從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)篩選結(jié)腸癌差異關(guān)鍵基因及驗(yàn)證

鄢 雯，李 囡，古同男，孔祥照

首都醫(yī)科大學(xué) 燕京醫(yī)學(xué)院，北京 101300

結(jié)腸癌(colon cancer,CC)是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤類型之一,占2013年所有腫瘤死亡人數(shù)的6%～8%,有高侵襲性、高轉(zhuǎn)移性、高復(fù)發(fā)率的特點(diǎn)[1]。盡管目前CC的診斷和治療取得了快速進(jìn)展,但其臨床治療和預(yù)防仍存在局限性,其機(jī)制仍有待進(jìn)一步探索。本研究利用生物信息學(xué)方法挖掘和分析結(jié)腸癌組織與癌旁組織的差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs),篩選出參與結(jié)腸癌發(fā)展的核心基因,探究核心基因與CC患者生存率之間的關(guān)系,最后通過體外實(shí)驗(yàn)探討預(yù)后相關(guān)基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響,預(yù)測(cè)其在腫瘤發(fā)生過程中的作用,可用于評(píng)估CC的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn),并提供潛在的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源:從基因表達(dá)綜合(gene expression omnibus,GEO)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)的GPL6104平臺(tái)(Illumina humanRef-8 v2.0 expression beadchip)篩選出兩套CC的基因表達(dá)數(shù)據(jù)集GSE74602和GSE10950。GSE74602數(shù)據(jù)集包含20個(gè)CC癌組織和20個(gè)正常結(jié)腸樣本,GSE10950數(shù)據(jù)集包含24個(gè)癌組織和24個(gè)正常樣本。

1.1.2 細(xì)胞系及試劑:人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480(北京泰科蘭博科技有限公司);DMEM、RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、CCK-8試劑、胰蛋白酶、Lipofectamine 3000 Transfection Reagent(北京索萊寶科技有限公司);利用Invitrogen BlockiT RNAi Designer軟件設(shè)計(jì)針對(duì)CCNB1、CCNA2和CDC20的小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)(蘇州吉瑪基因股份有限公司);兔抗人CCNB1單克隆抗體、兔抗人CDC20單克隆抗體和兔抗人CCNA2單克隆抗體(CST公司);鼠抗人α-tubulin抗體(Santa Cruz生物科技公司);HRP標(biāo)記的抗兔及抗鼠的二抗(北京中杉金橋生物科技公司);BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 差異表達(dá)基因的篩選:使用GEO2R(https://www.ncbi.nlmnih.gov/geo/geo2r/)在線分析數(shù)據(jù)集。以基因表達(dá)差異倍數(shù)(fold change,FC)的對(duì)數(shù)(|log2FC|)>1.5 和顯著性P<0.05 為閾值篩選差異表達(dá)基因。利用韋恩圖(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)篩選共同的差異表達(dá)基因。

1.2.2 基于差異基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)獲取核心基因:PPI網(wǎng)絡(luò)是研究細(xì)胞功能、疾病機(jī)制和藥物設(shè)計(jì)的可行工具[2]。利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)構(gòu)建DEGs的PPI[3]。利用Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建可視化的PPI網(wǎng)絡(luò),PPI中的節(jié)點(diǎn)和邊分別代表蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)之間的相互作用。用Cytoscape的MCODE在線工具對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行密集度分析,進(jìn)一步篩選PPI網(wǎng)絡(luò)最顯著模塊的中心節(jié)點(diǎn)基因,將其作為核心基因[4]。

1.2.3 功能富集分析:基因本體論(gene ontology,GO)從分子功能(molecular function,GO_MF)、生物過程(biological process,GO_BP)、細(xì)胞組分(cellular component,GO_CC)3個(gè)方面對(duì)基因及其產(chǎn)物的生物學(xué)意義進(jìn)行分析[5]。用DAVID在線工具(http://david.ncifcrf.gov)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析。通過使用京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出差異基因富集的通路,分析差異基因的生物學(xué)功能[6]。

1.2.4 關(guān)鍵基因的生存分析:以基因表達(dá)水平中位數(shù)為界,將CC患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組,利用GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)繪制Kaplan-Meier生存曲線,明確核心基因?qū)C生存的影響,將與預(yù)后顯著相關(guān)的核心基因視為關(guān)鍵基因[7-8]。

1.2.5 細(xì)胞的分組及處理:將SW480細(xì)胞置于含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),取對(duì)數(shù)增殖期細(xì)胞接種于6孔板,待細(xì)胞匯合度達(dá)80% 時(shí),用干擾載體 si-CCNB1、si-CDC20、si-CCNA2轉(zhuǎn)染細(xì)胞,用非特異性siRNA作陰性對(duì)照(si-NC),用空載體作空白對(duì)照(control)。

1.2.6 Western blot檢測(cè)SW480細(xì)胞si-CCNB1、si-CDC20、si-CCNA2轉(zhuǎn)染效率:轉(zhuǎn)染48 h后,收集各組細(xì)胞,PBS清洗3次,加入含有PSMF的RIPA和蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液提取總蛋白質(zhì),用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。提取等量的蛋白質(zhì)樣品(40 μg),100 ℃ 變性5 min,用SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,加入一抗4 ℃孵育過夜;TBST洗滌后,加入二抗室溫孵育1 h;TBST洗滌,加入發(fā)光液,采用凝膠成像儀曝光拍照。以GAPDH作為內(nèi)參照,用Image J軟件統(tǒng)計(jì)條帶灰度值,目的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平用A目的蛋白質(zhì)/AGAPDH的比值表示。

1.2.7 CCK8法檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖:將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為2×107/L,接種于96孔板,每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔,培養(yǎng)48 h。吸棄培養(yǎng)基,每孔加入10 μL CCK8檢測(cè)液,37 ℃孵育4 h,置低速搖床上震蕩10 min,使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔細(xì)胞在450 nm處的吸光度值(A值)。細(xì)胞增值率=實(shí)驗(yàn)組A值/空白對(duì)照組A值×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因分析

數(shù)據(jù)集GSE74602鑒定了606個(gè)差異表達(dá)基因(P<0.05,|logFC|>1.5)。數(shù)據(jù)集GSE10950選出2 559個(gè)差異表達(dá)基因(P<0.05,|logFC|>1.5)。使用韋恩圖在線工具識(shí)別出515個(gè)共同的差異表達(dá)基因,其中292個(gè)基因表達(dá)下調(diào)和223個(gè)基因表達(dá)上調(diào)(表1,圖1)。

表1 GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中2個(gè)數(shù)據(jù)集的統(tǒng)計(jì)

A.common up-regulated genes;B.common down-regulated genes

2.2 差異表達(dá)基因的GO富集分析及KEGG信號(hào)通路分析

在表達(dá)上調(diào)基因中,共有DEGs生物學(xué)過程主要與有絲分裂染色體凝結(jié)、凋亡過程負(fù)調(diào)控和轉(zhuǎn)錄正調(diào)控等有關(guān);細(xì)胞組成主要富集于細(xì)胞質(zhì)、核質(zhì)和核仁中;分子功能主要富集于染色質(zhì)結(jié)合、ATP結(jié)合等(表2)。

表2 差異表達(dá)基因(DEGs)的GO富集分析結(jié)果

根據(jù)KEGG途徑富集分析,在表達(dá)上調(diào)基因中,有20個(gè)基因在細(xì)胞周期途徑中富集,8個(gè)基因在DNA復(fù)制中富集,8個(gè)基因在孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟中富集(表3)。

表3 差異表達(dá)基因(DEGs)的KEGG信號(hào)通路分析

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和核心基因的選取

利用STRING v11.0構(gòu)建了由170個(gè)基因節(jié)點(diǎn)和685條邊組成的PPI網(wǎng)絡(luò),其中紅色代表61個(gè)上調(diào)基因,綠色代表下調(diào)基因109個(gè)(圖2A)。應(yīng)用Cytotype MCODE 進(jìn)行進(jìn)一步分析,結(jié)果顯示在170個(gè)節(jié)點(diǎn)中有33個(gè)關(guān)鍵基因均是上調(diào)基因(圖2B)。

A.PPI network;B.33 hub genes.

2.4 核心基因的生存分析

33個(gè)核心基因中有7個(gè)關(guān)鍵基因與COAD的存活率有關(guān)(P<0.05)(圖3A)。與正常對(duì)照組相比,COAD患者中7個(gè)基因的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)(圖3B)。

A.survivorship curve:B.mRNA expression of core genes between CC tumor(T) and normal control(N)people,red color means tumor tissues and grey color means normal tissues; *P<0.05 compared with control.

2.5 具有預(yù)后價(jià)值的關(guān)鍵基因的功能富集分析

通過David軟件重新分析KEGG通路的富集,發(fā)現(xiàn)有3個(gè)基因(CCNB1、CDC20和CCNA2)在細(xì)胞周期通路中顯著富集(P<0.001)(表4)。

表4 7個(gè)關(guān)鍵基因的KEGG信號(hào)通路富集分析

2.6 轉(zhuǎn)染siRNA抑制SW480細(xì)胞中CCNB1、CCNA2和CDC20的表達(dá)

Si-CCNB1組CCNB1蛋白相對(duì)表達(dá)量、si-CCNA2組CCNA2蛋白相對(duì)表達(dá)量、si-CDC20組CDC20蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著低于相應(yīng)si-NC組(P<0.01)(圖4)。

0.05 compared with si-NC.

與對(duì)照組和si-NC組相比,si-CCNB1,si-CCNA2和si-CDC20組72 h細(xì)胞增殖均明顯降低(P<0.05)(圖5)。

*P<0.05 compared with control; 0.05 compared with si-NC.

3 討論

結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程,在CC治療期間,細(xì)胞周期通路的中斷被認(rèn)為是可以誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞死亡的有利事件之一[9]。已有研究表明,細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子可以調(diào)節(jié)癌細(xì)胞中細(xì)胞周期的不同階段,包括G0、G1、G2、S和M期[10]。伴隨著研究的不斷深入,CC的臨床診斷和治療獲得明顯的改善,但其預(yù)后仍然很差。因此,識(shí)別與CC相關(guān)的良好預(yù)后生物標(biāo)志物是開發(fā)有效治療方法的關(guān)鍵步驟。

本研究分析了來(lái)源于GEO的GSE74602和GSE10950數(shù)據(jù)集,共篩選出515個(gè)與CC有關(guān)的差異表達(dá)基因,其中表達(dá)上調(diào)223個(gè),下調(diào)292個(gè)。進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析,以確定與結(jié)直腸癌臨床特征相關(guān)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和基因共表達(dá)模塊。此外,還進(jìn)行了功能和途徑分析,以發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌相關(guān)的生物過程和途徑。通過對(duì)DEGs的GO分析和KEGG分析,對(duì)DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)分析獲取 核心(hub)基因,對(duì)核心基因進(jìn)行生存分析和差異分析,得知CCNB1、CCNA2和CDC20在結(jié)腸癌中高表達(dá),并在細(xì)胞周期通路中顯著富集,對(duì)結(jié)腸癌患者的生存具有影響,利用人源結(jié)腸癌細(xì)胞系,降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)CCNB1、CCNA2和CDC20的表達(dá),結(jié)果顯示CCNB1、CCNA2和CDC20可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抑制凋亡,該生物信息學(xué)分析結(jié)論符合前期研究結(jié)果。前期研究顯示[11-15]:CCNB1在包括胰腺癌、卵巢癌、原發(fā)性肝癌和胃癌在內(nèi)的各種預(yù)后不良的癌類型中均有顯著的過表達(dá),主要表達(dá)于G2、M期,在G2、M(有絲分裂)過渡時(shí)控制細(xì)胞周期至關(guān)重要[11-12]。CCNA2通過激活參與S期調(diào)控的激酶,在控制細(xì)胞周期中發(fā)揮關(guān)鍵作用[13-14]。CDC20在胰腺癌、肺癌、膀胱癌和乳腺癌等多種低分化的腫瘤中高表達(dá),并與這些腫瘤的不良預(yù)后有關(guān)[15]。這與本研究結(jié)論是一致的。

綜上所述,CCNB1、CCNA2和CDC203個(gè)與信號(hào)通路有關(guān)的基因在CC組織中高表達(dá),且表達(dá)量高者預(yù)后差,并與信號(hào)通路有關(guān),CCNB1、CCNA2和CDC20有望成為CC的診斷分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。本研究結(jié)果存在一定局限性,僅從計(jì)算生物學(xué)方法的角度進(jìn)行分析,但仍需更多實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)行驗(yàn)證。