丙酮醛降低人腦微血管內(nèi)皮細胞系hCMEC/D3細胞活力及線粒體膜電位

李婷婷，韓臻平，高 立，王思懿，鐘 愷，黃 萍，3，嚴潔萍，3*

1.浙江省人民醫(yī)院 杭州醫(yī)學院附屬人民醫(yī)院 臨床藥學中心 藥學部，浙江 杭州 310014；2.浙江工業(yè)大學 藥學院 藥學系，浙江 杭州 310014；3.浙江省內(nèi)分泌腺體疾病診療重點實驗室，浙江 杭州 310014

腦血管并發(fā)癥(cerebrovascular complications)是常見的糖尿病并發(fā)癥,增加疾病不良預后,并與病程呈正相關,因此腦血管并發(fā)癥的深入機制研究及有效防治是降低糖尿病不良預后的關鍵環(huán)節(jié)[1]。

丙酮醛(methylglyoxal,MGO)是葡萄糖和果糖氧化反應的中間產(chǎn)物之一,其糖基化活性比葡萄糖高200～50 000倍[2]。臨床研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病患者的血清中可檢測到比健康者高2～4倍的MGO濃度。此外,研究發(fā)現(xiàn)晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGEs)比健康人群高出數(shù)倍[3]。高糖狀態(tài)可導致包括內(nèi)皮細胞等多種細胞胞內(nèi)高濃度活性氧、誘導細胞凋亡、線粒體功能發(fā)生障礙以及血管生成受阻[4]。高濃度的MGO和AGEs不僅可能導致糖尿病患者血管內(nèi)皮損傷,還與血脂異常、高血壓、卒中等血管并發(fā)癥密切有關[2,5]。因此,MGO可能是糖尿病腦血管并發(fā)癥的重要因素,但其病理學意義尚不明確。

本研究試圖探討MGO對人腦微血管內(nèi)皮細胞系hCMEC/D3的損傷作用,并進一步考察線粒體活性氧(mitochondrial reactive oxygen species,mROS)和線粒體膜電位等變化,對腦血管并發(fā)癥的病理機制及臨床防治都具有重要臨床意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑:DMEM、胎牛血清(Gibco公司);胰蛋白酶-EDTA(HyClone公司);二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)(Sigma-Aldrich公司);JC-1探針,MGO(MCE公司);CCK-8試劑盒、LDH試劑盒、SOD試劑盒(碧云天生物技術公司);MitoSOX(Thermo Fisher Scientific公司)。

1.1.2 細胞:人腦微血管內(nèi)皮細胞系hCMEC/D3、DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)(浙江美森細胞科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的分組及處理:分組如下:對照組,加入25 μL培養(yǎng)基;MGO組,加入25 μL不同濃度的MGO,使其終濃度為0.25、0.50、0.75、1.00和1.25 mmol/L。

1.2.2 CCK-8法檢測活力:收集正常培養(yǎng)的hCMEC/D3細胞,按每孔約6 000～10 000個細胞接種到96孔板中,常規(guī)培養(yǎng)24 h后加入不同濃度的MGO繼續(xù)培養(yǎng),吸棄孔中原有液體,將稀釋好的CCK-8工作液(100 μL)加入96孔板中,并檢測吸光度(A450 nm)值。

1.2.3 細胞內(nèi)LDH和SOD的檢測:將hCMEC/D3細胞接種于96孔板,MGO(0.75 mmol/L)處理細胞6 h和12 h后,按測試盒說明書測定。

1.2.4 JC-1熒光探針檢測線粒體膜電位:用不同濃度的MGO分別孵育增殖匯合至60%的hCMEC/D3細胞,接著用2 μmol/L的JC-1工作液在37 ℃下孵育15 min,最后用稀釋至1×的緩沖液清洗3次,鏡下觀察熒光強度。

1.2.5 MitoSOX熒光探針檢測線粒體活性氧(mROS):hCMEC/D3細胞培養(yǎng)在35 mm的共聚焦皿中,以不同濃度的MGO孵育10 h后,接著用稀釋的200 nmol/L MitoSOX在37 ℃孵育10 min,鏡下觀察熒光強度。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 MGO呈濃度依賴地誘導hCMEC/D3細胞損傷

不同濃度的MGO作用于hCMEC/D3細胞24 h,細胞活力較對照組,呈濃度依賴性明顯下降(P<0.01)(圖1)。后續(xù)實驗選用MGO濃度為0.75 mmol/L。

*P<0.5,**P<0.01 compared with control.

2.2 MGO對hCMEC/D3細胞 LDH和SOD活性的影響

與對照組相比,MGO(0.75 mmol/L)處理24 h后,hCMEC/D3胞內(nèi)LDH活性呈濃度依賴性上調(diào)(P<0.01),而SOD活性呈濃度依賴性顯著降低(P<0.01)(圖2)。

A.observing by MitoSOX probe; B.determining by kits; 0.01 compared with control.

2.3 MGO對hCMEC/D3細胞 mROS水平的影響

與對照組相比,MGO(0.75 mmol/L)作用6 h和12 h后,經(jīng)MitoSOX染色后,hCMEC/D3胞內(nèi)可見紅色熒光,隨時間顯著增強(P<0.01)(圖3)。

0.01 compared with control.

2.4 MGO對hCMEC/D3細胞線粒體膜電位的影響

與對照組相比,MGO(0.75 mmol/L)作用6 h和12 h后,hCMEC/D3細胞紅綠熒光比值降低(P<0.01)(圖4)。

0.01 compared with control.

3 討論

腦微血管內(nèi)皮損傷是糖尿病腦血管并發(fā)癥的關鍵環(huán)節(jié)[5-6]。臨床研究表明,糖尿病患者的MGO水平明顯高于健康人群[7],可能是腦血管并發(fā)癥的關鍵因素之一。本研究發(fā)現(xiàn)MGO可降低hCMEC/D3細胞活力,導致胞內(nèi)LDH過量釋放,降低細胞SOD活性和線粒體膜電位,并可導致胞內(nèi)mROS過量發(fā)生。本研究利用人腦微血管內(nèi)皮細胞系hCMEC/D3作為體外研究對象,確認了MGO濃度依賴的hCMEC/D3細胞損傷,并采用0.75 mmol/L MGO作為后續(xù)損傷濃度,與目前報道的研究一致[8-9]。

人腦微血管內(nèi)皮細胞是血腦屏障的重要組成部分,其功能障礙會造成腦組織損傷,增加糖尿病患者腦血管并發(fā)癥的發(fā)生。有研究顯示,MGO能抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞活性,導致細胞炎性損傷并進一步促進細胞凋亡[10]。MGO還可抑制人主動脈內(nèi)皮細胞網(wǎng)絡的形成和增殖,誘導細胞凋亡[11]。本研究也發(fā)現(xiàn)hCMEC/D3細胞經(jīng)MGO處理后,細胞活力降低,LDH釋放增加,提示MGO增加了hCMEC/D3細胞膜通透性,可能造成血腦屏障破壞。SOD作為體內(nèi)的一種自由基清除劑,抑制體內(nèi)氧化損傷,參與維持體內(nèi)代謝平衡。MGO作用后hCMEC/D3細胞SOD的活性降低,提示MGO可能影響胞內(nèi)正常的氧化代謝,可能造成機體氧化損傷。

當線粒體ETC系統(tǒng)有缺陷時,線粒體活性氧生成增加,導致MGO誘導的組織損傷的病理機制上調(diào)[12]。細胞線粒體膜電位下降時線粒體通透性轉換孔開放,這將使線粒體內(nèi)的氧化物質(zhì)釋放到細胞基質(zhì)中,造成細胞損傷[13]。本研究中MGO誘導早期hCMEC/D3細胞內(nèi)mROS過量生成,伴線粒體膜電位下降,提示MGO誘導了細胞線粒體功能損傷。因此MGO對細胞損傷的早期作用,誘導線粒體功能損傷可能是導致糖尿病腦血管并發(fā)癥發(fā)生的重要原因之一。有研究顯示MGO上調(diào)了hCMEC/D3細胞中線粒體凋亡途徑相關的caspase-8,caspase-9的表達,促進線粒體凋亡[14]。以上研究均提示MGO可能是糖尿病腦血管并發(fā)癥中的一個高危因素,其損傷作用可能與線粒體損傷相關。

綜上所述,MGO降低hCMEC/D3細胞活力,增加LDH的水平,降低SOD的活性及胞內(nèi)線粒體膜電位,同時伴mROS過量產(chǎn)生。MGO致hCMEC/D3細胞活力下降和mROS過量產(chǎn)生之間的相關機制還有待進一步探討。