低溫條件下恩諾沙星的微生物降解研究

蘇一鳴,王英剛,藺 昕,李曉軍

(1.沈陽大學環(huán)境學院,遼寧 沈陽 110044;2.中國科學院沈陽應用生態(tài)研究所,遼寧 沈陽 110016)

恩諾沙星(enrofloxacin,ENR)是一種人工合成的動物專用喹諾酮類抗生素,具有抗菌譜廣、活性強等特點,常用于畜禽感染性疾病的預防和治療。進入畜禽體內的抗生素不會被全部吸收,約有30%～90%會隨著尿液或糞便排出至環(huán)境中[1]。ENR是一種兩性分子(pKa1=5.88～6.06,pKa2=7.70～7.74)[2],正常環(huán)境下亨利定律常數(shù)極低,揮發(fā)損失可忽略不計,但其辛醇-水分配系數(shù)(Kow)較低,易在土壤中積累和遷移,檢出率高,威脅生態(tài)系統(tǒng)安全[3]。研究發(fā)現(xiàn),在我國畜禽糞便中最常檢出的抗生素為喹諾酮類,其中豬糞中ENR平均檢出含量達4.68 mg·kg-1[4]。我國農(nóng)田土壤中ENR的檢出率高,殘留含量范圍為0～1 347.6 μg·kg-1,均值介于0～99.4 μg·kg-1之間[5],最大值接近澳大利亞農(nóng)田土壤標準值(370 μg·kg-1)的4倍[6]。長三角典型城郊地區(qū)農(nóng)田、林地和園地的ENR檢出率高達70%以上,農(nóng)田的檢出率達100%[7]。邰義萍等[8]調查了東莞市18個區(qū)鎮(zhèn)24個代表性蔬菜基地土壤中喹諾酮類抗生素的含量,結果表明4種喹諾酮類抗生素的檢出率均在90%以上,以恩諾沙星(平均含量19.85 μg·kg-1)為主,部分含量超過了抗生素生態(tài)毒害效應觸發(fā)值(100 μg·kg-1)。邰義萍等[9]研究珠江三角洲地區(qū)長期施用糞肥的無公害蔬菜生產(chǎn)基地發(fā)現(xiàn),土壤中喹諾酮類抗生素平均含量為17.99 μg·kg-1,恩諾沙星的檢出率為100%,平均含量為3.52 μg·kg-1。

我國北方地區(qū)秋冬季氣溫低,持續(xù)時間長,較大限制了中高溫菌的應用,因此增強低溫降解菌的研究對于低溫地區(qū)的土壤抗生素污染治理具有重要意義。邢慧珍[15]研究發(fā)現(xiàn),菌株SDF-25的最適生長溫度為10～16 ℃,10 ℃培養(yǎng)15 d后秸稈降解率為39.5%,16 ℃時達44.9%。郭平[16]篩選出6株低溫石油降解菌,均能在0 ℃降解石油烴,其中菌株Rhodococcussp.在0 ℃、原油初始質量濃度為5 g·L-1、菌液接種量φ=10%條件下降解60 d后生物降解率可達52.6%±2.0%。畜禽糞便堆放地土壤通常具有較高的含鹽量和抗生素含量,因此篩選耐鹽的恩諾沙星降解菌十分必要,目前關于適應北方低溫耐鹽環(huán)境的恩諾沙星降解菌還鮮見報道。

筆者以污染土壤中常見的喹諾酮類抗生素—恩諾沙星為目標污染物,利用低溫地區(qū)畜禽糞便堆放地土壤,篩選出恩諾沙星低溫高效降解菌,在明確降解菌的生長和降解特征基礎上,研究低溫對菌株生長和恩諾沙星降解能力的影響,為適用于北方低溫地區(qū)抗生素污染土壤生物修復技術的構建提供基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1試劑與培養(yǎng)基

無機鹽(MSM)培養(yǎng)基:1 L水、1 g (NH4)2SO4、1 g KHPO4、1 g K2HPO4、0.5 g NaCl、0.05 g FeC13·6H20、0.02 g CaC12·H2O、0～10 g葡萄糖,pH值為7.2～7.4。LB培養(yǎng)基:1 L水、10 g胰蛋白胨、5 g酵母粉、10 g NaCl,pH值為7.2～7.4(固體培養(yǎng)基加20 g瓊脂)。

恩諾沙星儲備液:準確稱取恩諾沙星標準品0.010 0 g,用V(乙腈)∶V(水)=1∶1超聲溶解并定容于100 mL容量瓶中,配制成ρ為100 mg·L-1的恩諾沙星標準液,在-20 ℃冰箱中避光保存,1個月內使用[17]。實驗中用到的各濃度梯度標準液(5～500 μg·L-1)均用甲醇(φ=1%甲酸)稀釋。

1.1.2低溫恩諾沙星降解菌的篩選

考慮到高緯度和高海拔地區(qū)的低溫特點,采集遼寧省海城市和青海省西寧市某畜禽養(yǎng)殖場糞便堆放區(qū)土壤,應用梯度馴化培養(yǎng)技術,分離篩選出低溫高效恩諾沙星降解菌。

稱取1.5 g冷鮮土樣置于裝有30 mL無機鹽(MSM)培養(yǎng)基的錐形瓶中,按φ=5%接種量進行梯度馴化培養(yǎng),將恩諾沙星儲備液稀釋至10 mg·L-1后,加入培養(yǎng)基各0.3、0.6、1.2、2.4 mL,使培養(yǎng)基中恩諾沙星濃度分別為100、200、400、800 μg·L-1,15 ℃、150 r·min-1避光振蕩,依次培養(yǎng)5 d。經(jīng)4次梯度培養(yǎng)后,選擇800 μg·L-1濃度下能夠耐受恩諾沙星的混合菌液轉接到含有800 μg·L-1恩諾沙星的固體LB培養(yǎng)基上進行劃線培養(yǎng),15 ℃避光條件下每隔5 d對生長出來的微生物進行轉接,共轉接6次,使得培養(yǎng)基中菌株得以分離純化,最終獲得若干單一菌株。

將分離純化的單一菌株以5%接種量接種到恩諾沙星含量為500 μg·L-1的MSM培養(yǎng)基中進行降解實驗,15 ℃、150 r·min-1避光振蕩培養(yǎng)5 d,測定培養(yǎng)基中恩諾沙星的含量,最終篩選出4株恩諾沙星高效降解菌Z、H5、H35、Y用于后續(xù)實驗。

上述菌株經(jīng)上海生物工程有限公司鑒定,Z為普羅威登斯菌屬(Providenciasp.),H5為腸桿菌屬(Enterobactersp.),H35為普羅威登斯菌屬(Providenciasp.),Y為產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenessp.)。

1.2 菌株生長和降解特征

1.2.1菌株的生長曲線

向50 mL LB液體培養(yǎng)基中加入4種菌懸液2.5 mL(不投加恩諾沙星),15 ℃、150 r·min-1避光振蕩培養(yǎng)6 d,分別在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、48、72、96、120、144 h[14]取樣測定菌液濃度OD600。

1.2.2pH值對菌株生長的影響

針對4種菌株,向20 mL LB液體培養(yǎng)基中加入菌懸液各1 mL,每株菌利用HCl或NaOH溶液再設置不同的pH值處理(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0),每種處理均設置3個重復,15 ℃、150 r·min-1避光振蕩培養(yǎng),由菌株生長曲線可知,培養(yǎng)72 h菌液OD600達到峰值,因此培養(yǎng)3 d后取樣測定4種菌株在不同pH值處理濃度菌液下的OD600。

1.2.3菌株對恩諾沙星的降解能力

考慮到北方秋冬季氣溫在10 ℃以下,因此測定8 ℃環(huán)境下菌株對恩諾沙星的降解能力。向50 mL液體LB培養(yǎng)基中加入恩諾沙星標準儲備液0.25 mL,使恩諾沙星的濃度為500 μg·L-1,再加入4種菌懸液2.5 mL,8 ℃、150 r·min-1避光振蕩培養(yǎng)14 d,為排除細菌吸附作用對恩諾沙星濃度的影響,分別設置不接菌的培養(yǎng)基和滅活菌液的對照處理,分別在0、2、4、6、8、10、12、14 d取樣測定培養(yǎng)基中恩諾沙星的含量,每個處理設置3個重復。

1.3 低溫對菌株生長及其對恩諾沙星降解能力的影響

1.3.1低溫對菌株生長的影響

向20 mL液體LB培養(yǎng)基中加入4種菌懸液1 mL,在4、8、15 ℃溫度下,150 r·min-1避光振蕩培養(yǎng)15 d,分別在0、1、3、6、9、12、15 d取樣測定菌液濃度OD600,直到菌株死亡,每種處理設置3個重復。

1.3.2低溫對菌株恩諾沙星降解能力的影響

鑒于實際水體中恩諾沙星的檢出量多在500 μg·L-1以下,因此選擇500 μg·L-1為恩諾沙星初始濃度。向20 mL液體LB培養(yǎng)基中加入恩諾沙星標準儲備液0.1 mL,使恩諾沙星的質量濃度為500 μg·L-1,再加入4種菌懸液1 mL,分別在4、8、15 ℃溫度下150 r·min-1避光振蕩培養(yǎng),不接菌的空白培養(yǎng)基作為對照。

由低溫對菌株生長的影響結果可知,4種菌液在培養(yǎng)14 d時菌液濃度OD600達到峰值,對恩諾沙星的降解效果最好,因此選在第14天取樣測定培養(yǎng)基中恩諾沙星的濃度,每個處理設置3個重復。

1.4 樣品檢測與分析

菌液濃度(OD600)測定:用分光光度計測定細菌培養(yǎng)液在600 nm處的吸光值(OD600)。OD600超過1,則稀釋適當倍數(shù)后測定。

樣品前處理:實驗樣品取樣測定時,取1 mL搖勻的待測菌液,用0.22 μm孔徑無菌濾膜過濾至1.5 mL液相進樣瓶中,避光保存于-20 ℃冰箱。

恩諾沙星濃度測定:利用超高效液相-三重四級桿質譜聯(lián)用儀(Triple Quad 5500+ QTRAP Ready,美國AB SCIEX)進行測定[18]。

色譜條件:采用Ailent Eclipse Plus C18(1.9 μm,150 mm×2.1 mm)色譜柱,柱溫40 ℃,柱平衡時間 30 min,流速0.4 mL·min-1,進樣量10 μL。流動相為5 mmol·L-1乙酸銨溶液(含1%甲酸)-乙腈,梯度為0～0.5 min (98%A相,2%B相)、0.5～3.0 min(98%A相,2%B相)、3.0～5.0 min(2%A相,98%B相)、5.0～5.1 min(2%A相、98%B相)、5.1～8.0 min(98%A相、2%B相)。

質譜條件:采用三重四級桿質譜檢測器、電噴霧離子源(ESI)、多反應離子監(jiān)測(MRM)模式。輔助氣體55 mL·min-1,噴霧電壓5 500 V,氣簾30 mL·min-1,蒸汽溫度550 ℃,恩諾沙星母離子m/Z為360.6,子離子m/Z為316.4/245.4,碰撞電壓20/27 V,錐孔電壓45 V。

在5～500 μg·L-1濃度范圍內基準曲線的R2>0.99,回收率測定采用實際樣品加標的回收率,測得加標回收率為92.1%,相對標準偏差(RSD)低于1%,空白對照組中均未檢出恩諾沙星。

1.5 數(shù)據(jù)處理方法

恩諾沙星降解率(R)計算公式為

R=(C0-C)/C0×100%。

(1)

式(1)中,C為接菌處理的恩諾沙星濃度,μg·L-1;C0為不接菌對照處理的零時恩諾沙星濃度,μg·L-1。

運用單因素方差分析(ANOVA)比較各數(shù)據(jù)間的差異性,所有統(tǒng)計分析均在SPSS 26.0中完成,運用Origin 8.5進行圖表繪制,圖表中數(shù)據(jù)為平均值+標準差。

2 結果與分析

2.1 菌株的特征

2.1.1菌株的生長特征

圖1表明了4種菌株在15oC條件下培養(yǎng)的生長過程差異。4種菌株的生長過程均經(jīng)歷先上升后達到穩(wěn)定的過程,同一菌株不同培養(yǎng)時間OD600具有顯著性差異(P<0.05)。不同菌株達到穩(wěn)定的時間存在差異,H35和H5菌生長極為迅速,8 h接近穩(wěn)定期,OD600分別達到峰值1.799和1.909,隨后略有下降,但兩者間無顯著性差異(P>0.05);Z菌初期生長速率顯著低于H35和H5(P<0.05),22～48 h接近穩(wěn)定期,OD600達到峰值1.82;Y菌培養(yǎng)初期生長速率極為緩慢,OD600顯著低于其他3株菌(P<0.05),48～72 h接近穩(wěn)定期,OD600達到峰值2.483,顯著高于其他3株菌(P<0.05),隨后略有下降。

圖1 4種菌株的生長曲線

2.1.2培養(yǎng)基pH值對菌株生長的影響

圖2表明了pH值對4種菌株生長的影響。在pH =5.0～9.0范圍內,H35、H5的生長不受pH值的影響,OD600值在不同pH值間無顯著性差異(P>0.05)。H5的生長狀況優(yōu)于H35,其OD600值顯著高于H35。Z更適于中性偏堿性環(huán)境,其OD600值在pH>6的處理之間無顯著差異,在酸性環(huán)境中的OD600值顯著低于堿性環(huán)境,且pH值越低,其OD600值越低。Y更適于中性環(huán)境,其在pH =7.0時生長良好,OD600達到2.013,酸性和堿性環(huán)境中的OD600值顯著小于pH=7時的OD600值,且堿性越強,受抑制程度越強。

直方柱上方英文大寫字母不同表示同一菌株不同pH值間OD600差異顯著(P<0.05);英文小寫字母不同表示同一pH值不同菌株間OD600差異顯著(P<0.05)。

2.2 菌株對恩諾沙星的降解

圖3表明了8 ℃條件下滅活菌株的對照組對恩諾沙星的吸附能力,隨著培養(yǎng)時間的增加,滅活后的H5和Y對恩諾沙星的吸附率具有顯著差異(P<0.05),Z和H35對恩諾沙星的吸附率則無顯著變化,其中H35在培養(yǎng)2 d達到峰值2.81%?？梢钥闯?14 d培養(yǎng)過程中4種菌株對恩諾沙星的吸附作用并不明顯。

直方柱上方英文大寫字母不同表示同一菌株不同降解時間吸附率差異顯著(P<0.05);英文小寫字母不同表示同一降解時間不同菌株間吸附率差異顯著(P<0.05)。

4種菌株對恩諾沙星具有較好的降解能力,對恩諾沙星的降解率隨培養(yǎng)時間的增長呈上升趨勢。圖4表明了8 ℃條件下4種菌株對恩諾沙星的降解過程。在14 d培養(yǎng)過程中,不接菌對照處理中恩諾沙星含量有所下降,14 d自降率為22.8%。Z、H5、Y對恩諾沙星的降解率在12 d達到最高,分別為49.6%、47.9%和48.1%;H35對恩諾沙星的降解率則在14 d達到最高,為56.5%,顯著高于其他3株菌(P<0.05)。可以看出,在整個降解過程中Z和H35對恩諾沙星具有更好的降解能力,其中Z在培養(yǎng)的前期降解能力更強,而H35在培養(yǎng)的后期降解能力不斷提升。

直方柱上方英文大寫字母不同表示同一菌株不同降解時間降解率差異顯著(P<0.05);英文小寫字母不同表示同一降解時間不同菌株間降解率差異顯著(P<0.05)。

2.3 低溫對菌株生長及恩諾沙星降解的影響

2.3.1不同低溫條件下菌株的生長情況

與圖2的生長曲線對比可知,恩諾沙星抑制了菌株的生長。4株菌在4～15 ℃的溫度范圍內均能生長,但低溫會在生長前期顯著抑制微生物生長。溫度越低,菌株前期生長越緩慢。15 ℃條件下4株菌生長迅速,0～9 d的菌密度顯著高于8和4 ℃。9 d 以后4株菌不同溫度之間的生長狀況趨于一致(圖5)。

圖5 低溫對4種菌株生長的影響

不同菌株對低溫的響應特征不同。Y和Z生長特征趨于一致,4和8 ℃條件下生長速度均顯著低于15 ℃。12 d時3個溫度條件下的菌密度趨于一致。H35和H5不同溫度下的生長規(guī)律相似,但3個溫度下H35的OD600均在9 d達到最大值,隨后持續(xù)下降,且3個溫度下的OD600依然存在顯著差異(15 ℃>8 ℃>4 ℃);而H5的OD600值在15、8和4 ℃達到峰值的時間點分別為9、12和14 d,12 d后15和8 ℃的OD600值無顯著差異。

2.3.2不同低溫條件下恩諾沙星的降解情況

圖6表明不同低溫條件培養(yǎng)14 d后菌株對恩諾沙星的降解情況(不包含自然降解率)。4、8、15 ℃條件下無菌對照組恩諾沙星的自然降解率分別為10.9%、22.8%、40.6%,說明低溫抑制了恩諾沙星的非生物降解,同時低溫顯著抑制了菌株對恩諾沙星的降解效果,溫度越低降解效果越差。但即使在低溫情況下,菌株對恩諾沙星依然有降解效果。4 ℃條件下,Z、H5、H35和Y對恩諾沙星的降解率在14 d達到峰值,分別為33.4%、42.1%、38.1%和34.3%。

直方柱上方英文大寫字母不同表示同一菌株不同溫度條件降解率差異顯著(P<0.05);英文小寫字母不同表示同一溫度條件不同菌株間降解率差異顯著(P<0.05)。

3 討論

3.1 菌株的特征

要實現(xiàn)污染物的微生物降解,微生物必須具備2個條件:能夠接觸到污染物和能夠降解污染物。而要實現(xiàn)持續(xù)高效降解,則需要微生物降解目標污染物的效率高并保持足夠的量。研究結果表明,15 ℃條件下H35、H5生長極為迅速,8 h接近穩(wěn)定期,OD600達到峰值,隨后略有下降。向培養(yǎng)基投加500 μg·L-1恩諾沙星后明顯抑制了菌株的生長。H35菌培養(yǎng)9 d后OD600達到峰值2.84,顯著高于其他3株菌。

要實現(xiàn)高效降解微生物的現(xiàn)場應用,構建合適的復合菌劑是低溫條件下提高降解效率的有效途徑[19]。研究發(fā)現(xiàn),H35、H5菌的生長趨勢相似,存在拮抗關系;但兩者與Z和Y菌的生長速率具有差異性,且均能在低溫下生長,對恩諾沙星耐性良好。韓婉雪等[20]研究發(fā)現(xiàn),畜禽糞便堆放地土壤屬于中性或偏堿環(huán)境。該研究的目的是篩選出適于該環(huán)境的降解菌,同時明確篩出菌對pH值的適應區(qū)間。結果表明,在pH =5.0～9.0時,H35、H5的生長不受pH值的影響,Z更適于中性偏堿性環(huán)境,Y更適于中性環(huán)境,說明4種低溫菌株在畜禽污染場地具有應用潛力。因此,可以考慮將H35、Z、Y菌組合成復合菌系,以達到對恩諾沙星更好的降解效果。

過去關于微生物降解恩諾沙星的研究多適用于常溫條件。梅瀚杰等[21]研究發(fā)現(xiàn),菌株BSFL-3在33.6 ℃、初始pH =5.8、接種量4%、155 r·min-1條件下可使恩諾沙星的降解率達到77.83%±0.53%。潘蘭佳等[22]利用嗜熱菌Thermussp.C419在高溫(70 ℃)條件下降解2種典型的喹諾酮類抗生素(諾氟沙星和恩諾沙星),降解率為60%～80%。谷雪維[23]研究發(fā)現(xiàn),周叢生物膜對于恩諾沙星具有良好去除效果,去除率均在90%以上。王振方等[24]以綠藻門的膠網(wǎng)藻(Dictyosphaeriumsp.)為對象,通過12 d室內培養(yǎng)實驗,發(fā)現(xiàn)膠網(wǎng)藻對于恩諾沙星的去除具有顯著促進作用?？梢钥闯?目前針對低溫條件下的恩諾沙星降解菌還不多見。在該研究中,篩選出的4株菌在8 ℃時對恩諾沙星均有較好的降解能力。對恩諾沙星的降解率隨培養(yǎng)時間的增長呈上升趨勢,Z、H5、Y對恩諾沙星的降解率在12 d時達到最高,分別為26.8%、15.1%、25.3%;H35對恩諾沙星的降解率則在14 d時達到最高,為33.7%。4 ℃條件下,Z、H5、H35和Y對恩諾沙星的降解率在14 d時達到峰值,分別為22.5%、31.2%、27.2%和23.4%。

3.2 低溫對菌株生長及恩諾沙星降解的影響

溫度是影響菌株生長和菌株發(fā)揮降解作用的重要因素,尤其在高緯度地區(qū)溫度嚴重影響著微生物的降解速率。目前在微生物修復中高溫菌占主體,而在我國北方地區(qū)寒冷而漫長的冬季,低溫會強烈抑制中高溫菌對污染物的降解效率。低溫顯著抑制了菌株對恩諾沙星的降解效果,溫度越低降解效果越差,但即使在4 ℃條件下,與不接菌對照相比,菌株對恩諾沙星依然有降解效果。許多學者也從其他低溫環(huán)境中分離出低溫降解菌,馬文成等[25]從冬季活性污泥中篩選得到具有高生物活性的耐冷細菌,張鑫等[26]篩選得到的復合菌系M44在15 ℃條件下能夠高效降解玉米秸稈。ERIKSSON等[27]從2個北極土樣和2個高緯度北方土樣中分離出對有機物具有高效降解率的優(yōu)勢菌株。以上結果表明,增強低溫降解菌的研究對于我國低溫地區(qū)的土壤污染治理具有重要意義。

4 結論

微生物降解可以有效降低抗生素生態(tài)環(huán)境風險。低溫微生物對恩諾沙星具有降解作用,即使在4 ℃條件下,4株菌對恩諾沙星的降解率依然達到20%以上,但總體隨著溫度降低降解效果削弱。其中Z菌株和H35菌株在低溫條件下(4～15 ℃)對恩諾沙星具有更好的降解能力,Z在培養(yǎng)前期降解能力更強,而H35在培養(yǎng)后期降解能力不斷提升,這為我國北方和高緯度地區(qū)抗生素污染土壤修復提供了一定的技術支撐。