利用CRISPER/Cas9技術(shù)構(gòu)建肝臟特異性敲入Lcat基因小鼠

張芙蓉，茍黎明，李 妍，王澤勇，楊 斐，吳 菁，覃 健*，薛 斌*

1南京醫(yī)科大學(xué)附屬逸夫醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，2檢驗(yàn)科，3骨科，江蘇 南京 211166

成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）是一組廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌中的DNA序列，Cas 序列位于其附近，編碼CRISPR 相關(guān)蛋白9（CRISPR-associated protein 9，Cas9）［1-2］。CRISPER/Cas9 技術(shù)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌中存在病毒的天然基因組編輯體系，即細(xì)菌識(shí)別特定的病毒DNA 片段并對(duì)其進(jìn)行切割使其失活。利用這一特性，研究人員通過(guò)設(shè)計(jì)特定的向?qū)NA（guide RNA，gRNA）來(lái)識(shí)別生物體基因組特定的DNA 位點(diǎn)并對(duì)其進(jìn)行識(shí)別和切割［3］。CRISPER/Cas9 技術(shù)因其更快更高效的特點(diǎn)，已成為眾多基因編輯技術(shù)中運(yùn)用最廣泛的技術(shù)［4-6］，特別是基因編輯小鼠。本研究使用CRISPER/Cas9 技術(shù)完成了基因編輯小鼠的構(gòu)建。

卵磷脂膽固醇脂酰轉(zhuǎn)移酶（lecithin-cholesterol acyltransferase，LCAT）是一種廣泛存在于血漿中的酶［7］，主要由肝臟合成并分泌，對(duì)維持機(jī)體膽固醇穩(wěn)態(tài)以及參與血漿中膽固醇反向轉(zhuǎn)運(yùn)（reverse cholesterol transport，RCT）起重要作用［7］。在膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中，LCAT 將游離的膽固醇進(jìn)行酯化，形成的膽固醇酯經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟進(jìn)行代謝，從而使得外周多余的膽固醇被清除，以維持體內(nèi)膽固醇平衡［8-9］。大量研究表明，體內(nèi)LCAT水平或活性與眾多代謝疾病密切相關(guān)［10］。LCAT 不同程度的突變及缺失會(huì)導(dǎo)致家族性LCAT缺乏癥和魚(yú)眼?。?1-13］；此外，LCAT 水平或活性異?？蓪?dǎo)致膽固醇代謝異常，已被報(bào)道與心血管疾病和脂肪肝的發(fā)生發(fā)展有獨(dú)立的相關(guān)性［14-15］。與此同時(shí)，本課題組之前的研究也證實(shí)LCAT 參與肝性骨病的調(diào)控，而具體機(jī)制需要進(jìn)一步探索［16］。因此，構(gòu)建肝臟特異性敲入Lcat小鼠對(duì)LCAT 作為膽固醇代謝異常疾病治療靶點(diǎn)的進(jìn)一步研究具有重要意義。

本研究利用CRISPR/Cas9 的技術(shù)，通過(guò)同源重組的原理設(shè)計(jì)并體外轉(zhuǎn)錄gRNA，同時(shí)構(gòu)建同源重組載體（donor vector）。將Cas9、gRNA、donor vector同時(shí)注射到小鼠的受精卵中并獲得F0 代小鼠。將測(cè)序正確的F0 代小鼠與C57BL/6JGpt 小鼠交配得到穩(wěn)定遺傳的F1 代小鼠后將其與肝臟特異性表達(dá)Cre的小鼠交配獲得肝臟特異性敲入Lcat的小鼠。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究所用小鼠品系為C57BL/6，該品系源自Abby Lathrop 小鼠株的近交品系實(shí)驗(yàn)鼠，所有小鼠均購(gòu)自江蘇集萃藥康生物科技有限公司。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合南京醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)的規(guī)定并被授權(quán)。所有實(shí)驗(yàn)小鼠均飼養(yǎng)于無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）環(huán)境中，光照時(shí)間為6：00～18：00（明/暗循環(huán)12 h），溫度為（22±3）益，所有動(dòng)物可自由飲食與活動(dòng)。

1.1.2 主要試劑

2×TaqPlusMasterMix、RNA-easyIsolationReagent、HiScript ⅢRT SuperMix for qPCR、2×SYBR Green MasterMix（南京諾唯贊生物科技有限公司）；蛋白酶抑制劑、RIPA 蛋白裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；PVDF 膜（Millipore 公司，美國(guó)）；鼠抗小鼠β-actin抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；兔抗小鼠LCAT 抗體（武漢博士德生物有限公司）；ECL 超敏發(fā)光液（上海天能生命科學(xué)有限公司）；肝臟特異性Lcat基因過(guò)表達(dá)小鼠的DNA 鑒定引物序列信息及qPCR 引物序列見(jiàn)表1，所有引物合成以及測(cè)序結(jié)果均來(lái)自南京擎科生物技術(shù)有限公司。

表1 小鼠DNA鑒定及qPCR引物序列Table 1 The primer sequences for mice genotyping and qPCR

1.2 方法

1.2.1Lcat基因敲入小鼠模型的構(gòu)建

利用CRISPR/Cas9 技術(shù)，將CAG-LSL-Lcat-HispolyA基因片段定點(diǎn)插入到小鼠的H11位點(diǎn)。gRNA的序列為5′-CTGAGCCAACAGTGGTAGTA-3′。將CRISPR/Cas9 體系和donor vector 顯微注射到C57BL/6JGpt 小鼠的受精卵中，獲得F0 代小鼠。經(jīng)PCR 和測(cè)序驗(yàn)證正確的F0 代陽(yáng)性小鼠與C57BL/6JGpt 小鼠交配獲得可穩(wěn)定遺傳的F1 代陽(yáng)性小鼠模型。將F1 代小鼠與肝臟特異性表達(dá)Cre的小鼠交配獲得F2 代小鼠并對(duì)其進(jìn)行基因鑒定。

1.2.2 小鼠基因型的鑒定

取上述F2 代小鼠的腳趾并使用堿提法提取基因組DNA，通過(guò)PCR 技術(shù)檢測(cè)目的基因表達(dá)。PCR反應(yīng)體系為2×Taq Master Mix 10 μL，cDNA 2 μL，上下游引物均為0.4 μL，ddH2O 7.2 μL。反應(yīng)條件為：95 益3 min；95 益15 s，65 益15 s，72 益60 s，35 個(gè)循環(huán)；72 益5 min。對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）檢測(cè)小鼠不同組織Lcat基因mRNA表達(dá)

利用TRIzol 法提取組織總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA，qPCR 反應(yīng)體系為2×SYBR qPCR Master Mix 5 μL，cDNA 1 μL，上下游引物均為0.2 μL，ddH2O 3.6 μL。反應(yīng)條件為：95 益30 s；95 益10 s，60 益30 s，40 個(gè)循環(huán)；95 益15 s，60 益60 s，95 益15 s。單個(gè)樣品做3 個(gè)重復(fù)，內(nèi)參基因?yàn)锳ctb，根據(jù)公式2-ΔΔCT計(jì)算LcatmRNA 在不同組織中的表達(dá)水平。

1.2.4 Western blot 驗(yàn)證小鼠不同組織LCAT 蛋白水平

頸椎脫臼法處死野生型和肝臟特異性敲入Lcat的小鼠后，依次提取各組織并剪取30 mg 放入含蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液中，研磨，12 000 r/min 離心15 min 取上清，加入上樣緩沖液后100 益金屬浴8 min，提取總蛋白。在120 V 電壓下經(jīng)SDS-PAGE膠分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，使用5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h 后孵育一抗（LCAT 稀釋比為1∶1 000，β-actin 稀釋比為1∶10 000），4 益搖床孵育過(guò)夜后用PBST 洗3×10 min，二抗1∶10 000稀釋后室溫孵育1 h，PBST 洗3×10 min 后顯影成像，使用Image J 對(duì)Western blot 條帶的灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 小鼠Lcat基因修飾靶點(diǎn)gRNA序列設(shè)計(jì)及表達(dá)載體構(gòu)建

由于小鼠第11 號(hào)染色體上的H11位點(diǎn)位于Eif4enif1與Drg1這兩個(gè)基因之間，且外源基因插入后對(duì)內(nèi)源基因表達(dá)影響較小，因此針對(duì)H11位點(diǎn)合成gRNA序列。采用CRISPR/Cas9技術(shù)將CAG-LSLLcat-His-polyA 片段基因片段定點(diǎn)插入到小鼠的H11位點(diǎn)上。載體結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

圖1 載體結(jié)構(gòu)示意圖Figure 1 Diagram of carrier structure

2.2 肝臟特異性敲入Lcat小鼠基因型鑒定

將F0 代小鼠與C57BL/6JGpt 小鼠交配獲得F1代小鼠，對(duì)1 周內(nèi)的F1 代小鼠進(jìn)行剪趾并提取DNA 后進(jìn)行PCR，核酸電泳結(jié)果中F1代雜合子H11和H11-wt均有條帶顯示（圖2A）。后將F1代雜合子與Alb-iCre小鼠交配得到肝臟特異性敲入Lcat小鼠。核酸電泳結(jié)果中H11、H11-wt和Cre均有條帶顯示（圖2B）。

圖2 F1代和F2代小鼠基因型鑒定結(jié)果Figure 2 Identification of genotype in F1 and F2 mice

2.3 肝臟特異性敲入Lcat 小鼠不同組織的Lcat mRNA水平

為確定小鼠各組織Lcat轉(zhuǎn)錄水平的差異，根據(jù)核酸電泳結(jié)果，篩出基因型帶Cre的敲入（knock-in，KI）小鼠，以未攜帶Cre的KI/WT 或KI/KI 鼠作為對(duì)照，依次提出心臟、肝臟、腎臟、腦、棕色脂肪的RNA，將其進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并將得到的cDNA 進(jìn)行qPCR，結(jié)果以小鼠心臟內(nèi)Lcat表達(dá)為比較基準(zhǔn)，提示在對(duì)照組小鼠中，Lcat主要由肝臟特異性表達(dá)，而在肝臟特異性敲入Lcat小鼠的肝臟內(nèi)，Lcat的RNA 水平顯著增加（圖3）。

2.4 肝臟特異性敲入Lcat小鼠不同組織的LCAT蛋白水平

為探究肝臟特異性敲入小鼠與對(duì)照組相比各組織LCAT蛋白水平的差異，依次提取各組織蛋白，并通過(guò)Western blot檢測(cè)LCAT的表達(dá)差異。結(jié)果顯示，在肝臟特異性敲入Lcat小鼠體內(nèi)，除肝外，心、腎、腦和脾中也出現(xiàn)了LCAT 的高水平表達(dá)（圖4）。提示LCAT 作為一種分泌性蛋白，可通過(guò)血液循環(huán)運(yùn)輸?shù)狡渌M織中。

圖4 Western blot檢測(cè)Lcat CKI小鼠組織中蛋白表達(dá)情況Figure 4 The relative expressions of proteins in multiple tissues of Lcat CKI mice detected by Western blot

3 討論

CRISPER/Cas9是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種特定、高效和多功能的基因編輯技術(shù)［17］。利用CRISPER/Cas9對(duì)DNA的特定區(qū)域進(jìn)行插入、缺失和替換已廣泛運(yùn)用于基因過(guò)程領(lǐng)域并進(jìn)一步參與疾病的研究與治療中［18-20］。CRISPER/Cas9 體系主要由Cas9 酶和gRNA構(gòu)成。當(dāng)gRNA與Cas9結(jié)合后，在gRNA的引導(dǎo)下，Cas9 完成對(duì)指定序列位點(diǎn)的切割。利用CRISPER/Cas9技術(shù)完成了基因編輯小鼠的構(gòu)建，從而對(duì)特定基因在相應(yīng)疾病模型中發(fā)揮的作用進(jìn)行體內(nèi)研究。

LCAT 作為膽固醇代謝中不可缺少的酶，在脂代謝異常中的作用已被廣泛研究。如Scarpioni等［21］發(fā)現(xiàn)LCAT缺乏的患者動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)顯著升高。Gebhard 等［22］通過(guò)經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)冠心病患者血漿LCAT 質(zhì)量濃度升高，且與斑塊體積呈負(fù)相關(guān)，提示LCAT 有動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)作用。在動(dòng)脈粥樣硬化負(fù)荷的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型中，LCAT 質(zhì)量濃度優(yōu)于LCAT活性，表明LCAT質(zhì)量是動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)的關(guān)鍵變量。因此，進(jìn)一步評(píng)估LCAT 作為心血管疾病治療靶點(diǎn)的研究是有必要的。

另一方面，Janac 等［23］對(duì)130 例患者進(jìn)行了脂肪肝指數(shù)分類(lèi)，發(fā)現(xiàn)較高的LCAT 活性與脂肪肝指數(shù)升高有關(guān)。類(lèi)似的還有Nass 等［15］對(duì)348 例受試者的研究中發(fā)現(xiàn)，LCAT 活性升高與脂肪肝指數(shù)升高獨(dú)立相關(guān)，而具體機(jī)制尚不清楚。同時(shí)，本課題組前期研究顯示，Pp2a敲除小鼠導(dǎo)致的LCAT升高對(duì)肝性骨病有明顯緩解與改善作用［16］。而與之前報(bào)道的小鼠全身性轉(zhuǎn)入人Lcat基因相比［24］，本課題首次將鼠源的Lcat特異性敲入小鼠肝臟，具有明顯的創(chuàng)新性。因此，本課題構(gòu)建的肝臟特異性敲入Lcat小鼠對(duì)研究動(dòng)脈粥樣硬化、脂肪肝以及肝性骨病的具體發(fā)病機(jī)制和靶點(diǎn)的選擇具有重要意義。