酶聯(lián)免疫法快速檢測大批量馬鈴薯病毒

崔 健，崔雅琦，劉智慧，俎愛忠，韓勝利

（1.烏蘭察布市種業(yè)工作站，內(nèi)蒙古烏蘭察布 012000；2.北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，北京 100083；3.烏蘭察布市檢驗檢測中心，內(nèi)蒙古烏蘭察布 012000；4.豐鎮(zhèn)市農(nóng)牧和科技局，內(nèi)蒙古豐鎮(zhèn) 012100）

內(nèi)蒙古自治區(qū)烏蘭察布市氣候冷涼，晝夜溫差大，無霜期95～145 d，十分適宜馬鈴薯種薯生產(chǎn)。全市約有13 家種薯企業(yè)，建有馬鈴薯脫毒組培室25 000 m2，合格種薯田約3.33 萬hm2［1，2］。馬鈴薯在生產(chǎn)上通常采用塊莖進行無性繁殖，長期的無性繁殖會導(dǎo)致病毒累積和延續(xù)，降低種性，嚴(yán)重影響馬鈴薯的產(chǎn)量和品質(zhì)［3］。

已報道感染馬鈴薯的病毒達到35 種以上，其中危害嚴(yán)重的有6 種，包括馬鈴薯重花葉病毒（PVY）、馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）、馬鈴薯M 病毒（PVM）、馬鈴薯S 病毒（PVS）、馬鈴薯A 病毒（簡稱PVA）、馬鈴薯輕花葉病毒（簡稱PVX）［4］。大面積的種薯生產(chǎn)需要進行大批量檢驗檢測，實現(xiàn)高效快速的病毒檢測是亟待解決的問題。

應(yīng)用于馬鈴薯病毒檢測的常規(guī)方法有DASELISA 法、RT-PCR 法。由于RT-PCR 法對實驗室環(huán)境要求高且試驗費用較高，對基層企業(yè)造成經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，所以沒有在烏蘭察布市馬鈴薯種薯企業(yè)中大規(guī)模應(yīng)用；DAS-ELISA 法靈敏度高、特異性好，具有很強的應(yīng)用性。根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB 18133—2012《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)馬鈴薯種薯》要求檢測馬鈴薯種薯病毒，雖有文獻報道應(yīng)用DAS-ELISA 法［4］，但是該方法的檢測時間仍然較長。因此，建立一種可靠的、高效的快速檢測6 種主要馬鈴薯病毒的方法對馬鈴薯生產(chǎn)發(fā)展具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 馬鈴薯PVA、PVM、PVX、PLRV、PVY、PVS 病毒檢測試劑盒采用Agdia 480 孔，購自北京中檢葆泰生物技術(shù)有限公司。6 種病毒酶標(biāo)抗體使用液：5×ECI 緩沖液稀釋至1 倍。底物（PNP）緩沖液：5×底物緩沖濃縮液稀釋至1 倍。

1.1.2 主要儀器和樣品 酶標(biāo)儀（Infinite F50）；組織研磨儀（MiniBeadbeater-96）；多種規(guī)格移液器（Eppendorf Research plus）；取樣器（孔徑為0.8 cm 的打孔器）；95%氧化鋯研磨珠（規(guī)格：1、2 mm）；2 mL離心管；離心機；恒溫?fù)u床。

樣品：取烏蘭察布市部分種薯企業(yè)庫中的種薯，溫室大棚種植，待苗高15 cm 時取植株葉片。

1.2 方法

1.2.1 取樣 將馬鈴薯葉片樣品編號，將開蓋且對應(yīng)編號的離心管置于單孔打孔器下部，植株葉片置于打孔器正中間，按下打孔器，形成2 個0.8 mm 圓形葉片，重量約0.2 g，放置在研磨袋中，置于4 ℃冰箱中冷藏備用。每次取樣對打孔器接觸葉片區(qū)域用75%乙醇進行消毒處理。

1.2.2 制樣 向含有樣品的離心管中加入9粒1 mm和3 粒2 mm 的氧化鋯研磨珠，實踐證明，不同規(guī)格的研磨珠有利于提高研磨速度和效果。離心管置于48 孔夾具，水平振蕩20 s。輕拍離心管蓋，使研磨珠和已粉碎的組織到離心管底部，加入1 mL 提取液，混勻（常規(guī)法為研磨袋中加入1 mL 提取液，研磨棒研磨，汁液倒入已編號的離心管內(nèi)［4］）。4 000 r/min離心3 min 備用，取已包被好6 種病毒的酶聯(lián)板，向?qū)?yīng)板每孔加入100 μL 樣品上清液。設(shè)置陰性、陽性、空白對照孔。將酶聯(lián)板用6 號自封袋封好，置于37 ℃恒溫?fù)u床振搖孵育30 min［5］（常規(guī)法在4 ℃冰箱過夜或37 ℃靜止孵育4 h［6］）。

1.2.3 制備酶標(biāo)抗體、孵育 倒空酶聯(lián)板，加入200 μL 的洗液（1×PBST 緩沖液），浸泡1～3 min，快速倒出，在吸水紙上拍干孔中殘留洗液，重復(fù)6 次。加入100 μL 6 種病毒酶標(biāo)抗體使用液。

1.2.4 加PNP 底物溶液、孵育 將酶聯(lián)板用6 號自封袋封好，37 ℃恒溫?fù)u床振搖孵育30 min（常規(guī)法為25 ℃靜止孵育2 h［3］）。孵育結(jié)束前10 min 準(zhǔn)備底物（PNP）緩沖液，5 mL 底物（PNP）緩沖液溶解1 片PNP底物片，倒空酶聯(lián)板，重復(fù)步驟。向各反應(yīng)孔中加入100 μL PNP 底物溶液（該步驟應(yīng)快速完成，以保證顯色時間一致），酶聯(lián)板在20～25 ℃避光孵育60 min。底物緩沖液內(nèi)含疊氮化鈉（NaN3），做好防護。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯種薯葉片病毒的測定

取372 份馬鈴薯種薯葉片樣品，分別采用常規(guī)方法、優(yōu)化方法檢測6 種主要馬鈴薯病毒PVA、PVM、PVX、PLRV、PVY、PVS。直接用肉眼觀察顯色情況，并用酶標(biāo)儀在405 nm 波長處測定吸光度（OD）數(shù)值。其中，93 份馬鈴薯種薯葉片樣品的PVY 檢測結(jié)果（OD405nm）見表1、表2。

表1 采用常規(guī)方法測定93 份馬鈴薯種薯葉片樣品的PVY（OD405 nm）

表2 采用優(yōu)化方法測定93 份馬鈴薯種薯葉片樣品的PVY（OD405 nm）

采用常規(guī)方法測定馬鈴薯葉片的病毒，得到樣品中PVA、PVM、PVX、PLRV、PVS 的OD405nm均在各自陰性對照OD405nm以下，說明該供試樣品沒有感染以上5 種病毒，該批樣品脫毒效果好。由表1 可知，供試馬鈴薯葉片樣品的PVY 陰性對照OD405nm為0.168 5，而2 倍于OD405nm為0.337 0，樣品OD405nm≥2倍陰性對照值，則判斷為感染馬鈴薯病毒病［5］。凡是高于其2 倍值的均為陽性樣品，試驗樣品中C12的OD405nm為2.743 8，E11 的OD405nm為3.012 0，接近陰性對照的2 倍值。通過肉眼觀察，C12 和E11 檢測液顯色為黃色。結(jié)果表明，樣品C12 和E11 感染了馬鈴薯病毒PVY。

采用優(yōu)化方法測定馬鈴薯葉片的病毒，得到樣品中PVA、PVW、PVX、PLRV、PVS 的OD405nm均在各自陰性對照OD405nm以下，說明該供試樣品沒有感染以上5 種病毒，該批樣品脫毒效果好，與常規(guī)法檢測結(jié)果一致。

由表2 可知，供試馬鈴薯葉片樣品的PVY 陰性對 照OD405nm為0.160 7，2 倍 于OD405nm為0.321 4。樣品OD405nm≥2 倍陰性對照值，則判斷為感染馬鈴薯病毒病［5］。93 份馬鈴薯葉片樣品中，只有C12 的OD405nm為2.670 2，E11 的OD405nm為2.985 0，二者接近陰性對照的2 倍值。通過肉眼觀察，C12 和E11 顯色為黃色。結(jié)果表明，C12 和E11 樣品感染了馬鈴薯病毒PVY。與常規(guī)檢測法比較，優(yōu)化方法可以檢出C12 和E11 均感染馬鈴薯病毒PVY，且測定OD405nm值基本一致，即陽性率一致，結(jié)果可靠，說明該方法可行。

2.2 馬鈴薯種薯葉片病毒測定用時用工比較

取288 份馬鈴薯種薯葉片樣品，分別采用常規(guī)方法、優(yōu)化方法檢測馬鈴薯病毒PVY，比較測樣時間、用工，結(jié)果見表3。由表3 可知，采用常規(guī)法檢測馬鈴薯病毒PVY 總用時22 h，需要8 人共同完成，而采用優(yōu)化法檢測總用時10 h，需要5 人共同完成。結(jié)果表明，利用優(yōu)化方法進行大批量馬鈴薯種薯病毒檢測，可以縮短工作時間，提高工作效率，減少人工勞力成本。

表3 不同方法測定288 份馬鈴薯種薯葉片樣品PVY 用工用時的比較

3 小結(jié)

馬鈴薯病毒病的防治主要是利用脫毒種薯，在脫毒種薯生產(chǎn)過程中，對病毒進行快速、準(zhǔn)確的檢測是保證種薯質(zhì)量的關(guān)鍵［7］。馬鈴薯病毒病是國家標(biāo)準(zhǔn)GB18133—2012（馬鈴薯種薯）中規(guī)定的重要質(zhì)量指標(biāo)，其中，馬鈴薯重花葉病毒（PVY）和馬鈴薯卷葉病毒是（PLRV）是影響種薯質(zhì)量的關(guān)鍵因素［8，9］。在馬鈴薯種薯質(zhì)量檢驗檢測中，由于酶聯(lián)免疫（DASELISA）方法具有靈敏度高、穩(wěn)定性強、操作便捷的優(yōu)點，檢測結(jié)果受到種薯生產(chǎn)企業(yè)、檢測機構(gòu)、薯業(yè)界的廣泛認(rèn)可［10］。本研究建立了一種快速檢測馬鈴薯病毒的方法。研究表明，采用優(yōu)化方法進行檢測，快速、高效、省時省力，適用于檢測大批量馬鈴薯種薯樣品中的6 種主要馬鈴薯病毒。