丹荷顆粒對高膽固醇血癥大鼠肝臟超微結(jié)構(gòu)及SREBP-1、LXRα、RXRA蛋白表達的影響

于彤，張珊，喬艷芳，劉素素，楊雙杰，俞德帥，于雪，薛曉琳，柴欣樓，王偉

北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029

高膽固醇血癥是以血液中總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平顯著升高為主要表現(xiàn)的一種疾病，是我國血脂異常患者臨床主要分型之一?！吨袊芾碇改希?023年）》顯示，近年來血脂異?？傮w發(fā)病率逐年上升，其中以高膽固醇血癥最為明顯[1]。當血液中膽固醇含量異常升高，長期不受控制時，會誘發(fā)動脈粥樣硬化，進而導(dǎo)致嚴重的心血管事件，有效防治高膽固醇血癥是預(yù)防心血管疾病的重要措施[2]。

肝臟是脂質(zhì)代謝的重要器官，肝細胞對脂質(zhì)具有儲存和分泌作用。肝細胞中存在多個調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵靶點，其中肝X受體α（LXRα）是核受體超家族成員，通過與視黃醇X受體α（RXRA）結(jié)合形成異二聚體影響膽固醇和脂質(zhì)代謝[3]。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1（SREBP-1）是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，在脂質(zhì)合成基因的調(diào)控中有重要作用[4]。

丹荷顆粒來源于名老中醫(yī)郭維琴的經(jīng)驗方丹荷湯，由丹參、荷葉、虎杖、薏苡仁、陳皮、山楂組成，具有活血消食、祛濕健脾功效。藥物成分測定發(fā)現(xiàn)，方中含有丹參素、虎杖苷、白藜蘆醇等多種有效成分[5-6]。其中丹參素可以減少脂肪酸和內(nèi)源性膽固醇合成，加速脂肪酸氧化分解[7]；虎杖苷可抑制膽固醇代謝相關(guān)基因，促進膽固醇外排[8]；白藜蘆醇能抑制Akt蛋白表達及其磷酸化，下調(diào)mTOR蛋白表達，減少肝細胞內(nèi)脂質(zhì)堆積[9]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，丹荷顆粒具有良好的調(diào)節(jié)血脂作用，可以降低高脂血癥大鼠血清TC 和LDL-C含量，其機制與抑制小腸膽固醇吸收、促進小腸膽固醇排出有關(guān)[10]，然而其對肝臟脂質(zhì)代謝的影響及作用機制尚不清楚。本研究觀察丹荷顆粒對高膽固醇血癥模型大鼠肝臟內(nèi)脂質(zhì)沉積及相關(guān)蛋白表達的影響，探討其保護肝臟的作用機制，為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF 級8 周齡健康雄性SD 大鼠36 只，體質(zhì)量180～200 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物許可證號SCXK（京）2019-0008。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，溫度（25±2）℃，濕度（50±10）%，12 h/12 h晝夜循環(huán)，自由飲水攝食。本實驗通過北京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會審查批準（BUCM-4-2021040106-2119）。

1.2 藥物及制備

丹荷顆粒由丹參、荷葉、虎杖、薏苡仁、凈山楂、陳皮按1∶1.5∶1∶3∶1∶1比例組成。顆粒劑由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院提供，使用熱純凈水溶解，待恢復(fù)常溫后使用。阿托伐他汀鈣片，批號1C2354DL3，齊魯制藥有限公司，10 mg/片，將藥片研碎后，用純凈水溶解，配制成0.21 mg/mL溶液。

1.3 試劑與儀器

通用型組織細胞固定液、油紅O染液、蘇木素染液、電鏡固定液（貨號分別為G1101、G1015、G1004、G1102，武漢賽維爾），SREBP-1抗體（貨號ab28481，英國Abcam），LXRα 抗體（貨號CY6866，上海Abways），RXRA抗體（貨號21218-1-AP，美國Proteintech），β-actin 抗 體（貨 號AB2001，上 海Abways）。 電 子 天 平（ 型 號BSA224S， 德 國Sartorius），全自動生化分析儀（型號120，日本東芝），高速離心機（型號D-37520，德國Sigma），酶標儀（型號Bio-RadiMark，美國伯樂），超分辨顯微組織成像儀（型號A009，德國Leica），冰凍切片機（型號HM43，美國賽默飛），電泳儀（型號PowerPaTM，美國伯樂），凝膠成像儀（型號5200，上海天能）。

1.4 分組、造模及給藥

36只SD大鼠隨機分為空白對照組、模型組、陽性藥組和丹荷高、中、低劑量組，每組6只，除空白對照組外，其余各組均予2 mL/100 g高脂乳劑（含豬油30 g、膽固醇5 g、蛋黃粉5 g、丙硫氧嘧啶0.5 g、吐溫80 4 mL，用蒸餾水定容至100 mL，充分攪拌而成）灌胃，同時更換潮濕墊料飼養(yǎng)建立高膽固醇血癥模型，空白對照組用正常墊料飼養(yǎng)并予等體積純凈水灌胃，1次/d，連續(xù)12周。第6周末眼眶取血檢測各組大鼠血脂，造模大鼠TC、LDL-C含量顯著高于空白對照組（P＜0.05），提示高膽固醇血癥造模成功。第7周開始，各給藥組造模同時予相應(yīng)藥物灌胃，按人與大鼠等效劑量計算給藥劑量，丹荷高、中、低劑量組予丹荷顆粒溶液3.30、1.10、0.37 g/kg灌胃，陽性藥組予阿托伐他汀溶液2.1 mg/kg灌胃，灌胃體積10 mL/kg?？瞻讓φ战M和模型組予等體積純凈水，連續(xù)6周。

1.5 指標檢測

1.5.1 肝重比

末次給藥后大鼠禁食不禁水24 h，稱量體質(zhì)量，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，剖腹，分離肝臟，稱量肝臟質(zhì)量，計算肝重比（肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量）。

1.5.2 血脂及肝功能檢測

大鼠稱重后腹主動脈采血，室溫靜置2 h，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，分離血清，全自動生化分析儀檢測血清TC、三酰甘油（TG）、LDL-C、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）含量。

1.5.3 油紅O染色

取新鮮肝組織，冷凍后制備冰凍切片，固定，油紅O染色，分化后進行蘇木素染色，封片，顯微鏡下觀察。用Image J圖像分析軟件計算染色面積比（染色面積÷區(qū)域面積×100%）。

1.5.4 透射電鏡觀察

剪取肝組織1 cm3，置于4 ℃預(yù)冷電鏡固定液中，分別進行后固定、脫水、包埋、聚合、超薄切片、染色，透射電鏡下掃描并拍照。

1.5.5 Western blot檢測

取大鼠肝組織，提取蛋白后，BCA法進行蛋白定量。加熱使蛋白變性，電泳、轉(zhuǎn)膜后，常溫封閉2 h，加SREBP-1、LXRα、RXRA一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，加二抗，常溫孵育1 h，ECL法曝光，凝膠成像儀成像，用Image J軟件分析條帶灰度值，計算目的蛋白與內(nèi)參（β-actin）灰度值比值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS26.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以±s表示，符合正態(tài)分布采用方差分析，方差齊兩兩比較用LSD-t檢驗，方差不齊用Tamhane T2檢驗；不符合正態(tài)分布用非參數(shù)檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丹荷顆粒對模型大鼠肝重比的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量顯著減少，肝重比顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠體質(zhì)量均顯著增加，肝重比顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。見圖1。

圖1 各組大鼠體質(zhì)量和肝重比比較（±s，每組6只）

2.2 丹荷顆粒對模型大鼠血脂及肝功能的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠血清TC、LDL-C、HDL-C、ALT含量均顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清TC、LDL-C、HDL-C含量顯著降低（P＜0.01），丹荷各劑量組血清ALT含量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），丹荷高、低劑量組血清TG含量顯著升高（P＜0.05）。各組大鼠血清AST含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血脂及肝功能指標比較（±s）

表1 各組大鼠血脂及肝功能指標比較（±s）

注：與空白對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

AST/（U/L）171.60±14.32 172.60±42.68 155.50±50.99 187.70±51.11 173.70±48.50 177.40±25.15組別空白對照組模型組丹荷高劑量組丹荷中劑量組丹荷低劑量組陽性藥組只數(shù)6 6 6 6 6 6 TC/（mmol/L）1.35±0.05 2.78±0.40##1.29±0.11**1.36±0.20**1.65±0.30**1.39±0.24**LDL-C/（mmol/L）0.14±0.03 0.36±0.16##0.12±0.02**0.13±0.03**0.15±0.04**0.14±0.03**TG/（mmol/L）0.31±0.05 0.35±0.05 0.60±0.12*0.52±0.09 0.61±0.11*0.33±0.08 HDL-C/（mmol/L）1.10±0.04 1.95±0.22##0.97±0.08**1.04±0.14**1.24±0.19**1.08±0.18**ALT/（U/L）38.43± 3.51 56.43±15.13#36.57± 2.64*33.00± 4.40**34.14± 4.60**40.57± 5.06

2.3 丹荷顆粒對模型大鼠肝組織脂質(zhì)沉積的影響

空白對照組大鼠肝細胞排列有序，肝索規(guī)整。與空白對照組比較，模型組大鼠肝細胞排列紊亂，可見明顯脂肪空泡，肝組織油紅O 染色面積比顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠肝細胞排列相對整齊，脂肪空泡減少，肝組織油紅O染色面積比顯著減少（P＜0.05，P＜0.01），其中丹荷高、中、低劑量組差異更顯著（P＜0.01）。見圖2、圖3。

圖2 各組大鼠肝組織形態(tài)（油紅O染色）

圖3 各組大鼠肝組織脂質(zhì)沉積比較（±s，每組6只）

2.4 丹荷顆粒對模型大鼠肝組織超微結(jié)構(gòu)的影響

空白對照組大鼠肝細胞形態(tài)正常，胞質(zhì)內(nèi)可見極少量脂滴，細胞核大小適中、核膜完整，線粒體廣泛分布在胞質(zhì)內(nèi)、形態(tài)完整，周圍有大量內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，核糖體豐富；與空白對照組比較，模型組大鼠肝細胞內(nèi)脂滴數(shù)量劇增，且大小不一，細胞核固縮、核膜邊界擠壓變形，線粒體形狀發(fā)生改變、邊界不清晰，周圍內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量減少，核糖體存在脫顆?，F(xiàn)象；與模型組比較，丹荷高劑量組大鼠肝細胞邊緣有脂滴分布，脂滴數(shù)量較少，細胞核較大、居中、核膜邊界完整，線粒體形態(tài)相對完整、邊界較清晰，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量較多、結(jié)構(gòu)清晰，核糖體較明顯。見圖4。

圖4 各組大鼠肝組織超微結(jié)構(gòu)

2.5 丹荷顆粒對模型大鼠肝組織固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1、肝X受體α、視黃醇X受體蛋白表達的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠肝組織SREBP-1、LXRα、RXRA蛋白表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，丹荷高劑量組大鼠肝組織SREBP-1、LXRα、RXRA 蛋白表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖5。

圖5 各組大鼠肝組織SREBP-1、LXRα、RXRA蛋白表達比較（±s，每組3只）

3 討論

《靈樞·衛(wèi)氣失?！酚小案嗾?，多氣而皮縱緩，故能縱腹垂腴。肉者，身體容大，脂者，其身收小”，《素問·通評虛實論篇》有“凡治消癉、仆擊、偏枯、痿厥，氣滿、發(fā)逆，肥貴人則高粱之疾也”，對“脂”“膏”等病理特點的描述為現(xiàn)代醫(yī)家提供了理論基礎(chǔ)。目前，臨床多將本病歸因于脾[11]。脾失健運，營養(yǎng)精微不得輸布，脂膏運化失常，氣血運行不暢，故脾虛氣郁血瘀，體內(nèi)脂膏累積發(fā)為本病。治以健脾理氣、活血化瘀。丹荷顆粒方中荷葉升發(fā)清陽之氣，丹參活血祛瘀，二者共為君藥；薏苡仁健脾利水，虎杖歸肝經(jīng)，亦可解毒散瘀，二者共為臣藥；佐以山楂、陳皮理氣健脾。全方以平和、緩消的治法健脾理氣、散瘀活血，從而推動氣血津液等精微物質(zhì)運行，減少脂膏積蓄，發(fā)揮降脂作用。

從微觀層面上來看，脂膏屬于脂質(zhì)代謝的范疇。肝臟是脂質(zhì)代謝的主要場所，調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝對高膽固醇血癥的治療有重要作用。研究顯示，SREBPs和LXRs 2種轉(zhuǎn)錄因子可以感知肝細胞內(nèi)的膽固醇水平，二者既可以作為獨立途徑發(fā)揮作用，又可以在特定條件下相互影響[12]。SREBPs是脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵靶點，主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中[13]，其重要表型SREBP-1 又分為SREBP-1a、SREBP-1c，對膽固醇與脂肪酸合成、膽固醇酯化等過程都具有調(diào)控作用[14-15]。SREBPs在細胞內(nèi)的加工過程較為復(fù)雜，SREBP 裂解激活蛋白與SREBP前體蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，將SREBP運輸?shù)礁郀柣w，再經(jīng)水解酶剪切進入細胞核，從而與目標基因結(jié)合[16]。通常情況下，細胞內(nèi)膽固醇濃度低時，SREBP-1a被激活，直接調(diào)控膽固醇、脂肪酸合成基因；而膽固醇濃度較高時，SREBP-1a進入高爾基體過程受阻，不能與細胞核內(nèi)脂質(zhì)合成基因結(jié)合，從而避免脂質(zhì)積累造成脂毒性，穩(wěn)定細胞內(nèi)脂質(zhì)水平[13]。研究表明，長期高脂喂養(yǎng)和持續(xù)高濃度膽固醇刺激會使SREBP-1蛋白表達異常升高，造成機體內(nèi)膽固醇和脂肪酸雙重積累[17-18]。LXRs是核受體家族的一員，在膽固醇代謝中，LXRα的調(diào)控功能主要作用在膽固醇向膽汁酸分解、多余膽固醇流出、膽固醇酯化等方面[19]。RXRs是核受體家族的中心分子，可以調(diào)節(jié)細胞新陳代謝過程[20]，其生理功能主要依賴于與之結(jié)合的受體。RXRA與LXRα結(jié)合形成異二聚體是LXRα激活的基礎(chǔ)[21]。在膽固醇濃度較高時，LXRα/RXRA收到膽固醇升高的信號進而激活，直接增加下游SREBP-1c表達，激活下游脂肪酸合成基因轉(zhuǎn)錄，造成大量脂肪酸生成。多余的脂肪酸一部分為膽固醇酯化提供底物，同時聚集形成脂滴，促使肝臟脂肪變性。此外，LXRs與SREBPs 的相互作用還表現(xiàn)在膽固醇合成方面，LXRs 激活可能誘導(dǎo)泛素連接酶抑制SREBPs 的另一表型SREBP-2 的成熟過程[19，22]，從而抑制膽固醇合成。

本研究發(fā)現(xiàn)，丹荷顆?？山档透吣懝檀佳Y大鼠肝重比及血清TC、LDL-C、ALT含量，恢復(fù)肝細胞結(jié)構(gòu)，說明丹荷顆?？梢跃徑飧闻K代謝負荷，對肝臟具有一定保護作用。本實驗在高脂乳劑中添加丙硫氧嘧啶，可提升高膽固醇血癥造模速度和幅度，是高脂研究常用工具藥，多用于治療甲狀腺功能亢進癥，長期服用可導(dǎo)致甲狀腺功能減退，從而使血液中TC含量升高。郝維佳等[23]發(fā)現(xiàn)，加入丙硫氧嘧啶可使大鼠血液TC和LDL-C含量升高，同時HDL-C異常升高，而TG無明顯變化。課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)，丹荷顆粒對甲狀腺激素恢復(fù)有一定調(diào)節(jié)作用，故推測給藥后TG、HDL-C含量改變是因甲狀腺激素變化而發(fā)生，后續(xù)將增加丙硫氧嘧啶對照組進行進一步觀察。在高膽固醇血癥研究中，血清TC、LDL-C及油紅O染色是極具代表意義的指標，丹荷高劑量組在關(guān)鍵指標的評價中作用顯著（P＜0.01），因此后續(xù)在微觀結(jié)構(gòu)觀察及降脂分子機制的初步探討中選取高劑量組進行評價。結(jié)果顯示，模型組大鼠肝細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積明顯，線粒體形態(tài)改變，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量減少，肝組織SREBP-1、LXRα、RXRA蛋白表達顯著升高，丹荷高劑量組大鼠肝細胞脂質(zhì)沉積減少，線粒體形態(tài)相對完整、邊界較清晰，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量增加，肝組織SREBP-1、LXRα、RXRA蛋白表達顯著降低。表明丹荷顆?？赡芡ㄟ^下調(diào)肝組織SREBP-1、LXRα、RXRA蛋白表達，抑制肝臟膽固醇合成，減少脂質(zhì)沉積。課題組后續(xù)將對SREBP-1 與LXRα/RXRA的上下游關(guān)系進行深入研究，為中藥防治高膽固醇血癥提供更豐富的研究基礎(chǔ)。