變?yōu)橘嚢彼嵋部墒共《镜亩玖ψ儚?qiáng)［3］。禽流感病毒的多數(shù)強(qiáng)毒株感染雞或火雞可出現(xiàn)病毒血癥，導(dǎo)致胰腺炎、心肌炎、肌炎及腦炎等。在發(fā)病后3～7 d 可檢出中和抗體，在第2 周達(dá)到高峰，可持續(xù)18 個(gè)月以上。大量病毒可通過糞便排出，在環(huán)境中長期存活，尤其是在低溫水中。病毒通過野禽傳播，尤其是野鴨。尚不清楚病毒如何在野禽群體中長年存在，有可能以低的水平維持，即使在遷徙及越冬時(shí)也是如此。加拿大20%野鴨在向南遷飛前已輕度感染病毒，中國多種野鴨也有較高的病毒檢出率［4］。

禽流感病毒可感染不同品種和日齡的禽類，且冬、春季節(jié)多發(fā)，四季可發(fā)。其中H5 和H7 亞型禽流感病毒引起高致病性禽流感被世界衛(wèi)生組織（OIE）確定為A 類烈性傳染病，中國也將其列為一類疫?。?］。其主要特征為突然發(fā)病，傳播速度快，病死率高達(dá)100%，且禽流感病毒能感染人，某些毒株甚至可不經(jīng)過混合重配再傳染的過程直接感染人并致死。為了掌握貴州省正安縣各種飼養(yǎng)模式下禽流感免疫情況，2020—2022 年對(duì)雞進(jìn)行抗體監(jiān)測(cè)，以期為進(jìn)一步提高正安縣雞疫病防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 雞血清來源

正安縣雞養(yǎng)殖主要為生態(tài)養(yǎng)殖，養(yǎng)殖形式為零星散養(yǎng)戶、養(yǎng)殖場(chǎng)、合作社等形式。2020—2022 年科技特派員下鄉(xiāng)時(shí)隨機(jī)抽取各種養(yǎng)殖模式的雞只血液制備血清進(jìn)行H5、H7、H9免疫抗體檢測(cè)（表1）。

表1 雞血清樣本來源

1.2 主要試劑與儀器

一次性96 孔V 型微量反應(yīng)板、禽流感H5 亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原、禽流感H7 亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原、禽流感H9 亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原、陽性血清、陰性血清均購自哈爾濱國生生物科技股份有限公司。單道及多道微量移液槍、移液槍吸頭、加樣槽、吸管、燒杯、振蕩器、恒溫箱、1%雞紅細(xì)胞懸液等由正安縣動(dòng)物疫病控制中心獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 檢測(cè)方法

根據(jù)國家《高致病性禽流感診斷技術(shù)》（GB/T 18936—2020）采用血凝抑制試驗(yàn)（HI）對(duì)所采集的660 份雞血清進(jìn)行禽流感病毒H5、H7 亞型抗體效價(jià)檢測(cè)，并采用同樣方法對(duì)禽流感病毒H9 亞型進(jìn)行抗體效價(jià)檢測(cè)。采集SPF 公雞血液制備1%紅細(xì)胞懸液。

1.3.1 血凝（HA）試驗(yàn) 按照倍比稀釋法在96 孔微量反應(yīng)板的每孔中加入25 μL PBS液，在第1 孔加25 μL 抗原，反復(fù)抽打5次混勻后由第1 孔吸取25 μL 抗原加入第2 孔，混勻后吸取25 μL 加入第3孔，如此進(jìn)行對(duì)倍稀釋至第11 孔，從第11 孔吸取25 μL 棄去，每孔均加入25 μL 1%雞紅細(xì)胞懸液與25 μL PBS 液，將反應(yīng)板置于振蕩器振蕩2 min，于25 ℃恒溫箱中靜置30 min，在對(duì)照孔紅細(xì)胞呈明顯紐扣狀沉于孔底時(shí)觀察結(jié)果。

1.3.2 血凝抑制（HI）試驗(yàn) 根據(jù)HA 試驗(yàn)測(cè)定的效價(jià)，配制4 單位（4HAU）抗原。在96 孔微量反應(yīng)板的第1 孔至第11 孔加入25 mL PBS，第12 孔加入50 μL 的PBS。第1 孔加入25 μL 血清，充分混勻后吸25 μL 于第2 孔，依次對(duì)倍稀釋至第10 孔，從第10孔中吸取25 μL 棄去。第1 孔至第11 孔均加入25 μL 的4HAU 抗原，于25 ℃恒溫箱中靜置30 min，每孔加入25 μL 1%雞紅細(xì)胞懸液，振蕩混勻，再于25 ℃恒溫箱中靜置30 min，在對(duì)照孔紅細(xì)胞呈明顯紐扣狀時(shí)判定結(jié)果。

1.4 結(jié)果判定

禽流感H5、H7、H9 亞型以完全抑制4HAU 抗原的最高血清稀釋倍數(shù)判為該血清的HI 效價(jià)。在陽性對(duì)照血清的HI 效價(jià)與已知效價(jià)誤差不超過1 個(gè)滴度，陰性對(duì)照血清效價(jià)不高于2log2 時(shí)，試驗(yàn)成立。被檢血清HI 效價(jià)≤3log2 判為陰性；等于4log2 判為可疑；≥5log2 判為陽性。

2 結(jié)果與分析

經(jīng)血凝-血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)，2020—2022 年隨機(jī)抽檢的660 份血清H5、H7、H9 亞型禽流感總體抗體效價(jià)陽性率分別為78.90%、77.88%、79.69%，均達(dá)到國家規(guī)定≥70%的要求；2020—2022 年正安縣禽流感H5 亞型抗體陽性率分別為81.00%、79.20%、76.30%，H7 亞型抗體陽性率分別為74.00%、77.90%、82.00%，H9 亞型抗體陽性率分別為78.64%、70.00%、84.00%，H5 亞型抗體水平呈逐年下降的趨勢(shì)，H7 亞型抗體水平呈逐年升高的趨勢(shì)，H9 亞型抗體水平呈先降低后升高的趨勢(shì)，均達(dá)到國家規(guī)定≥70%的要求（表2）。

表2 2020—2022 年正安縣隨機(jī)抽檢血清禽流感抗體監(jiān)測(cè)結(jié)果

3 小結(jié)與討論

血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)禽流感抗體是廣泛應(yīng)用的一種方法，具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)量大、敏感性好等優(yōu)點(diǎn)［6］。試驗(yàn)通過對(duì)貴州省正安縣禽流感病毒抗體檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)禽流感病毒抗體檢測(cè)合格率符合國家標(biāo)準(zhǔn)，得益于貴州省正安縣積極的防疫檢疫工作。馬衛(wèi)紅等［5］檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，2017 年惠水縣高致病性禽流感H5 亞型免疫抗體合格率為70.93%，H7 亞型免疫抗體合格率僅為29.33%，H7 免疫合格率較低。王兵等［6］2018 年對(duì)貴州省部分地區(qū)高致病性禽流感H5 和H7 亞型免疫抗體檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，被檢測(cè)地區(qū)H5 亞型免疫抗體合格率為68.1%，H7 亞型免疫抗體合格率為65.75%，都沒有達(dá)到農(nóng)業(yè)農(nóng)村部的要求，與本試驗(yàn)的貴州省正安縣禽流感免疫抗體檢測(cè)結(jié)果存在差異。比較發(fā)現(xiàn)，貴州省正安縣高致病性禽流感H5、H7、H9 亞型免疫抗體的合格率較高，H5、H7、H9 亞型禽流感總體抗體效價(jià)陽性率分別為78.90%、77.88%、79.69%，建議貴州省正安縣在維持免疫水平的基礎(chǔ)上，建立嚴(yán)格的衛(wèi)生管理制度。禁止雞和水禽混養(yǎng)，養(yǎng)雞場(chǎng)與水禽飼養(yǎng)場(chǎng)應(yīng)間隔3 km以上，且不得共用同一水源［7］。養(yǎng)禽場(chǎng)要有防止禽鳥（包括水禽）進(jìn)人飼養(yǎng)區(qū)的設(shè)施，防止一切帶毒動(dòng)物特別是鳥類以及被污染物品接觸本地雞群，并有健全的滅鼠設(shè)施和措施。同時(shí)防止人員、來訪客、飼養(yǎng)用具等雜物的間接傳播，對(duì)外來欲接觸雞的人員及車輛進(jìn)行嚴(yán)格消毒，嚴(yán)格執(zhí)行衛(wèi)生消毒管理制度，注重飼料來源安全，不從疫區(qū)購進(jìn)種蛋和雞苗，新購進(jìn)的雞、雞苗、孵育的小雞必須接種疫苗，并隔離觀察2 周以上［8］。

結(jié)合實(shí)際制定科學(xué)的免疫措施，并根據(jù)正安縣當(dāng)?shù)匾卟×餍星闆r、飼養(yǎng)類型進(jìn)行免疫接種，疫苗免疫接種應(yīng)選擇相同亞型的禽流感疫苗按免疫程序?qū)仪葸M(jìn)行預(yù)防接種，研制與使用的疫苗有禽流感滅活疫苗（H5N2 亞型、H5N1 亞型、H9 亞型）、禽流感（H5N2 +H9N2）二價(jià)滅活疫苗、重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1 亞型，Re-1 株）和禽流感-新城疫重組二聯(lián)活疫苗（rL-H5 株）、禽流感-雞痘重組二聯(lián)活疫苗（rFPV-H6 株）［9］。以上疫苗應(yīng)按照一定的免疫程序接種，對(duì)產(chǎn)蛋雞，20～30 日齡進(jìn)行首免，頸部皮下注射0.3～0.5 mL，開產(chǎn)前20 d 進(jìn)行二免，胸肌注射0.5 mL；種雞及禽流感高發(fā)地區(qū)，在300 日齡進(jìn)行三免，或在雛雞10～12 日齡用禽流感新城疫重組二聯(lián)活疫苗（rL-H5 株）滴鼻首免，以后可選擇活疫苗或滅活苗免疫。對(duì)商品肉仔雞，要根據(jù)需要確定是否接種［10］。

注意免疫監(jiān)測(cè)，當(dāng)抗體滴度大于5log2 時(shí)雞群才能得到保護(hù)［11］。同時(shí)做好疫情流行的應(yīng)急準(zhǔn)備工作，一旦發(fā)生或疑似高致病性禽流感，應(yīng)及時(shí)報(bào)告疫情，正確診斷，追蹤調(diào)查，采取隔離、限制移動(dòng)等措施，劃定疫點(diǎn)、疫區(qū)和受威脅區(qū)，嚴(yán)格封鎖［12］。疫區(qū)內(nèi)所有禽只以不放血方式撲殺，并對(duì)所有病死禽、被撲殺禽、禽類產(chǎn)品、排泄物、被污染飼料、墊料、污水等按國家規(guī)定進(jìn)行無害化處理，對(duì)被污染的物品、交通工具、用具、禽舍、場(chǎng)地進(jìn)行嚴(yán)格徹底消毒，對(duì)受威脅區(qū)內(nèi)所有易感禽類采用國家批準(zhǔn)使用的疫苗進(jìn)行緊急強(qiáng)制免疫接種，建立完整的免疫檔案［13］。發(fā)生低致病性禽流感時(shí)，可在嚴(yán)密隔離的條件下，進(jìn)行必要的藥物治療，以減少損失［14］。配合應(yīng)用清熱解毒、止咳平喘的中藥如板藍(lán)根、大青葉、連翹和清瘟散等，效果更好［15］。由于該病常并發(fā)或繼發(fā)大腸桿菌或支原體感染，因此適當(dāng)應(yīng)用抗菌藥物，如氟苯尼考、強(qiáng)力霉素、環(huán)丙沙星、利高霉素等，以減少死亡。要有計(jì)劃、有組織地收集檢測(cè)信息，按照要求進(jìn)行監(jiān)測(cè)，建立和完善禽流感監(jiān)測(cè)系統(tǒng)［16］。