南天竹根HPLC 指紋圖譜建立及其成分分析

吳志瑰，劉 婧，高雅柔，黃 瀟，闞 瑞，彭財英，付小梅*，裴建國，劉應蛟，李 玲，張 舟，李紫微，夏紫微

（1.江西中醫(yī)藥大學藥學院，江西 南昌 330004； 2.范崔生全國名中醫(yī)傳承工作室，江西 南昌 330006；3.江西中醫(yī)藥大學資產處，江西 南昌 330004）

南天竹為常綠灌木，嫩葉或冬季葉呈紅色，作為南方行道綠化植物或庭院觀賞植物而被大量栽培［1］。南天竹根藥用最早見于《本草綱目拾遺》，又名土黃連、山黃連、山黃芩等，《福建中草藥》《廣西中藥志》 《湖南藥物志》 《重慶草藥》 等記載其作為民間草藥用，主治肺熱咳嗽、百日咳、濕熱黃疸、食積腹瀉、風濕痹痛等［2］。

邱志潔等［3］對南天竹根浸液的急性毒理進行研究，每日最大給藥劑量為122.4 g/kg （相當于臨床用量的195.8 倍），小鼠生存狀況良好，未出現明顯的致毒反應，表明南天竹根的使用安全可靠。課題組對南天竹根的生藥學及其藥理作用進行研究，發(fā)現南天竹根對As2O3所致的肝、腎臟毒性有較好的保護作用，是拮抗As2O3毒性的新的優(yōu)勢資源［4-7］。南天竹根在民間應用廣泛，但其發(fā)揮藥效的化學成分不明確，有效成分的含量測定報道極少。本實驗對12 個產地南天竹根指紋圖譜及總生物堿、小檗堿含量進行研究，同時采用UPLC-QTOF-MS/MS 法對南天竹根的總提取物進行化學成分鑒定，為其質量標準的建立提供依據，為其藥效作用及臨床應用提供物質基礎。

1 材料

12 批南天竹根（S1 ～S12） 產于江西、山東、重慶等地，經江西中醫(yī)藥大學付小梅教授鑒定為南天竹NandinadomesticaThunb.的干燥根，憑證標本保存于江西中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室。

KQ-250 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）； Waters e2695 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）； HH-4 型數顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）； DLSB-5/20 型低溫冷卻液循環(huán)泵（杭州康雨醫(yī)療器械有限公司）； S224S 型電子天平［賽多利斯科學儀器（北京） 有限公司］；116 型搖擺式粉碎機（瑞安市永歷制藥機械有限公司）； UV-2100 型紫外分光光度儀（上海美譜達儀器有限公司）； Nexera UPLC LC-30A 型超高效液相色譜儀（日本島津公司）； Triple TOF 5600＋型四極桿飛行時間質譜儀（美國AB Sciex 公司）。

小檗堿對照品（純度98.8%，合肥博美生物科技有限責任公司）。氫氧化鈉、溴甲酚綠（天津市化學試劑研究所有限公司）。色譜純甲醇、乙腈（德國Merck 公司）； 分析純甲醇、乙酸、三乙胺（國藥集團化學試劑有限公司）。

2 方法與結果

2.1 HPLC 指紋圖譜建立 參考文獻［8］ 報道。

2.1.1 色譜條件 Agilent ODS-A 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動相乙腈 （A） -0.2% 乙酸（三乙胺調pH 至5.0） （B），梯度洗脫 （0 ～10 min，10% ～13%A； 10～17 min，13%A； 17 ～18 min，13% ～23% A； 18 ～33 min，23% A； 33 ～45 min，23% ～65%A； 45～60 min，65% ～74%A）； 體積流量1 mL/min； 柱溫30 ℃； 檢測波長365 nm；進樣量2 μL。

2.1.2 供試品溶液制備 將南天竹根置于50 ℃烘箱中干燥，粉碎，過3 號篩，取0.5 g，加入25 mL 甲醇，稱定質量，超聲處理30 min，甲醇補足減失的質量，搖勻，濾紙過濾，取續(xù)濾液，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.1.3 精密度試驗 按“2.1.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得小檗堿峰面積RSD 為0.34%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗 按“2.1.2” 項下方法制備供試品溶液，于0、1、3、5、12、24 h 在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得小檗堿峰面積RSD 為0.88%，表明溶液在24 h 內穩(wěn)定性良好。

2.1.5 重復性試驗 精密稱取同一產地南天竹根粉末6 份，按“2.1.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得小檗堿峰面積RSD 為0.50%，表明該方法重復性良好。

2.1.6 圖譜生成 按“2.1.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A） ” 設置第9 批樣品為參照，時間窗寬度為0.1，剪切前5 min 溶劑峰后，采用多點校正后進行自動匹配，得到共有指紋圖譜（圖1），相似度見表1。由此可知，12 批樣品中有9 個共有峰，保留時間RSD均小于1%，相似度在0.920 ～0.996 之間，并且確認了其中5 個共有峰，即1 號峰為金罌粟堿，2 號峰 為 1-hydroxy-2，9，10-trimethoxy-7H-dibenzo［de，g］ quinolin-7-one，5 號峰為去氫南天寧堿，7 號峰為南天竹寧堿，8 號峰為小檗堿。

表1 相似度測定結果Tab.1 Results of similarity determination

圖1 12 批南天竹根HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints for twelve batches of Nandinae Radix

2.2 成分鑒定 采用UPLC-Q-TOF-MS/MS 法。

2.2.1 色譜條件 YMC-Ultra HT Pro C18色譜柱（100 mm×2.0 mm，2 μm）； 流動相0.1%甲酸＋10 mmol 乙酸銨（A） -乙腈（B），梯度洗脫（0 ～8 min，12% ～20% B； 8 ～15 min，20% B； 15 ～20 min，20% ～25% B； 20 ～35 min，25% ～60% B；35～40 min，60% ～95%B）； 體積流量0.3 mL/min；柱溫35 ℃； 檢測波長365 nm； 進樣量2 μL。

2.2.2 質譜條件 電噴霧離子源（ESI）； 負離子掃描； 質量掃描范圍m/z50 ～1 250； 噴霧電壓-4 500 V； 霧化氣溫度550 ℃； 氣簾氣、霧化氣、輔助氣壓力55 psi （1 psi ＝6.895 kPa）； 去簇電壓-100 V。采用TOF-MS-IDA-MS/MS 法采集數據，TOF/MS 一級預掃描、二級掃描TOF/MS/MS 離子累積時間300.0、100.0 ms； 碰撞能量-35 eV，疊加（-35±15） eV。

2.2.3 結果分析 將相關數據導入Peakview 軟件中，基于高分辨質譜的精確分子量信息，并結合二級碎片、文獻［9-17］ 報道進行確認，總離子流圖見圖2，共鑒定出41 個化合物，其中23 個為生物堿，具體見表2。

表2 南天竹根中化學成分鑒定結果Tab.2 Results of chemical constituent identification in Nandinae Radix

圖2 正離子模式下南天竹根UPLC-Q-TOF-MS/MS總離子流圖Fig.2 UPLC-Q-TOF-MS/MS total ion flow diagram of Nandinae Radix under positive ion mode

2.3 總生物堿、小檗堿含量測定 參考文獻［18-19］ 報道。

2.3.1 酸料染料制備

2.3.1.1 0.05 mol/L 氫氧化鈉溶液 精密稱取氫氧化鈉0.2 g，置于100 mL 量瓶中，蒸餾水溶解并定容至刻度，即得。

2.3.1.2 溴甲酚綠緩沖液 精密稱取溴甲酚綠0.5 g，加入14 mL 0.05 mol/L 氫氧化鈉溶解，轉移至1 000 mL 量瓶中，加水定容至刻度，即得。

2.3.2 供試品溶液制備

2.3.2.1 總生物堿含量測定 將南天竹根置于50 ℃烘箱中干燥，粉碎，過3 號篩，精密稱取1 g，置于100 mL 具塞錐瓶中，精密加入甲醇-鹽酸（100 ∶1） 混合溶液30 mL，密塞，超聲處理30 min，4 000 r/min 離心10 min，取上清液至60 mL 分液漏斗中，加水至0.4 mL，加入24 mL 溴甲酚綠溶液，搖勻，加入12 mL 三氯甲烷，密塞劇烈振搖5 min，靜置分層20 min，取三氯甲烷層，即得。

2.3.2.2 小檗堿含量測定 精密稱取小檗堿對照品0.5 g，加入25 mL 甲醇，稱定質量，超聲處理30 min，甲醇補足減失的質量，搖勻，濾紙過濾，取續(xù)濾液，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.3.3 測定方法 采用紫外-分光光度計法測定總生物堿含量，以試劑為空白，測定供試品、對照品溶液在410 nm 波長處的吸光度。采用HPLC 法測定小檗堿含量，色譜條件為Agilent ODS-A 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動相乙腈（A） -0.2%乙酸（三乙胺調pH 至5.0）（B），梯度洗脫（0～30 min，10% ～45% A）； 體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃； 檢測波長365 nm； 進樣量20 μL。

2.3.4 線性關系考察

2.3.4.1 總生物堿 精密稱取小檗堿對照品25.0 mg，置于25 mL 量瓶中，甲醇定容，得到1 mg/mL貯備液，甲醇稀釋至不同質量濃度，分別取0.4 mL，置于60 mL 分液漏斗中，加入24 mL溴甲酚綠溶液，搖勻，加入12 mL 三氯甲烷，密塞，劇烈搖晃5 min，靜置分層20 min，取三氯甲烷層，以三氯甲烷為空白，在410 nm 波長處測定吸光度（A）。以小檗堿質量濃度為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（A） 進行回歸，得方程為A＝27.017X＋0.194 1 （R2＝0.999 9），在3 ～20 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.3.4.2 小檗堿 精密稱取小檗堿對照品25.00 mg，置于5 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得到5 mg/mL 貯備液，甲醇稀釋至不同質量濃度，在“2.3.3” 項色譜條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標 （X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，得方程為Y＝18 579 872.779 0X-120 009.104 5 （R2＝0.999 9），在0.025 ～0.8 mg/mL范圍內線性關系良好。

2.3.5 方法學考察 分別對總生物堿、小檗堿含量測定方法進行精密度、重復性、穩(wěn)定性、加樣回收率試驗，測得RSD 分別為0.95%、0.49%，2.30%、0.50%，2.82%、0.28%，1.31%、1.55%，均符合相關要求。

2.3.6 樣品含量測定 按“2.3.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.3.3” 項色譜條件下進樣測定，計算含量，結果見表3、圖3。

表3 總生物堿、小檗堿含量測定結果Tab.3 Results of content determination of total alkaloids and berberine

圖3 小檗堿HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of berberine

2.4 主成分分析（PCA）、判別分析（DA） 共有峰峰面積見表4。

表4 共有峰峰面積測定結果Tab.4 Results of peak area determination of common peaks

2.4.1 PCA 采用SIMCA 14.1 軟件對共有峰數據進行PCA 分析，共發(fā)現5 個主成分，具體見表5，其中前2 個主成分累積方差貢獻率只有0.629，對整個模型的解釋度不夠。得分散點圖見圖4，可知各批樣品區(qū)分效果不理想。

表5 PCA 結果Tab.5 Results of PCA

圖4 PCA 得分散點圖Fig.4 Score scatter chart for PCA

2.4.2 判別分析（DA） 將共有峰數據分為栽培組和野生組，進行DA 分析，發(fā)現2 組數據的1 個判別函數貢獻率為100%，但P值為0.563，即差異無統(tǒng)計學意義，表明各批樣品未顯示出野生、栽培的差異性。

3 討論

3.1 流動相選擇 分別采用甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%乙酸（三乙胺調pH 5.0） 對同一批樣品進行梯度、等度洗脫。結果，在乙腈-0.2% 乙酸 （三乙胺調pH 5.0） 系統(tǒng)中，各色譜峰分布、形狀、分離度均優(yōu)于甲醇-水（酸水）、乙腈-水（酸水），故選擇乙腈-0.2%乙酸（三乙胺調pH 5.0） 作為流動相。

3.2 提取條件優(yōu)化 本實驗從提取溶劑、提取方式、提取時間3 個方面進行優(yōu)化，最終確定為甲醇超聲處理30 min。提取溶劑考察了30%甲醇、50%甲醇、70% 甲醇、甲醇及30% 乙醇、50% 乙醇、70%乙醇、乙醇，發(fā)現甲醇提取時含量高于其他溶劑提取時。提取方式考察了超聲、回流，發(fā)現超聲提取效果優(yōu)于回流提取。提取時間考察了20、25、30、35、40 min。最終確定，甲醇超聲處理30 min作為提取條件。

3.3 HPLC 指紋圖譜分析 本實驗建立了南天竹根指紋圖譜方法，確定了江西、江蘇、浙江、河南、山東等10 個省12 個產地的南天竹根藥材的指紋圖譜，相似性評價結果為0.920～0.996，表明每批藥材主要色譜峰相似度很高； 在9 個共有峰中，確定了5 個色譜峰的歸屬，均為異喹啉類生物堿，其中1-hydroxy-2，9，10-trimethoxy-7H-dibenzo ［de，g］quinolin-7-one、去氫南天寧堿、南天竹寧堿為阿樸菲類異喹啉類生物堿，這類生物堿具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化等活性，臨床上用于治療結腸癌、宮頸癌等疾病，是極為重要的生物堿類型。金罌粟堿、小檗堿為小檗堿類異喹啉生物堿。南天竹指紋圖譜的建立為該藥材的真?zhèn)蝺?yōu)劣鑒定、質量控制及臨床安全有效的應用提供了有力的保障。

3.4 總生物堿、小檗堿含量測定結果分析 12 個不同產地的南天竹根總生物堿、小檗堿含量差異均比較大，栽培的南天竹根的總生物堿、小檗堿含量普遍高于野生的。各產地總生物堿含量的平均值為29.07 mg/g，范圍在13.698 ～46.211 mg/g 之間，含量排在前三的依次為江蘇南京、江西南昌、四川成都，均為栽培的南天竹根，含量最高的江蘇南京產的是最低的重慶產的3.37 倍。各產地小檗堿含量的平均值為8.48 mg/g，范圍在3.627 ～14.151 mg/g 之間，含量排在前三的依次為四川成都、河南信陽、山東青島，均為栽培的南天竹根，含量最高的四川成都產的是最低的福建泉州產的3.9 倍。

小檗堿占總生物堿的百分數排前三的分別為58.98% （山東青島）、52.41% （河南信陽）、40.11% （四川成都）； 小檗堿是黃連、黃柏等常用中藥的有效成分，具有抗菌、抗病毒、抗病原微生物、降血脂、降血糖、抗腫瘤、保護心臟、抗炎、免疫抑制、抗阿爾茨海默病等活性，課題組首次發(fā)現小檗堿具有拮抗As2O3毒性的作用，對國內外治療急性早幼粒細胞白血病的首選靶向藥物亞砷酸氯化鈉注射液等砷劑藥物產生的肝及腎的毒副作用具有減毒增效的作用。小檗堿也稱為黃連素，廣泛存在于小檗科、罌粟科、毛茛科、蕓香科、防己科等科中的小檗屬、十大功勞屬、黃連屬、唐松草屬黃柏屬、古山龍屬等十余個屬內的植物，較常見的藥材有黃連、黃柏、三顆針等，南天竹的野生及栽培資源均非常豐富，為小檗堿單體的來源提供了新的物美價廉的優(yōu)質資源。

3.5 南天竹根差異性分析 12 批南天竹根的27個指紋圖譜共有峰數據通過PCA、DA 分析，均不能得出野生南天竹和栽培南天竹的差異性。由于南天竹野生植物生長以及栽培遍布全國各地區(qū)，并無道地性植物的記載，因此推測其生長可能不受到產地以及栽培方式的影響，故此無法以PCA、DA 分析對成分數據進行區(qū)分。同時由于成分決定藥效，因此也能說明野生和栽培南天竹在藥用上并無無明顯差異，具有較大的潛力和較好的前景。

4 結論

本實驗對南天竹根的甲醇提取物的化學成分進行鑒定，共發(fā)現41 個化合物，其中23 個為生物堿，再建立10 個省、12 個產地6 批野生、6 批栽培南天竹根的指紋圖譜，同時測定其總生物堿、小檗堿含量，為南天竹根優(yōu)勢資源產區(qū)及其開發(fā)利用提供了依據，也為其質量標準建立提供了堅實的物質基礎。