三百棒通過調(diào)控TLR4/NF-κB信號(hào)通路對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞極化的影響*

張宗星， 劉道忠， 江 露， 李瑋怡， 包卓瑪， 萬兆逸，向 珊， 陳 丹， 袁 林，3△

（1湖北民族大學(xué)風(fēng)濕性疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 恩施 445000；2湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部，湖北恩施 445000；3湖北省腎臟病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，湖北 恩施 445000；4湖北恩施學(xué)院，湖北 恩施 445000）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis， RA）是一種慢性自身免疫性疾病，以侵犯關(guān)節(jié)及周圍組織為主，主要特征為淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞和炎癥介質(zhì)相互作用［1-2］，最新數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示RA的患病率為0.4%~1.3%［3］，是目前臨床上致殘率最高的關(guān)節(jié)疾?。?］。巨噬細(xì)胞廣泛存在于關(guān)節(jié)的滑膜和軟骨中，其作為炎癥性疾病最主要的免疫防御細(xì)胞，可以釋放促炎介質(zhì)促進(jìn)炎癥因子的形成，引起骨和軟骨的病理性吸收和破壞［5］。巨噬細(xì)胞極化失衡與RA的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，巨噬細(xì)胞可根據(jù)周圍微環(huán)境的變化極化為促炎的M1 型和抗炎的M2 型，介導(dǎo)免疫/炎癥反應(yīng)和修復(fù)，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的RAW264.7 小鼠巨噬細(xì)胞是經(jīng)典的M1型巨噬細(xì)胞。M2型巨噬細(xì)胞也稱為選擇性激活巨噬細(xì)胞，在免疫中主要表現(xiàn)出抗炎作用，抑制炎癥反應(yīng)。巨噬細(xì)胞在炎癥極化的過程中能通過分泌大量促炎細(xì)胞因子，激活成纖維細(xì)胞和促炎性破骨細(xì)胞，加速炎癥反應(yīng)，造成組織和關(guān)節(jié)的破壞。因此，靶向巨噬細(xì)胞極化可能是治療RA 的新策略，對(duì)巨噬細(xì)胞的炎癥極化進(jìn)行更為深入的研究具有重大意義。

三百棒來源于蕓香科Toddalia屬植物飛龍掌血的根，在湖北恩施土家族地區(qū)被廣泛用于治療風(fēng)濕性疾病。《土家族藥物志》記載其可以祛風(fēng)除濕、活血舒筋、消腫止痛，主治風(fēng)寒濕痹癥［6］。現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，三百棒提取物具有多種生物活性，包括抗風(fēng)濕［7］、抗炎［8］、抗氧化［9］、抗腫瘤［10］等作用。

Toll樣受體4（Toll-like factor 4， TLR4）/核因子κB（nuclaer factor-κB， NF-κB）信號(hào)通路是經(jīng)典的炎癥信號(hào)通路，對(duì)人體內(nèi)關(guān)節(jié)細(xì)胞從增殖分化到代謝凋亡的進(jìn)程起著關(guān)鍵的調(diào)控作用［11］。本課題組前期研究表明三百棒具有很好的抗炎作用［12-13］。張譽(yù)丹［14］的體外實(shí)驗(yàn)研究表明，三百棒醇提物（Toddalia asiaticaalcohol extract， TAAE）可通過TLR/NF-κB 通路成功誘導(dǎo)RA中成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞凋亡。南奕陽［6］通過建立膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠模型進(jìn)一步表明TAAE 可通過抑制TLR4/NF-κB 信號(hào)通路的炎癥放大效應(yīng)，減輕炎癥反應(yīng)。三百棒還可通過PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞自噬并抑制炎癥反應(yīng)［15］。目前關(guān)于三百棒抗關(guān)節(jié)炎的機(jī)制研究并不完整，因此本研究通過RA 體外炎癥模型探討TAAE對(duì)RAW264.7細(xì)胞極化、炎癥反應(yīng)及TLR4/NFκB信號(hào)通路的影響，旨在闡明TAAE 治療RA 的可能機(jī)制，為臨床治療RA提供理論依據(jù)，同時(shí)也為土家族藥物三百棒的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞株

小鼠單核-巨噬細(xì)胞系RAW264.7（貨號(hào)：CL-0190）購自武漢普諾塞生命科技有限公司。

2 主要試劑

無水乙醇（武漢市中天化工有限公司，批號(hào)：20220228）；甲醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20220112）；結(jié)晶紫染液（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：G1062）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒（新貝生物公司，批號(hào)分別為F2997 和F2967）；胎牛血清（上海逍鵬生物科技有限公司，批號(hào)：2110053）；青-鏈霉素溶液（吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，批號(hào)：1712180106）；DMEM 培養(yǎng)液、PBS、PMSF 蛋白酶抑制劑和CCK-8 試劑盒（大連美侖有限公司，批號(hào)分別為MA0212-Jun-08H、MA0016-Apr-09E、101321211021 和MA0218-5）；0.25%胰酶+0.2%EDTA（武漢科瑞生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：2208190517）；RIPA 裂解液（中國碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：P0013B）；BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒和ECL超敏發(fā)光液（武漢科瑞生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為20000311 和2021120617）；SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：071222220721）；Goat Anti-Rabbit IgG，Goat Anti-Mouse IgG，以及TLR4、iNOS、COX-2、NF-κB、p-NFκB、IκBα 和p-IκBα 抗 體（ABclonal，批 號(hào) 分 別 為20000311、20000275、A5258、A3774、A3560、A2547、AP0123、A19714和AP0707）。

3 主要方法

3.1 TAAE 的制備 三百棒采于湖北省恩施州咸豐縣，經(jīng)湖北民族大學(xué)附屬民大醫(yī)院制劑室張國安主任藥師鑒定為飛龍掌血Toddalia asiatica（L.） Lam。藥材標(biāo)本（No.20200809）現(xiàn)保存于湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部。本研究主要使用三百棒的根皮。參照本課題組前期處理方法［6，14］：取100 g 粉碎過后的三百棒根皮，加入5 倍體積的70%乙醇浸泡充分浸泡數(shù)小時(shí)后，85 ℃恒溫加熱，反復(fù)提取5 次，合并藥液并旋蒸濃縮藥液，使終濃度為1 g/mL。將濃縮過后的藥液平鋪分裝至多個(gè)底面平整的容器內(nèi)，并用保鮮膜封口，放入-20 ℃冰箱過夜。然后-80 ℃真空冷凍干燥24 h，裝袋、稱重、標(biāo)記，保存在干燥處防止受潮。

3.2 藥物處理

3.2.1 TAAE溶液的配制 稱取1.5 g TAAE凍干粉放入50 mL 的離心管中，用1× PBS 溶解，定容至15 mL 封口，超聲1 h，在超凈工作臺(tái)中打開，用0.22 μm的微孔濾膜過濾3次，EP管分裝，放入4 ℃冰箱備用。

3.2.2 LPS溶液的配制 無菌環(huán)境下，取10 mL無菌PBS溶解10 mg LPS粉末，配成1 g/L LPS母液，1.5 mL離心管分裝，-20 ℃保存，使用時(shí)稀釋至所需濃度。

3.3 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 RAW264.7 細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素）中培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，每24 h 換一次液，當(dāng)細(xì)胞生長至80%~90%時(shí)，輕輕吹打細(xì)胞，使貼壁細(xì)胞脫落或使用細(xì)胞刮順著一個(gè)方向輕輕將細(xì)胞刮下，按1∶3 的比例進(jìn)行傳代，傳2~3 代之后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分為正常對(duì)照（control）組、LPS（1 mg/L）組和TAAE（0.25、0.5、1 和2 g/L）組；Western blot 和免疫熒光實(shí)驗(yàn)增加TAK-242（TLR4 抑制劑，0.2 mmol/L）組。除對(duì)照組外，其余組均用1 mg/L LPS 刺激以誘導(dǎo)細(xì)胞極化和炎癥。藥物作用24 h后，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.4 CCK-8 法檢測(cè)TAAE 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞活力的影響 用TAAE（0、0.25、0.5、1 和2 g/L）加或不加LPS（1 mg/L）干預(yù)24 h 后，將含有10% CCK-8 試劑（0.5 g/L）的細(xì)胞培養(yǎng)液加入每個(gè)孔中，避光孵育30 min。用酶標(biāo)儀在450 nm 處測(cè)定每個(gè)孔的吸光度（A），再計(jì)算細(xì)胞相對(duì)活力。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。細(xì)胞相對(duì)活力=（A加藥-A空白）/（A0加藥-A空白）。

3.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TAAE對(duì)RAW264.7細(xì)胞遷移和趨化性的影響 按3.3 分組及藥物干預(yù)后，將RAW264.7 細(xì)胞以2×105個(gè)/孔的密度接種到Transwell 上室24 孔板中。細(xì)胞遷移可以由血清驅(qū)動(dòng)，因此將細(xì)胞在無血清DMEM 高糖培養(yǎng)液中培養(yǎng)12 h，以消除血清的影響。為了測(cè)試遷移能力，將補(bǔ)充10%胎牛血清的500 μL DMEM 高葡萄糖培養(yǎng)液添加到Transwell 下室中。為了研究趨化性，將含有1 mg/L LPS 的500 μL 無血清DMEM 高葡萄糖培養(yǎng)液添加到Transwell 下室中。然后，將培養(yǎng)板在37 ℃、5% CO2下培養(yǎng)24 h，棄去腔室中的培養(yǎng)液，用PBS 洗滌2次。將小室用甲醇固定30 min，擦去上室中的細(xì)胞。將腔室風(fēng)干后，在0.1%結(jié)晶紫溶液中染色15 min，隨后將其洗掉。風(fēng)干后，在顯微鏡下觀察腔室。每個(gè)腔室隨機(jī)選擇5個(gè)視野，并以200倍的放大倍率拍攝圖像。計(jì)數(shù)穿過膜的細(xì)胞數(shù)量用于評(píng)估細(xì)胞的遷移和趨化性。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.6 Griess 法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液一氧化氮（nitric oxide， NO）水平 取對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞，以每孔2×105個(gè)的密度接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后，按3.3 分組及藥物干預(yù)24 h 后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照NO試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。

3.7 ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎癥因子水平RAW264.7 細(xì)胞分組同3.3，藥物干預(yù)24 h 后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用TNF-α、IL-1β 和IL-10 ELISA 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞因子含量。設(shè)置7 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品，將不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品和實(shí)驗(yàn)樣本每孔100 μL 加入到96 孔板中，37 ℃孵育60 min，洗滌5 次，每次震蕩或靜置40 s。每孔加入100 μL抗體工作液，37 ℃孵育30 min，洗滌5 次。每孔再加入100 μL 酶結(jié)合物工作液，37 ℃孵育30 min，洗滌5 次。最后每孔加入100 μL 顯色底物工作液，37 ℃孵育15 min 后加入100 μL 終止液混勻。使用酶標(biāo)儀測(cè)量A值，通過樣本的A值計(jì)算炎癥因子濃度。

3.8 熒光染色雙標(biāo)法檢測(cè)細(xì)胞極化狀態(tài) 收集對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，按照8×107L-1密度將細(xì)胞接種到6 孔板中，每孔2 mL。6 孔板底放入細(xì)胞爬片；貼壁后，按3.3 分組及藥物干預(yù)24 h 后加入2 mL 4%多聚甲醛，室溫固定30 min；100 μL 破膜工作液破膜20 min；3%牛血清白蛋白封閉30 min；滴加Ⅰ抗（大鼠抗小鼠CD68 抗體和兔抗小鼠CD163 抗體），濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜；滴加Ⅱ抗室溫孵育50 min；DAPI復(fù)染細(xì)胞核；抗熒光淬滅封片劑封片，鏡檢拍照。結(jié)果判讀：CD68+呈紅色熒光，CD163+呈綠色熒光，用ImageJ 軟件進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算CD163+/CD68+RAW264.7 細(xì)胞所占比例以反映RAW264.7細(xì)胞極化情況。

3.9 免疫熒光檢測(cè)NF-κB 核移位 細(xì)胞處理同熒光染色雙標(biāo)法。3%牛血清白蛋白封閉30 min后滴加兔抗小鼠NF-κB 抗體，濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜；滴加Ⅱ抗室溫孵育50 min；DAPI復(fù)染細(xì)胞核；抗熒光淬滅封片劑封片，鏡檢拍照。用ImageJ軟件進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

3.10 Western blot 檢測(cè)相關(guān)因子表達(dá) 按3.3 進(jìn)行分組與藥物干預(yù)后，離心收集細(xì)胞；加入RIPA 細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min 后，離心收集上清，提取細(xì)胞蛋白，BCA 法測(cè)定總蛋白濃度。各孔取相應(yīng)的蛋白上樣，于12%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離（濃縮膠電壓70 V，30 min；分離膠電壓110 V，60 min）。將分離后的蛋白電轉(zhuǎn)移（280 mA，90 min）至PVDF 膜。加入封閉液于搖床上室溫封閉2 h；TBST洗膜3 次，每次5 min；分別加入Ⅰ抗（均1∶1 000 稀釋），4 ℃反應(yīng)過夜；次日先以TBST 洗膜3 次，每次10 min；后加入HRP 標(biāo)記的Ⅱ抗（1∶20 000 稀釋），室溫反應(yīng)2 h；再用TBST 洗膜3 次，每次10 min。按ECL試劑盒說明進(jìn)行曝光顯影。采用ImageJ 軟件對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析。

3.11 RT-qPCR 檢測(cè)相關(guān)因子的mRNA 水平 取出-80 ℃冰箱中保存的含有Trizol 的新鮮冰凍滑膜組織，自然溶解，用Roche 勻漿儀研磨成漿，移至無RNase 的1.5 mL EP 管中，充分裂解，根據(jù)RNA 提取試劑盒的步驟，提取總RNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 選用10 μL 反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。繪制熔解曲線，最終數(shù)據(jù)以2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD法）。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 TAAE或TAAE+LPS對(duì)細(xì)胞活力的影響

用TAAE 或TAAE+LPS（1 mg/L）干預(yù)RAW264.7細(xì)胞24 h，TAAE 在2 g/L 濃度以下對(duì)細(xì)胞不存在毒性作用，而1 mg/L LPS 干預(yù)24 h 對(duì)細(xì)胞活力無明顯影響，見圖1。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)［15-16］，選取0.25、0.5 和1 g/L TAAE及1 mg/L LPS用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Figure 1.Effects of Toddalia asiatica alcohol extract （TAAE） and lipopolysaccharide （LPS） on the viability of RAW264.7 cells.A：the cells were treated with different concentrations （0.25， 0.5， 1 and 2 g/L） of TAAE for 24 h， and the cell viability was detected by CCK-8 assay； B： the cells were treated with TAAE （0.25， 0.5， 1 and 2 g/L） and LPS （1 mg/L） for 24 h， and the cell viability was detected by CCK-8 assay.Mean±SD.n=6.*P<0.05， **P<0.01 vs control group（without TAAE or LPS treatment）.圖1 三百棒醇提物和脂多糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響

2 TAAE對(duì)RAW264.7細(xì)胞形態(tài)的影響

如圖2 所示，control 組RAW264.7 細(xì)胞為圓形；LPS 處理誘導(dǎo)細(xì)胞分化，細(xì)胞長出觸角變?yōu)榧忓N形；與LPS 組相比，TAAE 干預(yù)抑制了細(xì)胞形態(tài)的變化，高劑量（1 g/L）TAAE組更明顯。

Figure 2.Effect of Toddalia asiatica alcohol extract （TAAE） on the morphological changes of RAW264.7 cells induced by lipopolysaccharide （LPS） was observed by microscopy （×200）.圖2 三百棒醇提物對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞形態(tài)的影響

3 TAAE對(duì)RAW264.7細(xì)胞遷移和趨化性的影響

為研究TAAE 如何影響胎牛血清或LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞的遷移和趨化性，進(jìn)行了Transwell實(shí)驗(yàn)。如圖3A 所示，血清誘導(dǎo)的細(xì)胞成功跨膜（遷移），但0.5 和1 g/L 的TAAE 顯著減少跨膜細(xì)胞數(shù)量，分別為control組的33%和50%（P<0.01）。同樣，LPS 誘導(dǎo)的細(xì)胞成功跨膜（趨化性），但0.5 和1 g/L的TAAE顯著減少跨膜細(xì)胞數(shù)量，分別為control組的30%和48%（P<0.01），見圖3B。

Figure 3.Toddalia asiatica alcohol extract （TAAE） inhibited migration （A） and chemotaxis （B） of RAW264.7 cells treated with fetal bovine serum or lipopolysaccharide（LPS）.The scale bar=100 μm. Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control group （without TAAE or LPS treatment）.圖3 三百棒醇提物抑制胎牛血清或脂多糖處理的RAW264.7細(xì)胞遷移和趨化

4 TAAE 對(duì)LPS 干預(yù)后RAW264.7 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-6和NO含量的影響

如圖4 所示，與control 組相比，LPS 組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β 和NO 含量顯著升高，IL-10 含量顯著降低（P<0.01）；與LPS 組相比，各劑量TAAE 均可顯著降低上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β和NO含量，升高IL-10含量（P<0.05）。

Figure 4.Effects of Toddalia asiatica alcohol extract （TAAE） on the levels of inflammatory cytokines and nitric oxide（NO） in culture supernatants RAW264.7 cells induced by lipopolysaccharide （LPS）.A： IL-10； B： IL-1β； C： IL-6； D： TNF-α； E：NO.Mean±SD.n=6.**P<0.01 vs control group； #P<0.05， ##P<0.01 vs LPS group.圖4 三百棒醇提物對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎癥因子及NO含量的影響

5 TAAE 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞CD163+/CD68+比值的影響

采用免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)，CD163+為紅色熒光，CD68+為綠色熒光。與control組比較，LPS 組CD163+/CD68+比值降低（P<0.01）；與LPS 組比較，TAAE 組和TAK-24（TLR4 抑制劑）組CD163+/CD68+比值升高，見圖5。這表明LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞以M1型極化為主，TAAE可以降低M1型巨噬細(xì)胞極化的比例，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2 型極化，且與TAK-242效果相當(dāng)。

Figure 5.Effect of Toddalia asiatica alcohol extract （TAAE） on the phenotype transformation of RAW264.7 macrophages induced by lipopolysaccharide （LPS） was detected by fluorescence staining with double labeling （scale bar=50 μm）.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control group； ##P<0.01 vs LPS group.圖5 熒光染色雙標(biāo)檢測(cè)三百棒醇提物對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的影響

6 TAAE 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞NF-κB 活化的影響

與control組比較，LPS顯著誘導(dǎo)NF-κB從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的易位；與LPS 組比較，TAAE 組和TAK-24組NF-κB 的核轉(zhuǎn)移明顯受到抑制，見圖6。這表明TAAE 可以抑制LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞NF-κB核易位，且與TAK-242效果相當(dāng)。

7 TAAE 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞炎癥相關(guān)蛋白及TLR4/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與control 組比較，LPS 組細(xì)胞中iNOS、COX-2、p-NF-κB、TLR4 和p-IκBα 蛋白水平顯著升高，IκBα 蛋白表達(dá)顯著減少（P<0.01）；與LPS 組相比，各劑量TAAE 和TAK-24 均能降低LPS 誘導(dǎo)的iNOS、COX-2、p-NF-κB、TLR4 和p-IκBα 蛋白水平，升高IκBα（P<0.05），而總NF-κB 無變化，見圖7。這表明TAAE 能抑制炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)，抑制IκBα 蛋白的磷酸化降解，從而抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路的活化。

8 TAAE 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、Arg-1、NF-κB 和TLR4 mRNA水平的影響

與control 組比較，LPS 組中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6，以及NF-κB、TLR4 的mRNA 水平顯著升高，抑炎因子IL-10 和Arg-1 的mRNA 水平顯著降低（P<0.01）；與LPS 組相比，各劑量TAAE 均能降低LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-6、NF-κB和TLR4 的mRNA 水平，升高IL-10 和Arg-1 的mRNA 水平（P<0.05或P<0.01），見圖8。

Figure 8.Effects of Toddalia asiatica alcohol extract （TAAE） on the mRNA levels of TNF-α， IL-1β， IL-6， IL-10， Arg-1， NF-κB and TLR4 in RAW264.7 cells induced by lipopolysaccharide （LPS） were determined by RT-qPCR.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control group； #P<0.05， ##P<0.01 vs LPS group.圖8 RT-qPCR 檢測(cè)三百棒醇提物對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、Arg-1、NF-κB 和TLR4 mRNA水平的影響

討 論

RA 是一種以滑膜增生和關(guān)節(jié)組織進(jìn)行性破壞為特征的慢性疾病，其病理學(xué)變化主要涉及促炎細(xì)胞因子釋放，滑膜中持續(xù)炎癥細(xì)胞浸潤和軟骨中活化的巨噬細(xì)胞侵蝕［17］。RA 的起始原因尚未完全明了，但已證實(shí)巨噬細(xì)胞在RA 疾病過程中起關(guān)鍵作用，它們能夠協(xié)調(diào)免疫反應(yīng)，釋放參與炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的細(xì)胞因子和酶，進(jìn)而激活破骨細(xì)胞和成纖維滑膜細(xì)胞，導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞和疾病延續(xù)［18］。RAW264.7 細(xì)胞被認(rèn)為是晚期分化階段的破骨前身細(xì)胞，因此較適合用于以炎癥和骨吸收為主的如RA 等關(guān)節(jié)疾病研究。在RA 炎癥刺激下它可以極化為促炎M1 表型，釋放大量促炎因子如TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8等。因此，在RA 發(fā)作期間靶向巨噬細(xì)胞極化，將促炎M1 型巨噬細(xì)胞逆轉(zhuǎn)為抗炎M2 表型，可能成為一種有效的治療方法［19］。LPS 是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的一種重要組成成分，能夠誘導(dǎo)機(jī)體的免疫反應(yīng)，是巨噬細(xì)胞強(qiáng)有力的活化劑［20］。LPS的刺激可誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞，M1 激活的生物標(biāo)志物包括TNF-α、IL-6、IL-1β、COX-2、NO、iNOS、CD68 等，炎癥因子的上調(diào)形成強(qiáng)烈的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)滑膜增生并增強(qiáng)RA 的組織病理學(xué)變化，從而導(dǎo)致RA 中的滑膜炎癥和關(guān)節(jié)破壞［21］。研究發(fā)現(xiàn)在RA 炎癥滑膜和血管翳處存在大量活化巨噬細(xì)胞，而活化的巨噬細(xì)胞高表達(dá)促炎因子、趨化因子、生長因子和基質(zhì)金屬蛋白酶等多種效應(yīng)分子，參與炎癥的啟動(dòng)和維持，具有廣泛的促炎作用和組織破壞能力。因此調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化平衡是RA治療的潛在策略［22］。

本研究通過免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)巨噬細(xì)胞極化，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞經(jīng)LPS 誘導(dǎo)后，與control 組相比可促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1 表型標(biāo)志物iNOS 和CD68 的表達(dá)，抑制M2 表型標(biāo)志物清道夫受體（CD163）的表達(dá)，使CD163+/CD68+比值降低，說明LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞以M1 型極化為主。然而，TAAE 治療使CD163+/CD68+比值升高，降低M1 型巨噬細(xì)胞極化的比例，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2 型極化，且效果與TAK-242 效果相當(dāng)。經(jīng)LPS 誘導(dǎo)后巨噬細(xì)胞釋放的炎癥因子IL-6、TNF-α和IL-1β 含量明顯增多，抑炎因子IL-10和Arg-1含量減少，上清液中NO 含量升高，細(xì)胞由正常的圓形變?yōu)榧忓N形；在給予TAAE 干預(yù)后，促炎細(xì)胞因子含量均有顯著下降，抑炎細(xì)胞因子含量上升，具有分化形狀的RAW264.7 細(xì)胞數(shù)量減少，同時(shí)TAAE 能抑制RAW264.7 細(xì)胞遷移和趨化，降低LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞iNOS、COX-2、TLR4、p-NF-κB 和p-IκBα 蛋白水平，降低TNF-α、IL-1β、IL-6、NF-κB 和TLR4 mRNA 水平，升高IL-10 和Arg-1 mRNA 水平。這提示TAAE 對(duì)炎癥損傷具有一定的治療作用，可能是通過抑制RAW264.7 遷移和趨化，使其向抗炎M2型分化，從而發(fā)揮抗炎作用。

三百棒是土家族常用的一種天然抗炎藥物，湖北民族大學(xué)附屬民大醫(yī)院以其為主要藥物研制的土家抗風(fēng)濕復(fù)方三百棒藥酒和金邊祛風(fēng)飲臨床用于治療類風(fēng)濕十余年，療效確切。本課題組前期研究表明，三百棒醇提物通過TLR4/NF-κB 信號(hào)通路降低炎癥反應(yīng)，對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠有明顯的改善作用［6］，還可通過抑制TLR4/NF-κB 信號(hào)通路中相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，抑制滑膜細(xì)胞的增殖［14］。

目前，許多調(diào)節(jié)機(jī)制參與了RA 的發(fā)病機(jī)制，其中包括TLR4/NF-κB“細(xì)胞炎癥”途徑。已有研究表明TLR4/NF-κB 通路在炎癥調(diào)節(jié)方面有重要作用［23］，TLR4/NF-κB 信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)已被提出作為治療免疫介導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎的潛在療法，TLR4/NF-κB 還參與M2 型巨噬細(xì)胞極化，其在限制LPS 刺激的巨噬細(xì)胞中的炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用［24］。NF-κB 由5 種重要蛋白質(zhì)形成，它們通過與其抑制蛋白IκB 結(jié)合，作為無活性的異二聚體復(fù)合物存在于細(xì)胞質(zhì)中。P65是NF-κB 調(diào)節(jié)和功能最具代表性的蛋白質(zhì)。在被各種炎癥刺激（如LPS）激活后，IκB 激酶的激活會(huì)引發(fā)IκBα 的磷酸化和降解。NF-κB 磷酸化之后使NF-κB發(fā)生核易位，進(jìn)入細(xì)胞核與DNA 結(jié)合并激活促炎基因的表達(dá)，包括細(xì)胞因子、粘附分子和誘導(dǎo)性酶（如iNOS和COX-2）［25］。本研究證實(shí)了TLR4/NF-κB途徑在RAW264.7 細(xì)胞炎癥與極化中的關(guān)鍵作用，活化的RAW264.7 細(xì)胞中的細(xì)胞因子導(dǎo)致TLR4/NF-κB途徑的激活，促炎M1 細(xì)胞增多。TAAE 可抑制NFκB 的核易位抑制TLR4/NF-κB 途徑的激活，使M1 型細(xì)胞向M2 型轉(zhuǎn)化。另外，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用抑制劑TAK-242阻斷TLR4/NF-κB信號(hào)通路導(dǎo)致細(xì)胞炎癥因子及炎癥相關(guān)蛋白含量減少，且TAAE 治療效果與其相當(dāng)。因此，這也表明TLR4/NF-κB 信號(hào)通路參與了炎癥與細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)。目前，通過基因干預(yù)方法敲除或小分子藥物（TLR4 抑制劑TAK-242）抑制TLR4/NF-κB 通路，阻斷其對(duì)下游多種效應(yīng)分子的活化已經(jīng)成為RA 治療研究的新靶點(diǎn)［26］。本研究中，TAAE通過抑制巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)并抑制其遷移和趨化，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化平衡，其作用機(jī)制可能與抑制TLR4/NF-κB 信號(hào)通路有關(guān)。同時(shí)，本研究為開發(fā)三百棒治療RA提供了進(jìn)一步的證據(jù)。