巨噬細胞參與非酒精性脂肪性肝病的研究進展

夏安亮，孫倍成

南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院普外科，江蘇 南京 210008

從胚胎到成年，巨噬細胞存在于身體的各個器官［1］。巨噬細胞是高度可塑性的細胞，通過改變其形態(tài)和功能來感知周圍或全身環(huán)境，進而發(fā)生應答［2］。巨噬細胞屬于免疫細胞，具有較強的吞噬能力。在免疫系統(tǒng)激活過程中，巨噬細胞參與了快速、非特異性的防御反應和長期、特異性的適應性反應（包括招募其他免疫細胞）［2］。巨噬細胞還能產生大量的細胞因子、趨化因子和生長因子等，這些因子參與了感染反應和組織修復。此外，除了在組織穩(wěn)態(tài)和防御病原體中發(fā)揮免疫調節(jié)作用外，巨噬細胞還限制了一些疾病的發(fā)展，包括敗血癥、慢性炎癥性疾病、神經退行性疾病和癌癥［3-6］。在代謝性疾?。òǚ蔷凭灾拘愿尾。┲校奘杉毎舶l(fā)揮著至關重要的作用。

肝臟是一個重要的代謝器官，而肝臟中的巨噬細胞作為防御胃腸道有害物質通過門靜脈循環(huán)進入肝臟的第一道防線，其存在維持著肝臟的穩(wěn)態(tài)［7］。在非酒精性脂肪性肝病中，肝臟中存在不同的巨噬細胞以及動態(tài)的演變和功能的變化［8-9］。本文將從肝臟巨噬細胞的分類、異質性以及在非酒精性脂肪性肝病中的作用等方面進行綜述。

1 肝臟巨噬細胞的分類

1.1 枯否細胞

枯否細胞于1876 年由Wilhem von Kupffer 首次描述，20 年后Tadeusz Browicz 將枯否細胞鑒定為巨噬細胞［10-11］。巨噬細胞均表達通用的標志物，包括CD64、F4/80和MerTK。近年來，對小鼠枯否細胞的區(qū)分有了長足進展。CLEC4F被確定為小鼠枯否細胞的特異性標志物，因而可以建立Clec4f-Dtr 和Clec4f-cre小鼠模型，以分別特異性地去除或靶向枯否細胞［12-15］。雖然CLEC4F 是一種有用的枯否細胞標志物，但是它也有其局限性。首先，它在枯否細胞中表達相對較晚，因此很難識別正在發(fā)展成枯否細胞的那些早期和中間態(tài)細胞［13-14，16-17］。對于正常肝臟來說，枯否細胞主要來源于胚胎，并在整個生命過程中自我維持、自我更新，因而CLEC4F的較晚表達無關緊要［18-19］。但是，對于疾病狀態(tài)下的肝臟（如非酒精性脂肪性肝病）來說，駐留巨噬細胞會逐漸減少或者丟失。其中一個重要的發(fā)現(xiàn)是胚胎來源的枯否細胞自我維持、自我更新能力受損，進而發(fā)生死亡，被單核細胞衍生的枯否細胞所替代［17，20-22］。單核細胞衍生的枯否細胞可能需要近1周的時間才表達CLEC4F，然后才能將它們與其他肝臟巨噬細胞區(qū)分開來。其次，盡管CLEC4F 在許多物種中保守，但在人類中并沒有保守性［23］，這導致真正的人類枯否細胞無法被識別。

近年來，單細胞RNA 測序技術的出現(xiàn)，便于人們解析正常肝臟的細胞圖譜，揭示人類枯否細胞的真實身份。然而，每項研究所得出的關于人類枯否細胞身份的結論不盡相同。盡管如此，利用單細胞RNA 測序技術（基于RNA 水平）比較人和小鼠基因表達圖譜，發(fā)現(xiàn)了枯否細胞較為特異的一些標志物，包括CD5L、VSIG4、CD163、FOLR2、MARCO 和SLC40A1，可用于在7 個不同物種的肝臟中識別單一均質的枯否細胞群［23］。此外，通過流式細胞術（基于蛋白水平）也能識別不同物種中的枯否細胞，包括VSIG4、CD163和FOLR2。另外，小鼠肝臟枯否細胞表面的其他受體包括CLEC2 和CD206 也可進一步區(qū)分不同來源的肝臟巨噬細胞。CLEC2（由Clec1b編碼）是枯否細胞非常早期的標志物，并在其整個壽命期間均保持表達［17，21］。因此，這是一個非常有用的標志物，能夠區(qū)分單核細胞衍生的枯否細胞。在小鼠中，單核細胞衍生的枯否細胞主要限于疾病狀態(tài)的肝臟，然而在正常人體肝臟中，已有研究通過單細胞測序鑒定了此類細胞的存在。潛在原因可能是人類暴露于病原體、高脂飲食、酒精和其他毒素等，導致單核細胞衍生的枯否細胞的招募［23］。然而，這些細胞是否是嚴格意義上的單核細胞衍生的枯否細胞仍需進一步探究。此外，基于CD206和ESAM 的表達，枯否細胞可以分為兩個亞群，即CD206-ESAM-KC1 和CD206+ESAM+KC2［24-25］，其中CD206-ESAM-KC1是主要的枯否細胞亞群。轉錄組分析表明所有特異性表達于KC2 的基因也都被肝竇內皮細胞表達，提示這些細胞可能是雙重細胞或者消化產物［23，26］。因此，通過整合枯否細胞特異的表面標志物（包括CD5L、VSIG4、CD163、FOLR2、MARCO、SLC40A1、CLEC2和CLEC4F），進而區(qū)分枯否細胞和其他巨噬細胞。

1.2 枯否細胞以外的其他巨噬細胞

除了枯否細胞，正常肝臟中還存在其他巨噬細胞群體。首先，肝包膜巨噬細胞已經被證實存在于人和小鼠的肝臟中［23，27］。肝包膜由一層間皮細胞和一層位于肝表面下方的包膜成纖維細胞組成［28］，而肝包膜巨噬細胞存在于此。在小鼠肝臟中，肝包膜巨噬細胞來源于單核細胞，在斷奶時積累在包膜中［27］。它們表達通用的巨噬細胞標志物，如F4/80 和CD64，但不表達枯否細胞的標志物，如VSIG4、CLEC4F、FOLR2 或CLEC2［23］。此外，它們也表達CX3CR1 和CD207［23，27］。肝包膜巨噬細胞盡管在小鼠中具有明確的特征，但在人類中特征仍不明確。一方面，可能是因為相關標志物在人和小鼠中缺乏保守性［23］；另一方面，可能是人類肝活檢組織中缺乏包膜組織。此外，肝包膜巨噬細胞的轉錄特征在小鼠肝臟中并不是獨特的。中央靜脈區(qū)存在一群巨噬細胞，其轉錄特征與肝包膜巨噬細胞相似［23］。此外，在正常人和小鼠的肝臟中還發(fā)現(xiàn)了另外一群巨噬細胞。它們靠近膽管［23］，其轉錄譜在不同物種間是一樣的，與脂肪組織和脂肪肝中的脂質相關巨噬細胞相似［17，29］。因此，我們將這些細胞稱為膽管-脂質相關巨噬細胞［23］。在小鼠肝臟中，膽管-脂質相關巨噬細胞沒有特異的表面標志物，而在人體肝臟中，通過CITE-seq 分析CD14、CD11a、CD26、CD141和CD9進而識別膽管-脂質相關巨噬細胞［23］。

2 肝臟巨噬細胞的分區(qū)和相互作用

單核細胞和巨噬細胞具有較強的可塑性，以便快速適應微環(huán)境的改變。2004 年的一項研究使用免疫組織化學和地高辛-膠原酶灌注分離方法，發(fā)現(xiàn)枯否細胞在門區(qū)和靜脈周圍存在功能差異［30］。2021 年的一項研究使用定量多重共聚焦成像和數(shù)學建模評估了肝臟免疫細胞的定位，發(fā)現(xiàn)枯否細胞聚集在門區(qū)周圍［31］。免疫分區(qū)是一個依賴于腸道菌群的動態(tài)過程，而肝竇內皮細胞被確定為免疫分區(qū)過程中的關鍵細胞，主要通過影響趨化因子成分而發(fā)生作用［31］。在人體正常肝臟中，MARCO 陽性枯否細胞在門區(qū)相對富集［32］。近年來，空間轉錄組學技術的出現(xiàn)，證實了人體CD68+MARCO+駐留枯否細胞定位于門區(qū)，而招募的CD68+MARCO-巨噬細胞靠近中央靜脈［33］。然而，小鼠研究未能揭示巨噬細胞的任何特定分區(qū)，僅能發(fā)現(xiàn)一些單核細胞衍生的巨噬細胞位于大血管周圍［15-17，24］。

肝臟中巨噬細胞與其他細胞相互作用。巨噬細胞的特異性是由肝竇內皮細胞、肝星狀細胞和肝細胞共同塑造的。這些細胞表達CSF1、DDL4、TGF-β和BMP9 等配體，進而激活巨噬細胞中的一些轉錄因子，如LXRα、SPIC、RBPJ、SMADs 和ID3，從而維持巨噬細胞特異性轉錄［14-16］。

3 巨噬細胞在非酒精性脂肪性肝病中的異質性

巨噬細胞在肝臟疾病環(huán)境中由于受到不同的代謝和免疫等信號刺激，會表現(xiàn)不同的功能。單細胞RNA 測序研究揭示了正常和代謝疾病中肝臟內多種巨噬細胞群體。代謝性疾病中肝臟巨噬細胞多樣性的研究大多集中在非酒精性脂肪性肝病的后期階段，包括非酒精性脂肪性肝炎。

在非酒精性脂肪性肝炎中，單核細胞衍生的巨噬細胞數(shù)目和比例顯著增加，可由正常情況下的10%增加到50%，打破了原有駐留巨噬細胞和招募的巨噬細胞之間的平衡［17，20-22，34］。這些招募的巨噬細胞包括過渡型巨噬細胞、單核細胞衍生的枯否細胞和脂質相關巨噬細胞［17，20，22］。與非脂質相關巨噬細胞相比，脂質相關巨噬細胞在非酒精性脂肪性肝炎進程中表現(xiàn)出促炎表型［17，20］。由于胚胎來源的枯否細胞的喪失，單核細胞衍生的枯否細胞增加，以彌補枯否細胞池。在非酒精性脂肪性肝炎中，枯否細胞也可被劃分為Trem2high、Trem2low、胚胎來源和單核細胞衍生的枯否細胞，Trem2high枯否細胞表型類似于脂質相關巨噬細胞［17，20-21，35］。2021年的一項研究揭示了一種胚胎來源的枯否細胞，通過表達CD36，對肥胖相關的氧化應激具有至關重要的作用［24］。

單細胞測序分析人和小鼠肝臟巨噬細胞的轉錄圖譜，發(fā)現(xiàn)人體TREM2+CD9+瘢痕相關巨噬細胞和小鼠脂質相關巨噬細胞重疊，表明人和鼠中這兩個巨噬細胞群可能是相同的細胞群［17］。在纖維化的微環(huán)境中，瘢痕相關巨噬細胞逐漸增加，并上調促纖維化基因，包括Spp1、Lgals3、Ccl2、Cxcl8、Pdgfb和Vegfa［36］。因此，單細胞測序技術在非酒精性脂肪性肝炎進程中，有助于揭示肝臟巨噬細胞促纖維化表型。雖然這些研究揭示了單核細胞衍生的巨噬細胞在人和鼠中的有害作用，但2021年的一項研究表明，胚胎來源的肝臟巨噬細胞對肝臟脂肪變性相關的氧化應激有促進作用［24］。因此，無論是胚胎來源的巨噬細胞還是單核細胞衍生的巨噬細胞，它們在非酒精性脂肪性肝炎中的作用可能是一個動態(tài)的演變過程。

4 巨噬細胞在非酒精性脂肪性肝病中的作用

4.1 炎癥作用

肝臟巨噬細胞在代謝性疾病中的重要性不言而喻。肝臟巨噬細胞的清除可減輕炎癥。小鼠在高脂飲食喂養(yǎng)15～20周后，通過RNA測序分析肝臟駐留的巨噬細胞和招募的巨噬細胞，提示在肥胖和肝臟脂肪變性時，炎性標志物只在單核細胞衍生的巨噬細胞而不是駐留的枯否細胞中表達［37］。然而，這兩種細胞群體只是根據(jù)表面標志物F4/80 和CD11b 表達水平來定義的，即F4/80lowCD11b+代表招募的巨噬細胞，F(xiàn)4/80highCD11b+代表駐留的巨噬細胞，無法區(qū)分駐留和招募的巨噬細胞不同亞群。在另外一種非酒精性脂肪性肝炎的模型中，即蛋氨酸-膽堿缺乏飲食6周的小鼠中，通過轉錄組分析證實，與胚胎來源的巨噬細胞相比，單核細胞衍生的巨噬細胞處于更高的促炎狀態(tài)［21］。在兩種巨噬細胞中，脂代謝相關基因在非酒精性脂肪性肝炎中是最易受調節(jié)的。該研究也表明了在非酒精性脂肪性肝炎中，駐留的巨噬細胞減少，而單核細胞浸潤增加。然而在單純脂肪變時并沒有發(fā)生這種情況，表明單核細胞的浸潤和炎癥的增加僅發(fā)生在非酒精性脂肪性肝病的后期階段，即非酒精性脂肪性肝炎。一致的是，肥胖合并單純脂肪變患者肝臟巨噬細胞的轉錄組學分析揭示，這些巨噬細胞沒有任何炎癥激活［38］。

單細胞測序技術允許深入研究巨噬細胞亞群表型以及根據(jù)它們的來源、功能和相關的炎性表型區(qū)分細胞［39］。肝臟巨噬細胞介導的炎癥依賴于單核細胞的招募和肝臟疾病的嚴重程度。單細胞測序分析了飲食誘導的非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型中肝臟巨噬細胞亞群的轉錄組學特征。單核細胞衍生的巨噬細胞具有更明顯的促炎特征，而胚胎來源的巨噬細胞要么沒有促炎特征，要么比其健康對照組略具促炎特征［17，20，22，35，40］。因此，這些研究證實了非酒精性脂肪性肝炎中炎癥和單核細胞招募之間的關系。

此外，非酒精性脂肪性肝病的巨噬細胞高表達p38α和FoxO1。使用巨噬細胞特異性敲除P38a和Foxo1的小鼠，證實了P38a和Foxo1的敲除可減少促炎細胞因子的分泌，增加M2巨噬細胞的極化，降低炎癥，抑制非酒精性脂肪性肝炎的發(fā)展［41-42］。而巨噬細胞XBP1通過激活巨噬細胞NLRP3信號促進促炎細胞因子表達和M1 巨噬細胞的極化，加重炎癥，促進非酒精性脂肪性肝炎的進展［43］。

4.2 胰島素抵抗

巨噬細胞介導的胰島素抵抗，是獨立于炎癥而存在的，并且在炎癥發(fā)生前出現(xiàn)［38］。在高脂飲食早期且沒有炎癥的情況下，清除肝臟巨噬細胞可以改善胰島素的敏感性［44-45］。通過在肝臟巨噬細胞中特異性敲除炎癥主要調節(jié)因子NF-κB，可以減少IL-1β表達并改善肥胖小鼠的肝臟胰島素敏感性，表明肝臟巨噬細胞源性IL-1β在肥胖引起的肝功能障礙中發(fā)揮了直接作用［46］。然而，在肝臟巨噬細胞中特異性敲除Il1b未能改善肥胖小鼠的肝臟胰島素敏感性［38］。這一發(fā)現(xiàn)表明，肝臟巨噬細胞中的NF-κB可能獨立于IL-1β調節(jié)肥胖小鼠的肝臟胰島素敏感性。因此，研究肝臟巨噬細胞中NF-κB下游的轉錄調控以及驗證其靶基因在胰島素敏感性中的功能將是未來的研究方向。

此外，脂肪組織巨噬細胞上表皮生長因子受體的激活可加重胰島素抵抗。研究表明高脂飲食增加了脂肪組織巨噬細胞中表皮生長因子受體及其配體雙調蛋白的表達。而選擇性去除脂肪組織巨噬細胞上表皮生長因子受體，可抑制肥胖和胰島素抵抗的發(fā)展［47］。據(jù)報道，脂肪組織巨噬細胞來源的miR-29a，可通過外泌體轉運到肝臟，進而誘導胰島素抵抗。其作用機制與下游PPAR-δ密切相關。GW501516，作為PPAR-δ的激動劑，可改善miR-29a誘導的胰島素抵抗［48］。然而，也有研究表明，M2 極化的骨髓源性巨噬細胞分泌含有miR-690 的外泌體，可以改善肥胖小鼠葡萄糖耐受和胰島素敏感性，提示miR-690 可能成為治療代謝性疾病的新胰島素增敏劑［49］。

4.3 脂代謝和氧化應激

肝臟中肝細胞脂肪酸過度積累時，會發(fā)生脂毒性，進而導致內質網(wǎng)應激、氧化應激、肝細胞衰老和凋亡。脂肪變的肝細胞分泌細胞因子和趨化因子，包括CCL2、CXCL10 和細胞外囊泡，進而激活非實質細胞（包括肝星狀細胞、肝竇內皮細胞和巨噬細胞）［50-51］。另外，游離膽固醇也可以介導脂肪肝中巨噬細胞的活化［52］。正常情況下，巨噬細胞具有模式識別受體（介導促炎信號）和清道夫受體（參與脂質攝取和吞噬）。而在非酒精性脂肪性肝病中，清道夫受體A和脂肪酸轉運蛋白CD36受到廣泛關注，因為它們介導低密度脂蛋白的攝取［53-54］。

已有研究表明小鼠體內枯否細胞的清除，可減少高脂飲食誘導的肝臟脂肪變性和炎癥［55］?；罨目莘窦毎麜置诖傺准毎蜃?，包括IL-1β和TNF，而這些細胞因子通過PPAR-α途徑抑制參與肝細胞脂質代謝的基因，從而促進肝細胞脂肪變性［44，56］。有趣的是，富含脂肪的巨噬細胞在攝取凋亡的脂肪變性肝細胞后，也可轉變成抗炎表型［57］。此外，Blériot等［24］使用單細胞轉錄組分析和命運圖譜方法證實在健康和肥胖者中，除了主要的CD206lowESAM-枯否細胞群外，還有CD206highESAM+亞群，均通過CD36的表達參與脂質代謝的調節(jié)。Weiss等［58］的最新研究表明巨噬細胞來源的衣康酸反式作用于肝細胞，以調節(jié)肝臟代謝脂肪酸的能力。

2019年的一項研究表明，在肥胖和胰島素抵抗的人和小鼠中，肝臟巨噬細胞并不會變成促炎巨噬細胞［38］。小鼠在高脂飲食9 周后出現(xiàn)肥胖、肝臟脂肪變和胰島素抵抗，此時并沒有招募促炎單核細胞。小鼠在高脂飲食至少12周后，才開始招募促炎單核細胞［38］。通常認為，肝臟巨噬細胞產生胰島素樣生長因子結合蛋白7，直接調節(jié)肥胖小鼠和人中的胰島素信號和脂質堆積，從而促進代謝性疾病的發(fā)展［38］。雖然巨噬細胞在早期階段并未獲得促炎表型，但是它們已經不同于健康對照組中的肝臟巨噬細胞，高達1 000個基因的表達具有統(tǒng)計學差異［38］。而這些差異基因大多數(shù)參與氧化應激［59］。脂質過氧化功能障礙和活性氧的過度產生促進了氧化應激。

Barreby 等［60］利用單細胞測序分析發(fā)現(xiàn)在肥胖人群中，保護性駐留肝髓細胞（稱為肝髓細胞2）的比例會降低。功能性實驗表明，肝髓細胞2 的存在可以改善與肥胖相關的氧化應激。因此，肝髓細胞2可能是非酒精性脂肪性肝病相關氧化應激的潛在治療靶點。

4.4 纖維化

肝纖維化是非酒精性脂肪性肝炎晚期的一個關鍵特征，與其預后密切相關［61］。伴有纖維化的非酒精性脂肪性肝炎患者，可進一步發(fā)展成為肝硬化、門靜脈高壓、器官功能受損和肝細胞癌［62］。纖維化的嚴重程度是肝臟疾病相關發(fā)病率和病死率的重要預測因素［63］。免疫細胞、內皮細胞和肝星狀細胞等相互作用，共同構成了纖維化生態(tài)位［36］。巨噬細胞是肝纖維化的一個調節(jié)因子。

RNA測序分析表明單核細胞衍生的巨噬細胞，而不是枯否細胞，上調與纖維化進展相關的生長因子和細胞因子，揭示單核細胞衍生的巨噬細胞在肝臟纖維化形成中起主要作用［64］。一致的是，Ccr2-/-小鼠表現(xiàn)出較少的單核細胞衍生的巨噬細胞和較輕的纖維化［65］。

然而，纖維化生態(tài)位上的單核細胞衍生的巨噬細胞存在功能異質性。近年來，單細胞測序發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟中單核細胞衍生的巨噬細胞定位于與desmin+肝星狀細胞非常接近的纖維化組織區(qū)域，這表明它們可能參與肝纖維化［17］。與此同時，在人類肝硬化的肝臟中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，具有促纖維化特征的Trem2+Cd9+單核細胞衍生的巨噬細胞在人類肝纖維化過程中明顯增多［36］，其轉錄組學特征包含調節(jié)纖維化生成的一些基因，包括Spp1、Lgals3、Ccl2和Pdgfb［36］。有趣的是，該巨噬細胞群與正常和脂肪變肝臟中發(fā)現(xiàn)的脂質相關巨噬細胞群具有很大的相似性［22-23］。Hendrikx等［66］利用空間轉錄組分析發(fā)現(xiàn)Trem2+巨噬細胞也定位于纖維化區(qū)域。另一項研究發(fā)現(xiàn)了Ceacam1+Msr1+Ly6C-F4/80-Mac1+單核細胞群，根據(jù)其分離的核形狀和細胞質顆粒，被稱為分離的含核非典型單核細胞。其受C/EBPβ調節(jié)，具有促纖維化作用［67］。此外，表達骨橋蛋白的CLEC4F-單核細胞衍生的巨噬細胞也具有促纖維化作用［17］。目前，雖然這些不同巨噬細胞亞群之間的確切關系尚不清楚，但是它們的相關性得到了臨床數(shù)據(jù)的支持，即非酒精性脂肪性肝炎伴有纖維化患者的血清和肝臟樣本中骨橋蛋白、CCL2和IL-8表達上調［68］。此外，巨噬細胞也是纖維化消退和組織完整性恢復的重要調節(jié)因子，因為它們可以降解細胞外基質并具有免疫調節(jié)功能。清除CX3CR1+CCR2+脂質相關巨噬細胞增加了肝纖維化，表明這群細胞對纖維化起著抑制作用［22］。

纖維化生態(tài)位離不開巨噬細胞、內皮細胞和肝星狀細胞之間的相互作用。巨噬細胞來源的TNF-α、IL-1β、TGF-β和galectin-3 是重要的促纖維化信號，可激活肝星狀細胞中的NF-κB通路，誘導膠原生成并促進其存活［43，69-71］。巨噬細胞中的YAP信號介導纖維化血管內皮細胞亞群的交流［72］。因此，巨噬細胞在纖維化過程中發(fā)揮重要作用。

5 結語與展望

在巨噬細胞分區(qū)、細胞代謝和細胞間相互作用以及功能驗證上所取得的進展，將有利于闡明肝臟巨噬細胞亞群在非酒精性脂肪性肝病中的具體作用。探索肝臟巨噬細胞的多樣性有利于進一步了解非酒精性脂肪性肝病。單細胞測序技術，更有助于了解肝臟疾病不同階段巨噬細胞亞群的轉錄譜改變。此外，采用靶向方法來清除特定的肝臟巨噬細胞亞群，以確定巨噬細胞亞群在非酒精性脂肪性肝病中的作用，為后續(xù)非酒精性脂肪性肝病的治療提供了新的策略。