止眩方氣霧給藥預(yù)防暈動(dòng)癥用于小鼠的效果及基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的機(jī)制預(yù)測(cè) *

鄧 竺 鄭佳欣 張瑞穎 楊欽翔 徐佳怡 袁省之 劉丹彤※

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，北京 100700；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 100029）

暈動(dòng)癥是指機(jī)體處于被動(dòng)運(yùn)動(dòng)環(huán)境中，身體的平衡器受到影響，內(nèi)耳前庭神經(jīng)功能暫時(shí)失常而引起的以眩暈、上腹不適、嘔吐等反應(yīng)為主的綜合征［1］。研究發(fā)現(xiàn)，近1/3 的人受到暈動(dòng)癥的影響［2］。目前西醫(yī)多采用鎮(zhèn)靜類或副交感神經(jīng)阻斷劑預(yù)防暈動(dòng)癥，易帶來嗜睡、抑郁等不良反應(yīng)，而中藥具有效果好、毒副作用小、不良反應(yīng)少等優(yōu)勢(shì)［3］。霧化給藥具有腦靶向性，藥物吸收后直接進(jìn)入體循環(huán)，達(dá)到全身治療的目的，且生物利用度高、使用便捷、起效快［4］，因此本研究擬以防治暈動(dòng)癥核心藥物［5］為研究對(duì)象，通過霧化給藥，觀察其對(duì)小鼠暈動(dòng)癥的預(yù)防作用，并通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，探究其發(fā)揮作用的活性成分及靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物10 周齡昆明小鼠50 只，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，使用許可證號(hào)：SYXK（京）2020-0033。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料自制旋轉(zhuǎn)儀；曠地實(shí)驗(yàn)儀、高架十字迷宮由北京中醫(yī)藥大學(xué)提供；霧化器購自江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司，型號(hào)403M；止眩方（天麻、陳皮、炒白術(shù)、薄荷、廣藿香、炙甘草、茯苓），購自北京同仁堂藥店；氫溴酸東莨菪堿購自成都普思生物科技股份有限公司，批號(hào)PS020249。

1.1.3 方法

1.1.3.1 分組及給藥方法將小鼠編號(hào)后隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、陽性藥物組、霧化高濃度組、霧化低濃度組，每組10 只。模型組、陽性藥物組提前3 d 每天定時(shí)分別接受生理鹽水、1 mg/mL 氫溴酸東莨菪堿溶液處理，并在造模前2 h 進(jìn)行最后一次給藥，按小鼠體質(zhì)量10 mL/kg 計(jì)算，平均藥量0.2 mL。霧化高濃度組、霧化低濃度組造模前20 min 分別接受止眩方高濃縮（濃度為2 g/mL）、止眩方低濃縮（濃度為1 g/mL）霧化干預(yù)處理5 min，霧化藥量為0.1 mL。

1.1.3.2 暈動(dòng)癥小鼠模型的制備除空白對(duì)照組外其余各組小鼠無束縛置于根據(jù)Crampton G H［6］等研究仿制的自制旋轉(zhuǎn)儀中，轉(zhuǎn)速約400 r/min，水平旋轉(zhuǎn)5 min。

1.1.3.3 曠場實(shí)驗(yàn)及高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)小鼠造模后立即轉(zhuǎn)移至?xí)绲叵鋬?nèi)，記錄5 min 內(nèi)小鼠的自發(fā)活動(dòng)距離和速度，曠場實(shí)驗(yàn)后將小鼠置于高架十字迷宮臂中心，記錄5 min 內(nèi)小鼠的自發(fā)活動(dòng)距離和速度，用EthoVision XT 11.5軟件進(jìn)行分析。

1.1.3.4 暈反應(yīng)指數(shù)評(píng)分造模結(jié)束后，進(jìn)行10 min 暈反應(yīng)指數(shù)評(píng)分［7］。本實(shí)驗(yàn)中立毛、震顫表現(xiàn)不明顯，故只計(jì)入糞便、尿液情況。見表1。

表1 暈反應(yīng)指數(shù)評(píng)分

1.1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 23.0軟件，組間計(jì)量數(shù)據(jù)以（±s）表示。組間兩兩比較，若服從正態(tài)分布，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；若不服從正態(tài)分布，采用曼-惠特尼U檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

1.2.1 活性成分和靶點(diǎn)篩選以實(shí)驗(yàn)研究中止眩方藥物為基礎(chǔ)，在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP）數(shù)據(jù)庫以口服生物利用度≥30%，類藥性≥0.18為條件進(jìn)行檢索；并通過文獻(xiàn)整理有效活性成分［8，9］，在SwissADME 中結(jié)果為High，5 種類藥性預(yù)測(cè)（Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge）中至少有2 項(xiàng)Yes為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，利用Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫，以可能性＞0.6為標(biāo)準(zhǔn)得到止眩方藥物活性成分和靶點(diǎn)。

1.2.2 暈動(dòng)癥疾病靶點(diǎn)篩選在OMIM、GeneCards、DisGeNET 和Drugbank 數(shù)據(jù)庫中以“motion sickness”為關(guān)鍵詞檢索，整理獲得暈動(dòng)癥的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.2.3 構(gòu)建藥物活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)將止眩方中藥物與暈動(dòng)癥數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，借助Cytoscape 3.7.1 軟件進(jìn)行可視化處理，構(gòu)建“藥物活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)。

1.2.4 構(gòu)建蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)將藥對(duì)與疾病的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.5，選定置信度＞0.9，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖，并利用Cytoscape 3.7.1軟件進(jìn)行可視化處理。

1.2.5 京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析利用Metascape 數(shù)據(jù)庫，以P value cutoff＜0.01 為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行KEGG通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 各組小鼠曠場實(shí)驗(yàn)情況比較與空白對(duì)照組比較，模型組的各項(xiàng)數(shù)值差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明該造模方法能成功誘發(fā)小鼠暈動(dòng)癥；與模型組比較，霧化高濃度組、霧化低濃度組的各項(xiàng)數(shù)值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示止眩方可增加模型小鼠的活躍性。見表2。

表2 各組小鼠曠場實(shí)驗(yàn)情況比較（±s）

表2 各組小鼠曠場實(shí)驗(yàn)情況比較（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。

組別空白對(duì)照組模型組陽性藥物組霧化高濃度組霧化低濃度組速度/（cm/s）8.36±1.49 5.03±0.861）8.34±1.152）9.69±3.292）7.64±1.302）鼠數(shù)10 10 10 10 10自發(fā)活動(dòng)距離/cm 2508.13±446.19 1509.44±259.211）2503.32±344.982）2903.79±980.182）2291.87±389.282）

2.1.2 各組小鼠高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)情況比較模型組各項(xiàng)數(shù)據(jù)均低于空白對(duì)照組（P＜0.05），提示該造模方法能成功誘發(fā)小鼠暈動(dòng)癥；陽性藥物組各項(xiàng)數(shù)據(jù)均低于模型組（P＜0.05）；與模型組比較，霧化低濃度組各項(xiàng)數(shù)據(jù)均顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示霧化吸入低濃度藥物可增加模型小鼠的活躍性。見表3。

表3 各組小鼠高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)情況比較 （±s）

表3 各組小鼠高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)情況比較 （±s）

注：與空白對(duì)照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。

組別空白對(duì)照組模型組陽性藥物組霧化高濃度組霧化低濃度組速度/（cm/s）3.74±0.50 2.50±0.371）1.66±0.862）2.73±0.70 3.35±0.672）鼠數(shù)10 10 10 10 10自發(fā)活動(dòng)距離/cm 1122.12±148.92 750.80±116.031）496.65±258.842）819.11±212.25 1006.06±200.732）

2.1.3 各組小鼠暈反應(yīng)指數(shù)比較與模型組比較，霧化高濃度組暈反應(yīng)指數(shù)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4 各組小鼠暈反應(yīng)指數(shù)比較（±s)

表4 各組小鼠暈反應(yīng)指數(shù)比較（±s)

注：與模型組相比,1)P＜0.05。

組別模型組陽性藥物組霧化高濃度組霧化低濃度組暈反應(yīng)指數(shù)1.87±0.82 1.60±0.71 0.77±0.561)1.31±0.49鼠數(shù)10 10 10 10

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.2.1 止眩方活性成分整理、篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)對(duì)止眩方中藥物成分進(jìn)行整理、篩選，得到活性成分共127個(gè)，對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)300個(gè)。

2.2.2 暈動(dòng)癥相關(guān)靶點(diǎn)及韋恩圖繪制整理得到暈動(dòng)癥疾病靶點(diǎn)1126 個(gè)。韋恩圖示止眩方與暈動(dòng)癥的共同靶點(diǎn)，共有130個(gè)。見圖1。

圖1 止眩方靶點(diǎn)與暈動(dòng)癥靶點(diǎn)韋恩圖

2.2.3 構(gòu)建藥物活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)止眩方的多種活性成分可作用于同一個(gè)靶點(diǎn)，而同一個(gè)靶點(diǎn)也可匹配多種活性成分。見圖2。

圖2 止眩方藥物活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

2.2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析利用STRING 11.5 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，并將靶點(diǎn)按照連接度從大到小排列，通過Cytoscape 3.7.1 軟件進(jìn)行可視化處理，得度值排名前三的靶點(diǎn)為信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（STAT3）、原癌基因c-Jun、絲裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）。見圖3。

圖3 止眩方預(yù)防暈動(dòng)癥靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

2.2.5 KEGG 分析KEGG 富集分析得到306 條信號(hào)通路，涉及絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-絲氨酸/蘇氨酸激酶（Akt）信號(hào)通路、Forkhead 轉(zhuǎn)錄因子（FoxO）信號(hào)通路等。見圖4。

3 討論

暈動(dòng)癥在中醫(yī)古籍中被稱為“注車”或“注船”?，F(xiàn)代中醫(yī)研究對(duì)預(yù)防和治療暈動(dòng)癥有不同的辨證方法，有研究對(duì)暈動(dòng)癥用藥規(guī)律總結(jié)發(fā)現(xiàn)生姜、陳皮、茯苓、白術(shù)等為防治暈動(dòng)癥的核心藥物，并依此提出痰濕中阻為暈動(dòng)癥的常見證候［5］。本研究基于“暈動(dòng)癥用藥規(guī)律探討”中的核心藥物，組成氣霧型止眩方并開展探索研究。除核心藥物外，止眩方中天麻的有效成分具有抗焦慮、抗暈眩作用［10］。薄荷的主要成分薄荷醇能通過抑制5-羥色胺（5-HT）的釋放，阻斷信號(hào)通過其離子通道進(jìn)入中樞，減輕嘔吐和暈動(dòng)癥導(dǎo)致的胃腸道反應(yīng)［11］。廣藿香中的廣藿香醇為鎮(zhèn)吐活性物質(zhì)，且先前研究證明止眩方能夠預(yù)防暈動(dòng)癥，為本次的研究奠定了理論基礎(chǔ)。

曠場實(shí)驗(yàn)、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)霧化吸入止眩方后，小鼠的活動(dòng)量和探究行為顯著增加（P＜0.05），表明止眩方具有良好預(yù)防暈動(dòng)癥作用。高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中陽性藥物組與空白對(duì)照組之間存在顯著差異的原因可能在于東莨菪堿產(chǎn)生的鎮(zhèn)靜作用［12］，需要通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步探究。暈反應(yīng)指數(shù)評(píng)價(jià)對(duì)小鼠在接受運(yùn)動(dòng)刺激后的自主神經(jīng)功能紊亂現(xiàn)象進(jìn)行量化分級(jí)，以評(píng)估暈反應(yīng)嚴(yán)重程度［13］。結(jié)果顯示，模型小鼠暈反應(yīng)指數(shù)相較其他組最高，霧化吸入高濃度止眩方組暈反應(yīng)指數(shù)最低，改善最明顯（P＜0.05）。綜上，霧化給予小鼠止眩方能夠預(yù)防暈動(dòng)癥。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究進(jìn)一步驗(yàn)證止眩方預(yù)防暈動(dòng)癥是多成分、多靶點(diǎn)相互作用的，其關(guān)鍵靶點(diǎn)可調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)育，在多種組織細(xì)胞損傷后修復(fù)中發(fā)揮作用，同時(shí)參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、分化和細(xì)胞周期進(jìn)展，響應(yīng)各種細(xì)胞外信號(hào)［14，15］。KEGG 通路分析可知，MAPK 信號(hào)通路與內(nèi)耳生理進(jìn)化過程密切相關(guān)，能調(diào)控細(xì)胞增殖、分化，且對(duì)維持機(jī)體的骨代謝平衡有重要作用［16，17］；PI3K-Akt 通路與FoxO 通路共同參與調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞增殖、分化及凋亡，且能抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)［18］。以上多種途徑為止眩方的深入研究提供了方向。然而，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)各數(shù)據(jù)庫檢索以口服為主，經(jīng)鼻腔給藥的研究較少，而本研究中的藥物采用霧化吸入，因此其確切作用機(jī)制仍待后期進(jìn)一步驗(yàn)證。