帝王大麗花初始外植體褐變影響因素及控制措施研究

韓勝男,王 璐,張映嬋,梁 娟,牛善策,3,郝麗紅,向地英,鄭志興,陳段芬

(1.河北農(nóng)業(yè)大學 園藝學院,河北保定 071001;2.石家莊市植物園,石家莊 050073;3.河北農(nóng)業(yè)大學 華北作物改良與調(diào)控國家重點實驗室,河北保定 071001;4.張家口市農(nóng)業(yè)科學院,河北張家口 075000)

帝王大麗花(Dahliaimperialis),又名樹狀大麗花,是菊科大麗花屬多年生大型草本或半灌木植物,原產(chǎn)于墨西哥南部至哥倫比亞之間海拔1500～1700m的山地,是近年來新引入國內(nèi)的珍稀大麗花種類。帝王大麗花株高可達5～6m,是大麗花屬中最高大的種類;其地下部分為大型棒狀塊根;莖具四棱;節(jié)膨大;2～3回大型奇數(shù)羽狀復(fù)葉對生[1];在晚秋至初冬季節(jié)開花,大量頭狀花序自莖端及葉腋伸出,花序直徑可達7.5～15cm,舌狀花顏色為淡紫色或粉紫色,管狀花顏色為橙黃色。因此,帝王大麗花因其株型高大、花繁葉茂成為園林綠化不可多得的優(yōu)良材料。

帝王大麗花目前通過扦插和分根繁殖,但其球根萌芽率低、分枝數(shù)量少、扦插生根慢,所以繁殖系數(shù)較低,難以滿足市場需求。并且隨著扦插、分根等繁殖代數(shù)的增加,品種退化問題也會逐漸顯現(xiàn)[2]。針對上述問題,利用帝王大麗花各類器官或組織作為外植體,建立高效離體組培快繁體系,不僅能夠加快帝王大麗花的繁殖速度,還能規(guī)?；a(chǎn)優(yōu)質(zhì)種苗,同時也為帝王大麗花種質(zhì)資源的離體保存提供技術(shù)支持。但是,在切取帝王大麗花莖段外植體時,切口處存在極其快速的褐變現(xiàn)象,即使在取材后快速地浸入水中,在之后的消毒過程中或外植體接種到培養(yǎng)基后仍然會出現(xiàn)嚴重的褐變問題,導致后續(xù)組培試驗不能正常進行。目前大麗花屬植物在組培快繁方面圍繞愈傷組織誘導[3]、不定芽再生[4]、試管苗生根[5]、莖尖脫毒[6]等做了大量研究,但鮮見有外植體褐變問題的報道。因此,研究帝王大麗花外植體褐變原因及影響因素,可為帝王大麗花組培快繁提供理論和技術(shù)支持,對推動大麗花產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展具有十分重要的現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2020年12月—2021年10月在河北農(nóng)業(yè)大學西校區(qū)園藝學院進行。供試材料為栽植于河北農(nóng)業(yè)大學東校區(qū)試驗基地的1 a生帝王大麗花枝條,取樣時腋芽處于剛萌發(fā)狀態(tài),挑選的枝條直徑不超過1 cm,其長勢一致、無病蟲害、無機械損傷,取下后立即將基部切口浸入水中。

1.2 試驗方法

外植體切割環(huán)境處理:將消毒處理后的不帶芽莖段放在不同環(huán)境下進行切割,分別記為A:空氣中切割;B:無菌水中切割;C:在1.0%的維生素C溶液中切割。

枝條水插處理:將離體枝條放在18 ℃的培養(yǎng)箱中進行不同時間的水插處理,期間每天定時換水,并及時剪掉枝條基部變色部分,分別記為S1:水插0 d;S2:水插2 d;S3:水插5 d;S4:水插7 d。

水插枝條低溫處理:將水插處理5 d后的枝條放在 4 ℃冰箱進行不同時間的低溫處理,分別記為W1:4 ℃處理0 h;W2:4 ℃處理5 h;W3: 4 ℃處理10 h;W4:4 ℃處理15 h;W5:4 ℃處理20 h;W6:4 ℃處理24 h。

接種后黑暗處理:用黑布將接種后的外植體遮蓋,分別進行不同時間的黑暗處理,分別記為H1:暗培養(yǎng)0 d;H2:暗培養(yǎng)2 d;H3:暗培養(yǎng)7 d;H4:暗培養(yǎng)14 d。

接種后低溫處理:將接種后的外植體放在 4 ℃的光照培養(yǎng)箱中進行不同時間的低溫處理,同時在接種前7 d內(nèi)進行黑暗處理,分別記為Wa:暗+4 ℃處理0 d;Wb:暗+4 ℃處理2 d;Wc:暗+4 ℃處理4 d;Wd:暗+4 ℃處理6 d,外植體在黑暗和溫度處理后轉(zhuǎn)組培室正常培養(yǎng)。

1.3 無菌外植體的獲取與接種

2021年9月1日取樣后,截取第2節(jié)位的帶芽莖段和靠近第2節(jié)位上下部分1～2 cm的不帶芽莖段均剪成3～4 cm的長度,于洗潔精溶液中攪拌清洗10 min后,放在流水下沖洗1 h,材料沖洗干凈后放在超凈工作臺上進行消毒和接種。先采用75%酒精處理30 s,無菌水沖洗2次;再用質(zhì)量分數(shù)為0.1%升汞處理6 min,無菌水沖洗5次,最后將沖洗干凈的外植體浸泡在無菌水中待用。接種時用無菌手術(shù)刀切去切面與消毒劑接觸的部分直至露出新鮮組織,按照形態(tài)學方向豎直接種到培養(yǎng)基中。初代培養(yǎng)時接種的培養(yǎng)基為啟動培養(yǎng)基,培養(yǎng)基配方為:MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂,pH為5.8。培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度(25±2) ℃,光照周期16 h/d,光照度1 500～2 000 lx。每瓶分裝培養(yǎng)基30 mL,接種1個外植體,每個處理接種30個外植體,重復(fù)3次。接種后每隔7 d觀察外植體的褐變情況,培養(yǎng)周期為21 d或28 d。

1.4 測定指標及方法

用褐變指數(shù)表示外植體褐變的程度,將外植體的褐變程度分以下4級標準進行統(tǒng)計。褐變等級(L)=外植體褐變面積/外植體體積。0級:外植體外表鮮綠色,無褐變(L=0);1級:輕度褐變,外植體基本為綠色(L≤1/4);2級:褐變,外植體褐色(1/43/4)。

褐變指數(shù)=∑(褐變級數(shù)×該級株數(shù))/(總株數(shù)×最高級數(shù))×100%

污染率=污染的外植體數(shù)/接種的外植體 數(shù)×100%

多酚氧化酶(PPO)活力的測定采用兒茶酚法[7],單位為U/(g·min);苯丙氨酸解氨酶(PAL)活力的測定采用巰基乙醇法[8-9],單位為U/(g·h);總酚的測定采用福林酚試劑法[10],總酚含量單位為mg/g。

色度測定:使用CR410型色差計于室溫下測定,得出L*值,分析不同取材部位縱切面的褐變程度(L*值為亮度指數(shù),從0～100變化,L*=0表示黑色,L*=100表示白色,其值越大亮度越高,表面褐變越輕,反之褐變越嚴重)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Microsoft Excel 2016對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計整理,用SPSS 20.0進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 枝條切口褐變的影響因素

2.1.1 枝條不同節(jié)位切口的褐變程度差異 將帝王大麗花不同節(jié)位切開后暴露在空氣中,測定在不同時間點L*值,結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同節(jié)位L*值隨時間變化都呈下降趨勢(圖1),其中以頂芽、2節(jié)和3節(jié)下降的較多,分別下降2.11、1.74和 1.99,4節(jié)和5節(jié)下降的少,分別為0.92和0.79,說明帝王大麗花上端枝條比下端枝條褐變嚴重。

圖1 枝條不同節(jié)位切口的褐變程度差異Fig.1 Difference in browning degree of different nodal incisions on branches

2.1.2 外界條件對枝條切口褐變的影響 空氣暴露時間對枝條切口褐變的影響:將帝王大麗花枝條切開后暴露于空氣中觀察切口顏色變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn),切開后5 s枝條切口即發(fā)生輕微褐變, 2 min后切面全部變成淺褐色。隨著切面在空氣中暴露時間延長,褐變程度加重,由初期的淺褐色變?yōu)榧t褐色,30 min時全部變?yōu)楹诤稚?圖2)。

圖2 帝王大麗花枝條切口在空氣中暴露時間與褐變程度變化Fig.2 Exposure time and browning degree of branch incisions of D.imperial

浸水與浸水加氧處理對褐變的影響:分別選取帝王大麗花植株頂芽至第5節(jié)位的帶芽莖段(從左到右),分別在浸水條件(圖3-a)和浸水加氧條件下(圖3-b)培養(yǎng)24 h后發(fā)現(xiàn),兩個處理的莖段上部幼嫩部分出現(xiàn)褐變的時間早于下部成熟部分,且枝條上端褐變程度高于下端褐變程度。其中,浸水處理除頂芽外其他莖段只有葉柄部位出現(xiàn)嚴重褐變,整體可以保持基本綠色,而浸水加氧處理的頂芽和莖段全部褐變死亡。綜合比較5個節(jié)位的褐變程度,浸水加氧處理褐變比浸水處理更為嚴重(圖3)。由此可以初步確定,外界氧氣可以加劇帝王大麗花的褐變程度,其切口褐變的類型為酶促褐變。

圖3 浸水(a)和浸水加氧(b)處理24 h后不同節(jié)位莖段褐變情況Fig.3 Browning of stem segments at different nodes after water insertting (a) and water insertting with oxygen(b) for 24 hours

不同溫度下褐變程度差異:在不同季節(jié)取樣后,5 min時觀察帝王大麗花相同節(jié)位切面?zhèn)诘暮肿兂潭?以7月份取樣后傷口褐變嚴重(圖4-a),顏色表現(xiàn)為黑褐色;12月份取樣后切面出現(xiàn)輕微褐變(圖4-b),相比7月份褐變程度顯著降低,說明冬季較低的溫度可能對褐變起到顯著的抑制作用。

圖4 7月(a)和12月(b)取樣后切口的褐變情況Fig.4 Browning of incisions after sampling in July and December

2.2 枝條不同節(jié)位切口褐變程度與相關(guān)酶活性的相關(guān)性

帝王大麗花枝條不同節(jié)位PPO活性的測定結(jié)果見圖5。從枝條形態(tài)學上端到形態(tài)學下端,不同節(jié)位中PPO活性呈逐漸下降的趨勢。其中,頂芽與第2、3節(jié)的PPO活性均在812.30 U/(g·min)以上,差異不顯著;第4節(jié)PPO活性為552.90 U/(g·min),與其上端或下端節(jié)位差異顯著;第5節(jié)位PPO活性最低,為190.30 U/(g·min),與上端的所有節(jié)位差異顯著。

不同小寫字母表示在P<0.05水平上差異性顯著

帝王大麗花枝條不同節(jié)位PAL活性差異從枝條形態(tài)學上端到下端,PAL活性呈下降趨勢,其中,頂芽PAL活性最高,與其下端部位之間具有顯著性差異;第2節(jié)與第3節(jié)之間酶活性無顯著差異,但與下端部位差異性顯著;第4節(jié)與第5節(jié)之間的PAL活性無顯著性差異。

帝王大麗花枝條不同節(jié)位總酚含量從枝條形態(tài)學上端到下端,總酚的含量呈下降趨勢,其中,頂芽總酚含量最高,為0.10 mg/g,但與第2、3、4節(jié)之間無顯著性差異;下端第5節(jié)位的總酚含量最低,僅有0.05 mg/g,與頂芽總酚含量差異顯著。

2.3 不同處理措施對外植體褐變的影響

2.3.1 不同切割環(huán)境對外植體褐變的影響 由表1可知,不同處理的外植體均在接種后出現(xiàn)不同程度的褐變,其中,在1.0%維生素C溶液中切割(C)褐化程度最輕;雖然接種2 d時1.0%的維生素C溶液中切割(C)比正常切割(A)和在無菌水中切割(B)褐變指數(shù)高出15.25%和19.30%,但在接種14 d時,C處理比A、B褐變指數(shù)分別低4.86%和3.52%;到接種21 d時,與A、B相比,C處理褐變指數(shù)最低,且在整個培養(yǎng)期間,C處理褐變指數(shù)增長幅度最小,能夠基本保持穩(wěn)定狀態(tài),但A、B處理的褐變指數(shù)隨著時間延長一直呈增長趨勢。雖然B、C處理的外植體污染率比A處理分別高出25.93%和14.81%,但污染率在培養(yǎng)期間內(nèi)并未對外植體褐變造成影響。

表1 接種時不同切割環(huán)境外植體褐變指數(shù)和污染率Table 1 Browning index and contamination rate of explants under different cut environments during inoculation

對接種到培養(yǎng)基的外植體進行觀察發(fā)現(xiàn):A處理后接種到培養(yǎng)基時,外植體會立刻發(fā)生嚴重褐變,褐變部分顏色逐漸加深,直至表面全部變成黑褐色,與培養(yǎng)基接觸部分可見紅褐色物質(zhì)析出,且面積相對較大;B處理接種到培養(yǎng)基后,外植體褐變程度相比A稍有減輕,僅有少量紅褐色物質(zhì)析出,培養(yǎng)基紅褐色面積較小;C處理后接種到培養(yǎng)基,外植體只出現(xiàn)輕微褐變,與培養(yǎng)基接觸部分顏色正常,沒有紅褐色物質(zhì)析出(圖6)。

圖6 A、B、C接種后正、底面褐變比較Fig.6 Comparison of browning on front and bottom surfaces of A,B and C after inoculation

2.3.2 水插和低溫處理對外植體接種后褐變的影響 帝王大麗花枝條下部進行不同時間水插處理對外植體接種后褐變的影響見表2。隨著培養(yǎng)時間的增加,所有處理的外植體在接種后褐變指數(shù)均呈現(xiàn)增加趨勢。接種28 d時的統(tǒng)計結(jié)果表明,水插處理的外植體褐變指數(shù)均低于對照S1(未水插),其中以水插5 d(S3)和水插7 d(S4)處理效果好,與對照處理S1相比,褐變指數(shù)分別降低12.60%和12.45%,而水插2 d(S2)比對照S1褐變指數(shù)僅降低5.06%。所有接種的外植體污染率雖然保持在70.00%～81.82%,但并未對褐變程度造成影響(表2)。

表2 不同的水插時間外植體褐變指數(shù)和污染率Table 2 Browning index and contamination rate of explants under different waterinserttingtime

接種21 d后,對照S1處理的帶芽莖段褐變嚴重,顏色呈現(xiàn)黑褐色,其幼芽生長不正常,葉片蜷曲不能展開并伴有褐變;S2和S4處理后的帶芽莖段,新長出來的幼芽狀態(tài)較S1好,整體褐變程度也低;S3處理后效果最好,萌發(fā)的幼芽生長健壯,葉片濃綠,展開正常(圖7)。

圖7 接種21 d時不同水插時間處理外植體褐變及幼芽長勢情況Fig.7 Browning of explants and bud growth at 21 days after inoculation with different water insertting time

水插5 d后4 ℃低溫處理時間對外植體褐變的影響見表3。結(jié)果表明,將帝王大麗花枝條先放在18 ℃的培養(yǎng)箱中水插處理5 d,然后放在 4 ℃冰箱低溫處理5 h后抑制褐變效果最好,相比處理W1外植體褐變指數(shù)降低5.17%,相比處理S1褐變指數(shù)降低17.12%,但是隨著4 ℃低溫處理時間的增加,褐變指數(shù)都快速升高,表現(xiàn)出比對照W1更明顯的褐變。其中,4 ℃處理10 h(W3)和4 ℃處理15 h(W4)褐變指數(shù)分別為 91.00%和90.00%,4 ℃處理20 h(W5)和4 ℃處理24 h(W6)褐變指數(shù)分別為82.29%和 80.95%。污染率能夠保持在80%以下,未對褐變指數(shù)造成影響(表3)。

表3 外植體進行不同時間的低溫預(yù)處理褐變指數(shù)和污染率Table 3 Browning index and contamination rate of explants after different time of low temperature pretreatment

培養(yǎng)21 d后比較不同處理下外植體的生長情況,W1和W2處理后的帶芽莖段其萌發(fā)的幼芽能夠正常生長,且不發(fā)生褐變。W3和W4處理后的帶芽莖段在萌發(fā)的幼芽基部即發(fā)生褐變,并逐漸蔓延至全株;W5和W6處理后的帶芽莖段其幼芽生長停滯,并伴有輕微褐變現(xiàn)象(圖8)。

2.3.3 接種后暗處理和低溫處理對外植體褐變的影響 接種后不同時間暗處理對外植體褐變的影響:由表4可知,隨著暗培養(yǎng)時間增加,外植體褐變有減輕趨勢。在不同時間節(jié)點對外植體褐變情況進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn):暗培養(yǎng)0d(H1)和暗培養(yǎng)2 d(H2)隨接種后培養(yǎng)時間變化褐變指數(shù)呈上升趨勢。在接種21 d時,暗培養(yǎng)7 d(H3)和暗培養(yǎng)14 d(H4)褐變指數(shù)比對照H1分別降低 5.36%,H4在暗培養(yǎng)結(jié)束后轉(zhuǎn)正常培養(yǎng),其褐變指數(shù)能基本保持穩(wěn)定。H2、H3的污染率高于H1、H2。

接種培養(yǎng)14 d時,對照暗培養(yǎng)0 d(H1)的外植體,其接觸培養(yǎng)基部分隨著培養(yǎng)時間的增加一直呈現(xiàn)紅褐色,且面積較大;經(jīng)過暗培養(yǎng)2 d(H2)的外植體,接觸的培養(yǎng)基顏色為黑褐色;經(jīng)過暗培養(yǎng)7 d(H3)和暗培養(yǎng)14 d(H4)的外植體,培養(yǎng)基顏色正常(圖9)。

圖9 接種14 d時不同時間黑暗處理的外植體情況Fig.9 Dark treatment of explants at different time at 14 days after inoculation

接種后暗處理+低溫處理對外植體褐變的影響:接種后暗處理+不同時間4 ℃低溫處理對外植體褐變的影響見表5。結(jié)果表明,在黑暗條件下,所有經(jīng)過4 ℃低溫處理的外植體在培養(yǎng)周期(28 d)內(nèi)的褐變指數(shù)均呈現(xiàn)先增加后趨于穩(wěn)定的變化趨勢。暗處理+4 ℃ 0 d(Wa)和暗處理+ 4 ℃ 2 d(Wb)在培養(yǎng)14 d后褐變指數(shù)趨于穩(wěn)定;暗處理+4 ℃ 4 d(Wc)在培養(yǎng)21 d后褐變指數(shù)趨于穩(wěn)定;暗處理+4 ℃6 d(Wd)在培養(yǎng)21 d后褐變指數(shù)不再變化。相同時間節(jié)點獲得的數(shù)據(jù)表明,暗處理+4 ℃6 d(Wd)的褐變指數(shù)均低于其他處理,效果最好。接種28 d時發(fā)現(xiàn),Wd褐變指數(shù)比Wa低31.25%,比Wc低21.05%,比Wb低 18.42%。污染率數(shù)據(jù)表明,暗處理+4 ℃低溫處理的時間越長,污染出現(xiàn)的時間越晚,所有處理在培養(yǎng)周期結(jié)束時(28 d)雖然全部污染,但污染未對外植體褐變程度產(chǎn)生影響。

表5 接種后暗處理+4 ℃低溫處理不同時間外植體褐變指數(shù)和污染率Table 5 Browning index and contamination rate of explants dark treatment under +4 ℃ low temperature treatment time after inoculation

研究發(fā)現(xiàn),接種6 d時,外植體褐變情況以Wa褐變程度最嚴重,外植體幾乎全部變褐,Wb相比對照Wa褐變程度較輕,顏色較淺,Wc和Wd的效果最好,褐變程度最淺,此時所有帶芽莖段均未出芽(圖10);接種28 d時觀察,Wa處理下的帶芽莖段褐變死亡,幼芽始終處于萌發(fā)狀態(tài)而不生長,Wb和Wc處理下的外植體幼芽萌發(fā)生長,葉片呈現(xiàn)黃綠色,Wd處理下的外植體幼芽萌發(fā)生長,并且葉片濃綠,展開正常,長勢健壯 (圖11)。

圖11 接種28 d時暗處理+4 ℃處理不同時間外植體褐變及幼芽長勢Fig.11 Browning and bud growth of explants at 28 days after dark treatment of +4 ℃ low temperature at different time

3 討 論

褐變按其發(fā)生機理分為酶促褐變和非酶促褐變兩大類[11]。新鮮的植物組織受到損傷時多發(fā)生酶促褐變,即由于細胞膜結(jié)構(gòu)破壞,組織中多酚氧化酶被激活,酚類化合物被氧化形成褐色的醌類物質(zhì),在酪氨酸酶作用下,與植物組織中的蛋白發(fā)生聚合,從而抑制很多代謝酶的活性,導致代謝紊亂,生長受阻,最終致使材料逐漸變褐死亡[12]。引起酶促褐變的因素主要是氧、底物、酶等。本研究中,針對帝王大麗花枝條取材時切口嚴重褐化問題,比較枝條不同節(jié)位褐變程度的差異,探究枝條水插和低溫預(yù)處理對褐變的影響,并對接種后的外植體進行黑暗和低溫處理來減輕褐變的發(fā)生。

不同取材部位對外植體的褐變程度有著重要影響[13]。程世平等[14]研究不同取材類型對黃連木莖段褐化的影響時發(fā)現(xiàn),外植體木質(zhì)化程度與褐化程度以及腋芽的誘導發(fā)生密切相關(guān),其中半木質(zhì)化的莖段褐化率相對較低,幼嫩莖段褐變嚴重。本試驗中也得出與上述一致的結(jié)論。帝王大麗花從枝條上端到下端木質(zhì)化程度變化明顯,取樣時發(fā)現(xiàn)上端幼嫩部分比下部成熟部分褐變更嚴重。通過測定自上而下5個節(jié)位的PPO活性、PAL活性和總酚含量,結(jié)合不同節(jié)位莖段切口的褐變程度,結(jié)果發(fā)現(xiàn)上端幼嫩部分PPO活性、PAL活性和總酚含量明顯高于下端老熟部分,這種變化趨勢與枝條自上而下的褐變減輕相伴隨,說明幼嫩組織中PAL活性較高,導致PAL誘導產(chǎn)生的酚類物質(zhì)較多,而幼嫩組織中誘導酚類物質(zhì)氧化形成醌類物質(zhì)的關(guān)鍵酶PPO活性較高,從而導致醌類物質(zhì)在幼嫩組織中的增加而出現(xiàn)組織褐變。隨著取樣部位從幼嫩到老熟的變化,木質(zhì)化程度越高的老熟部位中PAL活性、PPO活性和總酚物質(zhì)含量的降低,因此褐變現(xiàn)象減輕。

外植體切割環(huán)境對帝王大麗花外植體的褐變程度有明顯影響。王仁睿等[15]將蝴蝶蘭莖尖放在1%維生素C溶液切割,再接種到添加0.2%PVP的培養(yǎng)基上,防止蝴蝶蘭莖尖褐化效果顯著。本研究在培養(yǎng)周期結(jié)束后,相比于空氣中切割外植體(A),無菌水中切割(B)和在1%的維生素C溶液中切割(C)對于減輕褐變都有效果,但以在1%的維生素C溶液中切割效果最好。B處理比A處理效果略好,但僅比A降低2.72%,原因是在水中切割時減少了材料與空氣之間的暴露時間,減少了酶促反應(yīng)的發(fā)生[16],但在接種時外植體不可避免地又會接觸空氣,所以效果并不理想;C處理在接種到培養(yǎng)基2 d后,褐變指數(shù)能夠基本保持穩(wěn)定,原因考慮植物組織在遭到機械破壞時,其體內(nèi)的多酚氧化酶會增多以保護自身,而維生素C并不能抑制多酚氧化酶活性[17],因此在接種后褐變指數(shù)快速上升,但是維生素C具有還原性,能將褐變產(chǎn)生的有色物質(zhì)鄰二醌還原成無色物質(zhì)鄰二酚[18],從而起到抑制褐變加劇的效果。

接種后進行暗處理能有效防止褐化現(xiàn)象的發(fā)生[19]。余慧琳等[20]研究表明,適當?shù)陌蹬囵B(yǎng)有利于減輕外植體的褐變,當外植體暗培養(yǎng)1周后再轉(zhuǎn)入光下正常培養(yǎng),比接種后直接放在光下培養(yǎng)外植體發(fā)生褐變的程度要輕,并且發(fā)生褐變的時間會推遲。王寶寧等[21]對春蘭花梗外植體進行暗培養(yǎng)10 d后完全褐化率相對較低,但在培養(yǎng)后期完全褐化率比暗培養(yǎng)5 d快速升高,這與本試驗暗處理的結(jié)果相似,即相對較長的暗培養(yǎng)時間有利于降低褐化率,其中以黑暗處理7 d(H3)褐變指數(shù)最低;雖然暗處理14 d后(H4)的褐變指數(shù)和H3的相同,但H4莖段愈傷表現(xiàn)顏色比H3顏色深;在正常情況下,帝王大麗花外植體培養(yǎng)到第2天褐變指數(shù)就達到82.50%,而通過黑暗處理,第7 天后褐變指數(shù)才達到83.33%,黑暗處理后褐化現(xiàn)象明顯延遲,但隨著時間增加褐化現(xiàn)象也隨即產(chǎn)生,說明黑暗處理只是在短時間內(nèi)抑制了褐化物質(zhì)的產(chǎn)生。暗培養(yǎng)對外植體褐化起到了一定的抑制作用,可能是外植體在黑暗中減少了酚類物質(zhì)的滲出,從而降低了褐變率[22-23],因為在酚類化合物合成和氧化過程中,需要許多酶系統(tǒng)參與,其中一部分酶系統(tǒng)的活性是受光誘導的[24],因此在前期暗培養(yǎng)時褐變會受到一定程度的抑制。

低溫處理可在不同程度上降低植物材料的褐變率[25]。張衛(wèi)芳等[26]將核桃莖尖接種到培養(yǎng)基后,置于5 ℃冰箱中黑暗培養(yǎng)7 d后取出,置于 25 ℃無光照下培養(yǎng),褐化率有所降低;李煥秀等[27]將采集的蒼溪梨外植體進行低溫預(yù)處理對降低褐變有一定作用。本試驗結(jié)果表明,無論是在取樣后對帝王大麗花枝條進行低溫處理,還是對接種后的外植體進行低溫處理,均可明顯降低褐變率,原因可能是低溫抑制了酚類化合物的合成,抑制了多酚氧化酶的活性,減少了酚類氧化,從而使褐變減輕[28]。

本試驗發(fā)現(xiàn),取樣時間、取樣位置、外植體切割環(huán)境以及接種前后材料的低溫和黑暗處理對帝王大麗花的褐變率均可產(chǎn)生不同影響,所采取的措施也一定程度上控制了褐變的發(fā)展,并獲得了部分不褐變的瓶苗,但是,探索更加有效的防止褐變的措施組合仍然很有必要,而且不同因素對褐變的影響機理以及各因素間的交互影響仍有待深入研究。此外,試驗獲得的無菌瓶苗經(jīng)過后期繼代培養(yǎng),并未再次出現(xiàn)褐變情況,其中原因尚待繼續(xù)研究。