蒙藥額爾敦-烏日勒對(duì)大鼠的急性毒性初探*

王青亮，高 娃，宋福順，包錫林其其格，包斯琴，都格爾，烏漢其木格，△

（1. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古呼和浩特 010010； 2. 內(nèi)蒙古自治區(qū)中蒙醫(yī)藥研究院，內(nèi)蒙古呼和浩特010017； 3. 內(nèi)蒙古自治區(qū)國(guó)際蒙醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010065）

蒙藥額爾敦-烏日勒收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·蒙藥分冊(cè)》，又稱(chēng)珍寶丸或如意珍寶丸［1］，有清陳熱、安神、舒筋活絡(luò)及除“協(xié)日烏素”（炎癥）功效［2］，可用于治療血管系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、高血壓等［3-5］。對(duì)缺血性腦卒中恢復(fù)期、腦梗死、腦出血療效較好［6-8］，能改善血液微循環(huán)及流變學(xué)指標(biāo)，降低血液黏稠度，增加腦供血，解除血管痙攣，提高日常生活活動(dòng)能力［9-11］，并有抗氧化、調(diào)血脂、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、促進(jìn)血管擴(kuò)張等作用，可預(yù)防血栓和動(dòng)脈粥樣硬化的形成。其結(jié)合蒙醫(yī)拔罐放血療法、針灸治療法治療慢性頸椎病、糖尿病末梢神經(jīng)炎、糖尿病性周?chē)窠?jīng)病變、糖尿病性心腦血管病變等也有一定療效［10-15］，能較好改善帕金森病、甲狀腺多發(fā)性結(jié)節(jié)瘤、銀屑病、精神分裂癥等的癥狀［16-20］，對(duì)膝關(guān)節(jié)骨質(zhì)增生［21］、踝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎療效顯著［22］，還可減輕紫杉醇、長(zhǎng)春新堿所致神經(jīng)毒性［23-24］。但尚缺乏該藥毒性的實(shí)驗(yàn)研究，不僅影響其使用，其安全性判定也缺乏依據(jù)。鑒于此，本研究中采用固定劑量法進(jìn)行了額爾敦-烏日勒對(duì)大鼠的急性毒性試驗(yàn)，為其毒性和安全性評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動(dòng)物

儀器：Y - TVSS 型生物顯微鏡（日本Nikon 公司）；BK - 200 型生化分析儀（山東博科生物科技有限公司）；SC-3614型低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；TP1020型脫水儀、EG1150H+C 型石蠟組織包埋機(jī)、RM2245型切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；ECLIPSE Ci型正置顯微鏡（日本Nikon 公司）；902GP - ULTS 型-80 ℃冰箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）。

試藥：額爾敦- 烏日勒藥材（內(nèi)蒙古國(guó)際蒙醫(yī)醫(yī)院，批號(hào)為20190828），蘇木素-伊紅（HE）染料、4%多聚甲醛、中性樹(shù)脂（批號(hào)分別為G1121，P1110，G8590）；水為超純水。尿素（UREA，批號(hào)為10819024H），肌酐（CREA，批號(hào)為10728027W），白蛋白（Alb，批號(hào)為10729013H），葡萄糖（Glu，批號(hào)為10723029H），總膽紅素（TBiL，批號(hào)為10708014H），堿性磷酸酶（ALP，批號(hào)為10629008H），天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST，批號(hào)為10809010H），丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT，批號(hào)為10719011H），均購(gòu)自山東博科生物科技有限公司。

動(dòng)物：SPF 級(jí)SD 大鼠32 只（雌雄各半，7～8 周齡，體質(zhì)量180～220 g），均由斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK ＜京＞2019-0010。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)內(nèi)蒙古國(guó)際蒙醫(yī)醫(yī)院機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理與使用委員會(huì)（IACUC）批準(zhǔn)（批件號(hào)：倫理第2021-10號(hào)）。適應(yīng)性飼養(yǎng)（溫度25 ℃，相對(duì)濕度60%，光/ 暗循環(huán)12 h）7 d。

1.2 分組及給藥

將32只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（等體積純凈水）及額爾敦-烏日勒低、中、高劑量組（0.54，2.16，5.40 g/kg，簡(jiǎn)稱(chēng)低、中、高劑量組），各8 只，首次給藥前禁食12 h，不禁飲，按每100 g 體質(zhì)量給藥1 mL，分別灌胃相應(yīng)藥物［取藥材適量，研磨成超細(xì)粉，用水配成質(zhì)量濃度為0.54 g/mL的藥液（現(xiàn)配現(xiàn)用）］或水。

1.3 觀察指標(biāo)

一般情況、行為與體質(zhì)量：觀察大鼠皮膚、皮毛、眼睛、黏膜和行為方式的變化。并于給藥前及給藥第0，1，4，7，11，14天測(cè)定并記錄大鼠體質(zhì)量，計(jì)算給藥第7，14天與給藥前的體質(zhì)量變化率；監(jiān)測(cè)并記錄大鼠每天的食物和水?dāng)z入量。

血液學(xué)及血生化指標(biāo)：末次給藥后，采集各組雄性大鼠腹主動(dòng)脈血（5 mL），置采血管中，室溫放置60 min，4 ℃下3 500 r/min離心30 min，分離，得血清。檢測(cè)白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)（LYM）、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)（MON）、粒細(xì)胞計(jì)數(shù)（GRA）、血紅蛋白（Hb）、UREA、CREA、Alb、TBiL、ALP、ALT、AST水平。

主要器官：大鼠采血后，處死，分離主要器官心、肝、脾、肺、腎，觀察顏色、形態(tài)，然后清除脂肪，紙巾擦拭后稱(chēng)定質(zhì)量，計(jì)算各器官的相對(duì)質(zhì)量（相對(duì)于體質(zhì)量）。將各器官組織用4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)梯度脫水，56 ℃下石蠟包埋，切片（5 μm）。用中性膠封閉切片行HE染色，顯微鏡下觀察組織形態(tài)變化情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)量資料以±s表示，行t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況與行為

給藥后，部分大鼠有行動(dòng)遲緩、毛發(fā)豎立等表現(xiàn)，但可自行恢復(fù)，且此后均未見(jiàn)不良反應(yīng)；皮膚、皮毛、眼、鼻及行為方式無(wú)異常；未見(jiàn)顫抖、流涎、腹瀉和昏迷。

給藥第7天，與對(duì)照組比較，低、中劑量組大鼠飲水量明顯增加（P＜0.05）。給藥第14 天，低、中、高劑量組大鼠的飲水量分別為（72.20±9.90）g、（79.40±8.60）g、（62.30±4.50）g，均明顯高于對(duì)照組的（56.30±2.50）g（P＜0.05）；且中劑量組大鼠第2 周進(jìn)食量為（32.80 ±1.80）g，明顯高于對(duì)照組的（30.90±0.80）g（P＜0.05）。

2.2 體質(zhì)量

給藥前后，不同劑量組雄性與雌性大鼠體質(zhì)量均保持自然增長(zhǎng)，與對(duì)照組大鼠無(wú)顯著差異（P＞0.05）。詳見(jiàn)圖1。用藥第7，14 天，低劑量組雄性大鼠體質(zhì)量變化率明顯低于對(duì)照組雄性大鼠（P＜0.05），中劑量組雌性大鼠體質(zhì)量變化率明顯高于對(duì)照組雌性大鼠（P＜0.01），詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠給藥第7，14天體質(zhì)量變化率比較（±s，n=4）Tab.1 Comparison of body mass change rate on the 7th and 14th days after administration in each group（±s，n=4）

表1 各組大鼠給藥第7，14天體質(zhì)量變化率比較（±s，n=4）Tab.1 Comparison of body mass change rate on the 7th and 14th days after administration in each group（±s，n=4）

注：與對(duì)照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。表2至表4同。Note：Compared with those in the control group，*P ＜0.05，**P ＜0.01（for Tab.1 - 4）.

組別對(duì)照組用藥第14天38.60±4.60 13.10±1.30 13.20±6.50*15.00±3.60 26.70±8.60 31.60±12.60**33.30±9.80 13.50±2.60低劑量組中劑量組高劑量組性別雄性雌性雄性雌性雄性雌性雄性雌性禁食前體質(zhì)量（g）272.50±22.10 240.30±2.10 240.90±17.10 240.10±7.00 257.00±15.70 247.70±20.50 277.50±12.50 234.70±7.60體質(zhì)量變化率（%）用藥第7天26.60±3.90 9.40±0.30 8.10±4.40*9.20±1.90 20.80±3.50 19.80±6.30**21.00±4.20 8.50±2.50

A. 雄性 B. 雌性圖1 各組大鼠體質(zhì)量變化A.Male rats B.Female ratsFig.1 Changes of body mass in each group

可見(jiàn)，額爾敦- 烏日勒可減緩雄性大鼠及加快雌性大鼠體質(zhì)量增加速度。各組雌雄大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)速度有一定差異，考慮與大鼠數(shù)量較少及其個(gè)體之間的自然差異有關(guān)。但整體趨勢(shì)為各組大鼠體質(zhì)量均保持自然增長(zhǎng)，且雌雄大鼠體質(zhì)量合并分析時(shí)無(wú)明顯差異。

2.3 主要器官

各組大鼠心、肺、肝、脾、腎等主要臟器的顏色和形態(tài)均無(wú)明顯差異。與對(duì)照組比較，中、高劑量組雄性大鼠腎臟相對(duì)質(zhì)量及高劑量組雌性大鼠脾臟相對(duì)質(zhì)量明顯降低（P＜0.05），詳見(jiàn)表2。中、高劑量組大鼠脾臟、腎臟相對(duì)質(zhì)量降低，可能與體質(zhì)量增長(zhǎng)差異有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步研究，且額爾敦-烏日勒用藥量≥2.16 g/kg時(shí)對(duì)脾臟、腎臟等器官的副作用也不能排除。

表2 各組大鼠器官相對(duì)質(zhì)量比較（±s）Tab.2 Comparison of relative mass of organs in each group（±s）

表2 各組大鼠器官相對(duì)質(zhì)量比較（±s）Tab.2 Comparison of relative mass of organs in each group（±s）

臟器相對(duì)質(zhì)量組別性別對(duì)照組低劑量組中劑量組高劑量組雄性雌性雄性雌性雄性雌性雄性雌性第14天體質(zhì)量（g）377.10±23.80 271.90±5.50 273.60±36.0 276.40±14.50 326.50±43.00 327.20±52.00 369.90±29.90 266.40±14.10心臟0.39±0.05 0.40±0.07 0.43±0.07 0.40±0.08 0.40±0.07 0.40±0.07 0.40±0.07 0.50±0.07肝臟3.00±0.40 3.30±0.20 3.50±0.30 3.40±0.30 2.90±0.30 3.30±0.30 3.00±0.09 3.10±0.20脾臟0.26±0.04 0.30±0.04 0.30±0.02 0.25±0.01 0.30±0.01 0.30±0.06 0.30±0.04 0.20±0.01*肺臟0.53±0.05 0.57±0.06 0.60±0.07 0.60±0.01 0.60±0.06 0.50±0.07 0.50±0.04 0.60±0.06腎臟0.89±0.08 0.76±0.05 0.76±0.10 0.70±0.07 0.70±0.10*0.70±0.10 0.70±0.01*0.70±0.07

各組大鼠心臟心肌纖維正常；肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)和雙核正常，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝帶結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞排列緊密，邊界清晰，胞漿豐富，無(wú)明顯損傷、充血、脂肪酸積累和炎性反應(yīng)；肺支氣管上皮細(xì)胞正常，脾臟結(jié)構(gòu)正常；腎組織均未見(jiàn)形態(tài)學(xué)改變，組間腎小球外觀相似，腎小球及遠(yuǎn)端、近端腎小管正常，無(wú)間質(zhì)充血、腎小管萎縮，核仁清晰可見(jiàn)，無(wú)變性、出血、壞死?？梢?jiàn)，額爾敦-烏日勒對(duì)各主要器官組織形態(tài)學(xué)無(wú)明顯影響。病理學(xué)顯微圖見(jiàn)圖2。

圖2 大鼠主要器官組織病理形態(tài)（HE，×100）Fig.2 Histopathological morphology of major organs in rats（HE，×100）

2.4 血常規(guī)指標(biāo)

結(jié)果見(jiàn)表3。與對(duì)照組雄性大鼠比較，中、高劑量組雄性大鼠的GRA明顯增多（P＜0.05）。但參考文獻(xiàn)報(bào)道的正常范圍［24］，本實(shí)驗(yàn)中大鼠WBC，MON，GRA 均偏低。因此，GRA水平組間差異無(wú)生物學(xué)意義。

表3 各組雄性大鼠血常規(guī)指標(biāo)比較（±s，n=4）Tab.3 Comparison of blood routine indicators of male rats in each group（±s，n=4）

表3 各組雄性大鼠血常規(guī)指標(biāo)比較（±s，n=4）Tab.3 Comparison of blood routine indicators of male rats in each group（±s，n=4）

血常規(guī)指標(biāo)WBC（×109/L）MON（×109/L）GRA（×109/L）Hb（g/L）LYM（%）對(duì)照組0.86±0.20 0.07±0.03 0.20±0.06 152.10±1.19 67.20±2.15低劑量組1.26±0.68 0.10±0.08 0.34±0.15 149.40±16.60 62.27±5.05中劑量組5.70±6.80 0.58±0.75 0.82±0.59*159.10±8.90 70.07±8.91高劑量組0.83±0.12 0.06±0.015 0.32±0.03*155.50±3.40 52.83±3.140

2.5 血生化指標(biāo)

與對(duì)照組雄性大鼠比較，中、高劑量組雄性大鼠Alb 水平明顯降低（P＜0.05），詳見(jiàn)表4。但仍在正常范圍［25］，故該差異無(wú)生物學(xué)意義。

表4 各組雄性大鼠血生化指標(biāo)比較（±s，n=4）Tab.4 Comparison of blood biochemical indicators of male rats in each group（±s，n=4）

表4 各組雄性大鼠血生化指標(biāo)比較（±s，n=4）Tab.4 Comparison of blood biochemical indicators of male rats in each group（±s，n=4）

血生化指標(biāo)Alb（g/L）ALP（U/L）ALT（U/L）AST（U/L）TBiL（μmol/L）UREA（mmol/L）CREA（μmol/L）對(duì)照組39.20±2.70 281.60±67.20 52.70±24.90 303.60±225.00 3.60±0.74 10.30±2.80 30.50±10.30低劑量組36.80±4.10 238.60±79.30 57.30±8.40 499.80±121.70 4.20±0.96 11.79±1.40 25.00±3.03中劑量組32.20±2.70*233.70±20.20 29.60±3.80 159.90±27.20 3.10±1.30 10.20±0.47 25.70±7.10高劑量組32.90±0.90*234.30±28.50 40.60±15.70 320.90±252.20 3.50±2.70 10.10±0.84 26.40±1.78

3 討論

額爾敦-烏日勒是治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的理想藥物，是蒙醫(yī)治療黑脈?。ㄏ喈?dāng)于西醫(yī)的心腦血管系統(tǒng)疾?。┖桶酌}?。ㄏ喈?dāng)于西醫(yī)的神經(jīng)系統(tǒng)疾?。┑闹饕幬铩＝陙?lái)的研究再次證明額爾敦-烏日勒對(duì)腦梗死的療效［26-27］。該藥作用機(jī)制之一是可通過(guò)介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的基因表達(dá)，抑制大腦的炎癥，從而改善腦卒中的恢復(fù)質(zhì)量［28-30］。但由于其所含多種的活性化合物可能同時(shí)作用于更多靶點(diǎn)，實(shí)際作用機(jī)制可能更復(fù)雜。由于各研究中額爾敦-烏日勒用藥劑量各不相同，為進(jìn)一步分析其作用機(jī)制，首先需確定其安全劑量，故有必要研究該藥的毒性。

本研究中分3種劑量單次給藥，觀察對(duì)大鼠的急性毒性。發(fā)現(xiàn)大鼠對(duì)額爾敦-烏日勒一次性耐受量為5.40 g/kg。至于對(duì)更高劑量能否耐受，有待下一步研究。部分大鼠給藥后出現(xiàn)行動(dòng)遲緩、毛發(fā)豎立等表現(xiàn)，但未死亡。組間部分大鼠進(jìn)食量、飲水量、體質(zhì)量增幅、GRA、WBC、脾腎相對(duì)質(zhì)量有明顯差異（但相關(guān)數(shù)值仍在正常范圍內(nèi)），可能存在一定的副作用。組織病理學(xué)分析顯示，額爾敦-烏日勒劑量≤5.40 g/kg時(shí)對(duì)主要器官無(wú)明顯毒性，也不會(huì)導(dǎo)致死亡，但其安全性和毒性有待進(jìn)一步研究。

某種藥物用量達(dá)臨床常規(guī)用量100倍時(shí)如大鼠仍未死亡則視為該藥對(duì)人安全。本研究中，遵循《化學(xué)藥物急性毒性試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》（給藥劑量可根據(jù)實(shí)際情況和文獻(xiàn)來(lái)定），并結(jié)合文獻(xiàn)［31-32］，采取了成人臨床常規(guī)劑量的1，4，10倍分別作為低、中、高劑量，結(jié)果3組大鼠均未死亡。嘗試更高劑量54 g/kg（即臨床用量的100倍）時(shí)，由于是單藥材粉碎混合制成的藥物，配藥時(shí)無(wú)法全部溶解，未進(jìn)行后續(xù)操作。但本研究的數(shù)據(jù)仍可為進(jìn)一步研究該藥的臨床用藥安全性提供參考。此外，為明確該藥的安全劑量，還需進(jìn)一步進(jìn)行亞急性毒性試驗(yàn)。