納米藥物在腫瘤過繼性細胞免疫治療中的研究進展

楊 艷，錢漢清，馬亞軍

1南京中醫(yī)藥大學江寧臨床醫(yī)學院，江蘇 南京 211000；2南京醫(yī)科大學附屬江寧醫(yī)院腫瘤科，江蘇 南京 211000；3江蘇醫(yī)藥職業(yè)學院江寧臨床醫(yī)學院，江蘇 南京 211000

以免疫檢查點抑制劑、腫瘤疫苗和過繼性細胞免疫治療（adoptive cellular therapy，ACT）等為代表的免疫治療，是腫瘤治療近年來最大的突破。它的應(yīng)用極大地改變了臨床腫瘤治療的格局，與手術(shù)、化療、放療共同構(gòu)成了腫瘤治療的四大支柱。ACT將免疫細胞在體外工程化改造、擴增后再回輸患者體內(nèi)，以激發(fā)有效的免疫應(yīng)答和殺傷腫瘤。與手術(shù)、放化療等傳統(tǒng)的治療手段相比，ACT 特異性強，對腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的控制更佳，治療效果更具優(yōu)勢；同時不良反應(yīng)小，在一定程度上避免了患者放化療后免疫力差，生活質(zhì)量低的問題。其中，研究最深入的是基于T 細胞的ACT，如腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）、嵌合抗原受體T細胞（chimeric antigen receptor T cell，CAR-T）、T細胞受體工程化T細胞（T cell receptor-gene engineered T cell，TCR-T）等［1］。

1988 年，Rosenberg 等［2］從惡性黑色素瘤患者自體腫瘤組織中分離TIL，并在體外用白細胞介素（interleukin，IL）-2 培養(yǎng)后回輸，可使60%的轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤患者的腫瘤客觀消退，標志著TIL 療法的誕生。而通過基因工程，使T細胞表達CAR 或TCR，從而獲得腫瘤特異性CAR-T和TCR-T，進一步拓展了ACT 的類型與范圍。2017 年，兩種靶向CD19 抗原的CAR-T——Kymriaht 和Yescartat 分別被FDA 批準用于治療急性淋巴細胞白血病和大B 細胞淋巴瘤，成為ACT 治療的又一個里程碑。截止目前，全球已有6款CAR-T細胞療法批準上市，對腫瘤臨床治療產(chǎn)生了巨大影響［3］。

盡管ACT 療法在消除腫瘤和延長患者生存率方面取得了許多重要的進展，應(yīng)用范圍不斷擴大，研發(fā)管線數(shù)量也在不斷增加，但ACT在實體腫瘤中的應(yīng)用仍面臨一些挑戰(zhàn)，例如：①T細胞難以通過擴增獲得足夠數(shù)量的效應(yīng)細胞；②細胞制備過程復(fù)雜繁瑣；③致密的細胞外基質(zhì)構(gòu)成的物理屏障，限制了免疫細胞在實體腫瘤中的穿透；④免疫抑制性微環(huán)境導(dǎo)致T 細胞持久性差，易耗竭等。這些都影響了ACT在實體腫瘤中的應(yīng)用。

納米技術(shù)和納米材料在醫(yī)學領(lǐng)域的發(fā)展則為克服上述挑戰(zhàn)提供了新的策略，通過負載藥物，或者結(jié)合各種生物功能分子，納米材料可以促進免疫細胞的擴增、體內(nèi)回輸后的存活，以及在腫瘤中的穿透與浸潤，有助于免疫細胞克服實體腫瘤組織中的物理屏障和免疫抑制微環(huán)境，更好地發(fā)揮抗腫瘤作用（圖1）。本文從以下幾方面總結(jié)納米材料增強ACT 在腫瘤治療中應(yīng)用的最新研究進展，探討納米醫(yī)學在ACT中的發(fā)展前景。

圖1 納米藥物在增強腫瘤ACT治療中的應(yīng)用Figure 1 Applications of nanomedicine in adoptive cellular therapy for cancer

1 制備ACT細胞

1.1 促進ACT細胞擴增與活化

獲得足夠數(shù)量的免疫細胞是ACT 治療的第一步，由于從患者體內(nèi)分離的自體T 細胞通常數(shù)量有限，需要對T細胞進行體外擴增培養(yǎng)。其中，與抗原遞呈細胞（antigen presenting cell，APC）共培養(yǎng)，對抗原進行加工遞呈是刺激T 細胞增殖活化的關(guān)鍵步驟。該過程通常需要8～12 周，耗時長，培養(yǎng)成本高，且難以實現(xiàn)標準化。將T 細胞活化、增殖所需的信號分子偶聯(lián)在磁珠上，構(gòu)建人工抗原遞呈細胞（artificial antigen presenting cell，aAPC），模擬T 細胞與APC 的相互作用，提供激活T 細胞所需的刺激信號，是擴增T 細胞，誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答的重要方法。修飾的信號分子通常包括3 類：①抗原識別信號，用于抗原特異性或非特異性T細胞活化的主要組織相容性復(fù)合體-肽（peptide-major histocompatibility complex，pMHC）復(fù)合物或anti-CD3；②共刺激信號，如anti-CD28、anti-4-1BB等；③細胞因子，使T細胞存活或活化的IL，如IL-2、IL-12或IL-15等。將anti-CD3和anti-CD28 抗體偶聯(lián)在超順磁性Dynabeads 磁珠上，產(chǎn)生了商業(yè)化Dynabeads?ClinExVivoTMCD3+/CD28+T細胞擴增試劑盒，可以非特異性擴增自體T細胞，已應(yīng)用于臨床ACT治療用T細胞的制備［4-5］。

盡管T 細胞的擴增技術(shù)不斷進步，但體外擴增后獲得足夠數(shù)量且具有功能的T細胞以滿足臨床應(yīng)用需求仍具有挑戰(zhàn)性。由于aAPC 的尺寸是影響抗原遞呈效率和途徑的最重要因素，納米材料因其自身獨特的生物學效應(yīng)，為體外擴增與活化免疫細胞提供了新的途徑。有研究表明，盡管5～10 μm 的aAPC 與天然細胞大小接近，在體外擴增效率更高，但由于向淋巴結(jié)引流受限，且易于被吞噬細胞清除，在體內(nèi)無法充分活化T 細胞［6］。與微米尺寸的aAPC 相比，納米尺度的aAPC 在體內(nèi)的遞呈活化效率更高，可以通過淋巴引流直接遷移至淋巴結(jié)遞呈抗原，活化T細胞［7］。并且納米aAPC在體內(nèi)不易形成栓塞，安全性更好。近年來，報道了許多基于脂質(zhì)體、合成高分子和無機材料的納米aAPC 用于擴增與活化免疫細胞的研究。

1.1.1 脂質(zhì)體

脂質(zhì)體是由磷脂、膽固醇等構(gòu)成的，與細胞膜類似的雙分子層囊泡，是臨床上廣泛應(yīng)用的納米藥物劑型。與其他材料相比，脂質(zhì)體aAPC 上修飾的信號分子在脂質(zhì)體表面可以自由擴散，而前者表面配體只能以隨機、固定的形式連接，缺乏流動性［8］。因此脂質(zhì)體aAPC 模擬了樹突細胞（dendritic cell，DC）與T細胞表面TCR配體結(jié)合后，pMHC復(fù)合體在DC 表面遷移，有利于免疫突觸的形成，更好地模擬了自然狀態(tài)下的抗原遞呈過程［9］。Prakken 等［10］最先用磷脂酰膽堿負載MHC-OVA323-339肽復(fù)合物，制備了對信號分子具有高負載能力的脂質(zhì)體aAPCs。Dahotre 等［11］利用pMHC 的巰基與脂質(zhì)體上馬來酰亞胺之間的偶聯(lián)，構(gòu)建了一系列不同pMHC 含量的脂質(zhì)體aAPC，研究了aAPC 表面pMHC 密度對T 細胞活化效率的影響。結(jié)果表明，0.5% 二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇-馬來酰亞胺（DSPE-PEGmaleimide）和0.13%pMHC/Mal 組合的脂質(zhì)體aAPC擴增T細胞的效率最高。

1.1.2 無機納米顆粒

無機納米材料的形貌、尺寸易于調(diào)控，且具有豐富的光、電、磁性質(zhì)，在活化和擴增T 細胞方面優(yōu)勢獨特。大多數(shù)aAPC 均為球形顆粒，而利用無機納米材料，構(gòu)建不同形貌的aAPC，調(diào)控與T 細胞的接觸面積，優(yōu)化活化擴增T 細胞的能力，可以彌補納米尺寸導(dǎo)致的無法與T 細胞有效接觸的不足。Sunshine 和Meyer 等［12-13］發(fā)現(xiàn)高長徑比的橢球狀aAPC與T細胞之間的接觸面積和接觸概率更高，較長的側(cè)面提供了一個更類似免疫突觸的接觸部分，從而具有更高的T細胞擴增效率。介孔二氧化硅棒（mesoporous silica rod，MSR）是一種具有高長徑比和比表面積的無機納米材料，利用其負載IL-2，并在表面涂敷修飾了TCR共刺激配體的磷脂分子，構(gòu)建的aAPC 支架可以持續(xù)釋放信號分子并形成有效的免疫突觸［14］。與Dynabeads 相比，MSR 支架可促進抗原特異性人原代T 細胞和CAR-T 細胞的多克隆擴增，并顯著增強擴增T細胞的抗腫瘤功能。

順磁性氧化鐵納米顆粒是研究最廣泛的無機aAPC。它的一個顯著優(yōu)點是在刺激T細胞擴增后，可以通過磁珠分選技術(shù)將其從T細胞中直接分離出來，從而避免了與T細胞一起回輸引起的不良反應(yīng)和栓塞的可能。Chiang等［15］報道了一種基于巖藻多糖-葡聚糖的，包被了程序性死亡配體1（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）免疫檢查點抑制劑（anti-PD-L1）和T 細胞激活劑（anti-CD3 和anti-CD28）的磁性氧化鐵納米顆粒IO@FuDex3。研究發(fā)現(xiàn)IO@FuDex3可以被吸附在CD8+T細胞膜上，在阻斷免疫檢查點的同時促進T細胞增殖。

除尺寸和形狀外，TCR 在T 細胞表面的預(yù)聚集是影響T 細胞應(yīng)答的另一個重要因素。如前所述，免疫突觸的形成在T 細胞識別、增殖和活化中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。它增加了APC與T細胞相互接觸局部的膜表面信號分子密度，有利于T 細胞的活化與增殖。利用順磁性氧化鐵納米顆粒在磁場中可以發(fā)生聚集的特點，Perica 等［16］制備了基于順磁性葡聚糖鐵納米顆粒的aAPC，研究了磁場誘導(dǎo)刺激分子預(yù)聚集對T細胞反應(yīng)性的影響。在磁場（0.2 T，30 min）作用下，包被MHC-Ig二聚體和anti-CD28抗體的納米顆?？梢栽赥 細胞的表面聚集，使生成的TCR 信號簇提高2 倍，從而增強抗原特異性T 細胞的擴增。該方法進一步被應(yīng)用于活化和擴增黑色素瘤患者中分離的MART-1（黑色素瘤抗原）腫瘤特異性CD8+T 細胞，目的細胞在2 周時間內(nèi)可擴增1 000倍［17］。

1.1.3 細胞膜仿生納米顆粒

紅細胞、白細胞等天然有機體具有長循環(huán)，豐富的膜表面蛋白，穿越生物屏障和在靶器官聚集等性質(zhì)。提取的細胞膜可以保留這些屬性，是模擬天然APC的理想載體材料。受此啟示，研究者開發(fā)了一系列基于細胞膜的仿生aAPC。例如，Zhang 等［18］開發(fā)了一種包裹白細胞膜的磁小體，同時修飾的疊氮基團可通過點擊反應(yīng)偶聯(lián)pMHC-I 和anti-CD28。該aAPC可顯著增強T細胞擴增，誘導(dǎo)的CD8+T細胞是體外可溶性抗體處理組的4倍。

綜上所述，非細胞載體的納米aAPC 表面具有可控的免疫分子種類和數(shù)量，從而實現(xiàn)對T 細胞活化增殖過程的調(diào)控，并且活化過程中條件較均一，質(zhì)量易控，在體外制造ACT免疫細胞具有良好的應(yīng)用前景。

1.2 直接在體內(nèi)制造CAR-T細胞

利用納米顆粒在體內(nèi)促進T細胞擴增的最直接應(yīng)用是腫瘤納米疫苗，它通過納米顆粒負載腫瘤相關(guān)抗原/新抗原及佐劑，模擬抗原特異性T細胞致敏和活化的生理過程，誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答。除納米疫苗外，近年來還提出了一些利用納米顆粒在體內(nèi)直接生產(chǎn)CAR-T細胞的新策略。

1.2.1 “二級抗原”策略誘導(dǎo)CAR-T細胞擴增

該策略通過設(shè)計一種具有額外抗原受體的CAR-T，使其對外源性抗原（即“二級抗原”）具有特異性，在體內(nèi)的擴增依賴于隨后的外源性抗原疫苗接種，從而實現(xiàn)CAR-T細胞的可控擴增［19］。基于該“二級抗原”誘導(dǎo)策略，Reinhard 等［20］開發(fā)了負載編碼緊密連接蛋白claudin 6（CLDN6）mRNA的脂質(zhì)體納米疫苗（CARVac）?；剌擟LDN6 CAR-T 細胞后，靜脈注射CARVac，使抗原遞呈細胞表面表達CLDN6，并釋放共刺激信號，從而有效啟動CAR-T細胞擴增。CARVac注射大大提高了小鼠體內(nèi)CART 細胞的數(shù)量，在接種疫苗后第3～4 天達到峰值。體內(nèi)實驗表明，亞治療劑量的CLDN6 CAR-T細胞與單次注射CARVac相結(jié)合，可完全抑制腫瘤生長。

1.2.2 體內(nèi)制造CAR-T細胞

針對體外制造CAR-T過程耗時久、成本高的問題，Smith等［21］開發(fā)了一種表面修飾anti-CD3抗體的聚合物納米顆粒，可在體內(nèi)將編碼194-1BBz CAR和piggyBac 轉(zhuǎn)座酶的質(zhì)粒特異性地共遞送至T 細胞，誘導(dǎo)CAR表達，實現(xiàn)原位在體制造CAR-T細胞。表面修飾的anti-CD3e F（ab′）2 片段可對CD3+T 細胞實現(xiàn)主動靶向，在注射納米顆粒30 h后，就能在T細胞表面檢測到194-1BBz 受體，即產(chǎn)生CAR-T 細胞。此外，為了提高基因轉(zhuǎn)染效率，核定位和微管相關(guān)序列也與CAR基因一并負載，以促進質(zhì)粒進入細胞核。這些設(shè)計可在體內(nèi)有效遞送piggyBac 轉(zhuǎn)座酶，從而在白血病小鼠模型中生產(chǎn)和擴增CAR-T細胞，使白血病小鼠的中位生存期從大約2 周提高到58 d。由于更具時間效益和成本效益，這種體內(nèi)生產(chǎn)CAR-T細胞的策略有可能成為當前體外制備CAR-T 的替代方法。

2 調(diào)控腫瘤微環(huán)境，促進腫瘤殺傷

ACT 療法對實體腫瘤療效有限的最重要原因是實體腫瘤的免疫抑制性微環(huán)境限制了ACT 細胞的浸潤和功能，ACT 細胞在回輸后容易發(fā)生耗竭而無法持續(xù)存活并殺傷腫瘤［22-23］。雖然可以通過對ACT 細胞進行基因修飾以表達特定的細胞因子，或聯(lián)合使用白細胞介素，提高回輸細胞在體內(nèi)的持久性和功能，但往往伴隨劑量限制性不良反應(yīng)。而納米材料不但可以遞送調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的藥物，還可以對免疫細胞進行工程化改造，增強ACT細胞的持久性和體內(nèi)抗腫瘤能力。

2.1 促進免疫細胞穿透

免疫細胞從外周循環(huán)到達腫瘤后，在黏附分子的作用下穿透血管進入腫瘤實質(zhì)僅是其發(fā)揮功能的第一步。免疫細胞還需穿透擴散到腫瘤組織深處，才能充分發(fā)揮對腫瘤細胞殺傷作用。腫瘤微環(huán)境的一個重要特征就是腫瘤組織中T細胞浸潤程度低。研究表明，回輸?shù)腡 細胞中，僅有1%～2%真正浸潤到腫瘤組織中，而腫瘤組織中T 細胞的數(shù)量與過繼細胞治療的臨床療效密切相關(guān)［24］。因此，調(diào)節(jié)腫瘤組織細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）結(jié)構(gòu)，增強T 細胞在腫瘤中穿透是提高ACT 療法的關(guān)鍵之一。

一種解決思路是使用納米顆粒遞送藥物改善ECM 結(jié)構(gòu)。Huang 等［25］構(gòu)建了負載抗纖維化藥物α-mangostin 的磷酸鈣雜化納米脂質(zhì)體（納米工兵），通過逆轉(zhuǎn)異?；罨哪[瘤相關(guān)成纖維細胞，減少膠原沉積，增強細胞毒性T 淋巴細胞（cytotoxic Tlymphocyte，CTL）在免疫排斥型胰腺癌小鼠腫瘤中的浸潤。此外，還可以利用光熱效應(yīng)直接破壞ECM。在黑色素瘤小鼠模型中，瘤內(nèi)注射負載光熱劑吲哚菁綠的聚乳酸-羥基乙酸共聚物［poly（lactic-coglycolic acid），PLGA］納米顆粒并照射近紅外光后，再回輸CAR-T細胞。與單獨使用CAR-T細胞相比，納米顆粒破壞ECM，降低了間質(zhì)流體壓力，改善了CAR-T 細胞在腫瘤組織中的穿透性，提高了CAR-T的抗腫瘤療效［26］。

此外，Ding 等［27］發(fā)現(xiàn)將腫瘤穿透肽iRGD 修飾在T細胞表面，可促進T細胞在3D腫瘤細胞球和多種小鼠移植瘤模型中的浸潤，腫瘤組織中T 細胞的數(shù)量增加10倍。同時將iRGD修飾與程序性死亡受體1（programmed death-1，PD-1）敲除相結(jié)合顯示出協(xié)同的抗腫瘤效果。機制研究表明，iRGD與神經(jīng)纖毛蛋白1（neuropilin1，NRP1）結(jié)合導(dǎo)致血管內(nèi)皮鈣黏蛋白VE-cadherin的酪氨酸磷酸化，而該蛋白是內(nèi)皮屏障調(diào)節(jié)因子，在打開內(nèi)皮細胞接觸和促進跨內(nèi)皮淋巴細胞遷移中發(fā)揮作用。iRGD 修飾為克服過繼免疫細胞在實體瘤中難以穿透的瓶頸提供了一種新的解決思路。

2.2 克服免疫抑制

2.2.1 增強免疫細胞功能

腫瘤免疫抑制微環(huán)境可誘導(dǎo)回輸?shù)腡細胞耗竭甚至死亡。因此，阻斷腫瘤微環(huán)境的免疫抑制作用可以改善T 細胞治療在實體瘤中的療效。例如，Zhang 等［28］構(gòu)建了一種負載PI3K 抑制劑（PI-3065）和恒定自然殺傷T 細胞（invariant natural killer T cell，iNKT cell）激動劑（7DW8-5）的納米脂質(zhì)體，通過重塑腫瘤免疫抑制性微環(huán)境，增效CAR-T 治療。在小鼠4T1 乳腺癌模型中，該脂質(zhì)體可以使髓源性抑制細胞和腫瘤相關(guān)巨噬細胞分別減少3 倍和7 倍，同時使腫瘤浸潤性CD8+T細胞和iNKT細胞的數(shù)量分別增加5倍和20倍。這種聯(lián)合治療為CAR-T細胞治療提供了一個為期2 周的窗口，有利于腫瘤特異性CAR-T細胞定位于腫瘤部位并充分擴增，從而有效地治療實體瘤。

許多細胞因子，如腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、IL-2和IL-15等都可以誘導(dǎo)和維持T細胞的抗腫瘤反應(yīng)。然而由于對游離細胞因子非特異性攝取會引起全身性不良反應(yīng)，它們在臨床治療中仍面臨諸多限制。用納米顆粒遞送細胞因子是調(diào)控免疫細胞胞內(nèi)狀態(tài)或表面信號表達的有效途徑。將IL-2-Fc 通過馬來酰亞胺修飾在納米脂質(zhì)體上，可以在體內(nèi)實現(xiàn)對T細胞的特異性靶向，從而持續(xù)刺激過繼回輸?shù)腡 細胞，促進其增殖［29］。研究結(jié)果顯示，在黑色素瘤小鼠模型中，靜脈注射的脂質(zhì)體可被成功遞送到過繼回輸T細胞表面（＞95%）；肺轉(zhuǎn)移小鼠模型中，脂質(zhì)體則可以持續(xù)地促進T 細胞增殖，其數(shù)量是僅回輸T細胞組的6倍。

2.2.2 逆轉(zhuǎn)免疫細胞耗竭

利用納米藥物逆轉(zhuǎn)T細胞耗竭狀態(tài)也可以增強ACT 的療效。例如，Zheng 等［30］利用特異性表達于pmel-1 Thy1.1+CD8+供體T 細胞的內(nèi)吞型受體CD90，設(shè)計了一種在體內(nèi)直接向過繼性T細胞靶向遞送轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）抑制劑SB525334的脂質(zhì)體。與非內(nèi)吞型受體CD45 相比，盡管兩者都能增加T 細胞表達顆粒酶，但由于內(nèi)源性T細胞，以及B細胞、DC細胞和巨噬細胞也會表達CD45，而CD90（Thy1.1）僅表達于供體T 細胞，在Thy1.2+C57Bl/6 黑色素瘤小鼠模型中，靶向CD90 的脂質(zhì)體在體內(nèi)可以更有效地直接靶向過繼細胞并遞送TGF-β抑制劑，因此，抑制腫瘤生長的效果更顯著。

另一項研究利用聚乳酸/羥基乙酸-聚乙二醇（PLGA-PEG）納米顆粒負載TGF-β 受體抑制劑SD-208，同時修飾anti-PD-1抗體靶向體內(nèi)PD-1+T細胞亞群，成功逆轉(zhuǎn)了體內(nèi)T細胞的耗竭狀態(tài)，恢復(fù)效應(yīng)T細胞功能，從而殺死腫瘤細胞，延長荷瘤小鼠的生存時間［31］。

2.2.3 阻斷免疫檢查點

免疫檢查點是一類免疫抑制性的分子，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中導(dǎo)致免疫耐受的重要原因之一。其中，PD-1在腫瘤浸潤淋巴細胞中以及PD-L1在腫瘤組織中表達的上調(diào)參與了相關(guān)的免疫抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制CD4+T 細胞、CD8+T 細胞增殖、活化，抑制細胞因子的表達，促進了腫瘤細胞逃避機體免疫監(jiān)視和殺傷。因此，靶向PD-1/PD-L1是一種已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于臨床的免疫治療手段。

Kosmides 等［32］構(gòu)建了一種共同遞送anti-4-1BB和anti-PD-L1抗體的“immunoswitch”，來克服腫瘤免疫抑制微環(huán)境。納米顆粒在阻斷腫瘤細胞PD-L1通路的同時，激活CD8+T 細胞的4-1BB 共刺激信號通路，并增強了T 細胞和腫瘤細胞之間的相互作用。與可溶性抗體或遞送單一抗體的納米顆粒相比，“immunoswitch”顯著延緩了黑色素瘤和結(jié)腸癌模型中的腫瘤生長。

含有Src 同源結(jié)構(gòu)域的蛋白酪氨酸磷酸酶2（Src homology phosphotyrosyl phosphatase 2，SHP2）是一種參與調(diào)節(jié)細胞存活和增殖等關(guān)鍵細胞過程的磷酸酶。它是連接多種生長因子、細胞因子和細胞外基質(zhì)受體介導(dǎo)的信號通路（如PI3K/AKT、RAS/Raf/MAPK 和PD-1/PD-L1）的重要樞紐。PD-1 在與其配體結(jié)合后形成負性共刺激微簇，通過募集SHP2直接抑制T細胞受體信號。Li等［33］通過使T細胞攜帶負載SHP2 變構(gòu)抑制劑SHP099 的脂質(zhì)體，抑制PD-1/PD-L1 信號，增強ACT 的療效。SHP099 以納米晶形式存在于脂質(zhì)體內(nèi)，負載效率高，并延長SHP099納米晶在T細胞內(nèi)的保留時間。研究表明，細胞負載的SHP099 能夠持續(xù)抑制PD-1/PD-L1 信號，增強T 細胞的腫瘤殺傷活性。在小鼠腫瘤模型中，負載SHP099的T細胞能夠有效抑制PD-1/PD-L1檢查點信號完全根除腫瘤并維持持久的抗腫瘤免疫記憶。

2.3 免疫細胞納米“背包”

除直接靜脈給藥外，納米顆粒還可以通過一種“背包”策略修飾到免疫細胞表面，提高了遞送的特異性而減少體內(nèi)毒性。納米顆粒釋放的藥物改善腫瘤微環(huán)境的同時，還通過類似自分泌的方式，促進免疫細胞活化，幫助免疫細胞抵抗耗竭［34］。

Stephan 等［35］利用馬來酰亞胺功能化的脂質(zhì)體與T 細胞表面的游離巰基結(jié)合，將納米顆粒修飾在T 細胞的表面。結(jié)果表明，修飾過程不會損害T 細胞對靶細胞的識別、殺傷以及T 細胞的體內(nèi)組織歸巢等關(guān)鍵細胞功能。此外，將IL-15 超級激動劑（IL-15Sa）和IL-21 負載到這些納米顆粒中，可顯著增強黑色素瘤特異性pmel-1 T 細胞的增殖，從而根除腫瘤并提高B16黑色素瘤荷瘤小鼠的存活率。在后續(xù)研究中，他們用含有二硫鍵的雙N-羥基琥珀酰亞胺交聯(lián)劑將IL-15Sa單體交聯(lián)，構(gòu)建了“無載體”蛋白納米凝膠（nanogels，NG）［36］。同時在NG 上偶聯(lián)anti-CD45 抗體，實現(xiàn)NG 在CD8+T 細胞表面的修飾。當NG背包式的CAR-T細胞回輸?shù)胶谏亓鲂∈篌w內(nèi)后可識別黑色素瘤細胞，而抗原特異性的識別增加了T細胞表面的還原電位，使二硫鍵斷裂，從而原位可控釋放IL-15Sa 并誘導(dǎo)CAR-T 細胞擴增。與游離IL-15Sa相比，“背包”策略誘導(dǎo)的T細胞擴增提高16倍。

Hao等［37］報道了一種新的T細胞代謝工程化方法，將負載阿伐麥布的脂質(zhì)體修飾到T細胞表面，而不改變其生理功能。錨定的脂質(zhì)體在腫瘤組織局部緩釋阿伐麥布，通過自分泌和旁分泌雙重作用，同時增加腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）中工程化T 細胞和內(nèi)源性T 細胞細胞膜的膽固醇水平。膽固醇水平的升高可以促進T 細胞受體的快速聚集和有效的T 細胞活化，誘導(dǎo)抗腫瘤免疫。

該策略還可以使免疫細胞克服腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制信號，提高ACT 的療效。通過pH 響應(yīng)的苯亞胺鍵對磁性納米簇（nanocluster，NC）進行anti-PD-1抗體功能化，并修飾在CTL表面。在回輸NC工程化CTL的同時施加磁場，可有效招募輸注的細胞。此外，酸性的腫瘤微環(huán)境可使苯亞胺鍵水解，促進anti-PD-1 抗體的局部釋放，從而在小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移模型中進一步提高CTL 的抗腫瘤效果［38］。在另一項研究中，CD19 特異性CAR-T 細胞表面偶聯(lián)修飾多層脂質(zhì)體囊泡，囊泡中負載了A2a 腺苷受體小分子拮抗劑（SCH-58261），可抑制T 細胞表面的A2a 受體與腺苷之間的相互作用，從而避免T 細胞失活［39］。在工程化過表達CD19的卵巢癌小鼠模型中，這種治療策略增強了T 細胞在腫瘤部位的積累，并成功逆轉(zhuǎn)了免疫抑制性腫瘤微環(huán)境，從而提高了CAR-T細胞的治療效果。

2.4 克服抗原丟失

T細胞介導(dǎo)的腫瘤細胞殺傷依賴于TCR與腫瘤細胞表面抗原之間的相互作用。腫瘤細胞可通過減少其表面的pMHC、共刺激分子或表達免疫檢查點分子來逃避T 細胞殺傷，甚至產(chǎn)生耐藥［40］。Sun 等［41］提出了一種靶向重定向的通用CAR-T 細胞治療策略，將外源性抗原負載到膜融合型脂質(zhì)體上，脂質(zhì)體與細胞膜直接融合從而將抗原肽有效修飾到腫瘤細胞膜上，為后續(xù)的CAR-T 細胞治療提供靶點，可以在腫瘤缺乏相應(yīng)靶點的情況下將CAR-T 細胞定向到腫瘤，發(fā)揮抗腫瘤作用。

3 細胞作為載體遞送化療藥物

3.1 靶向遞送化療藥物

近年來，基于人體自身的各類細胞，如紅細胞、干細胞、淋巴細胞等構(gòu)建的藥物遞送系統(tǒng)也受到廣泛關(guān)注。與合成材料相比，細胞作為藥物載體，免疫原性低，具有更好的生物相容性和體內(nèi)長循環(huán)能力。特別是免疫細胞由于自身獨特的生理功能，能夠?qū)Σ±憝h(huán)境中的特異性信號產(chǎn)生應(yīng)答，經(jīng)工程化改造后作為藥物載體直接遞送化療藥物可以跨越生物屏障，具有獨特的靶向性優(yōu)勢。例如，通過巨噬細胞遞送負載阿霉素（doxorubicin，Dox）的二氧化硅納米膠囊（Dox-silica nanocomplexes，DSN）［42］。二氧化硅隱形外殼可增加DSN在細胞中的存續(xù)時間，并相應(yīng)延長Dox的胞吐分泌。靜脈注射的工程化巨噬細胞可以有效聚集在腫瘤組織中，并顯著增加TME 中的局部Dox 濃度，抑制腫瘤生長，同時降低Dox的全身毒性。

免疫細胞由于具有向病理環(huán)境趨化，以及在受到刺激時釋放細胞內(nèi)生物分子的特性，可以做為遞送系統(tǒng)實現(xiàn)藥物的靶向遞送。Xue等［43］利用中性粒細胞穿透血腦屏障的能力，構(gòu)建了一種基于中性粒細胞的紫杉醇（paclitaxel，PTX）遞送系統(tǒng)，該系統(tǒng)在膠質(zhì)瘤部位局部釋放PTX，可以抑制惡性膠質(zhì)瘤術(shù)后復(fù)發(fā)。該研究用陽離子磷脂HG2C18 負載PTX，制備載藥脂質(zhì)體并內(nèi)化于中性粒細胞中。載有脂質(zhì)體的中性粒細胞通過感知趨化梯度而自發(fā)地轉(zhuǎn)運穿過血腦屏障，并在膠質(zhì)瘤術(shù)后殘余處產(chǎn)生中性粒細胞胞外陷阱，將PTX遞送至殘留的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞并抑制腫瘤生長和復(fù)發(fā)。

通過馬來酰亞胺-巰基反應(yīng)，Huang等［44］將負載拓撲異構(gòu)酶Ⅰ抑制劑SN-38的脂質(zhì)體化學偶聯(lián)到表達淋巴結(jié)歸巢配體的自體多克隆T 細胞表面，利用T 細胞向淋巴器官轉(zhuǎn)運的固有能力，精確治療隱藏在淋巴結(jié)中的播散性淋巴瘤細胞。與游離藥物相比，回輸SN-38 的工程化T 細胞將淋巴結(jié)中的藥物濃度提高了90 倍。局部較高的SN-38 濃度顯著提高了對淋巴瘤細胞的殺傷效率，延長了播散性淋巴瘤小鼠的生存期。

3.2 “化療+免疫”聯(lián)合治療

利用ACT 細胞負載化療藥物，還可以實現(xiàn)“化療+免疫”治療的協(xié)同效果。Siegler等［45］將負載PTX的多層脂質(zhì)體囊泡（cMLV PTX）修飾在靶向CD19的嵌合抗原受體自然殺傷細胞（CAR-NK）表面，在CAR-NK 細胞殺傷SKOV3.CD19 腫瘤的同時，聯(lián)合靶向遞送PTX。結(jié)果表明接受載藥細胞治療的小鼠腫瘤體積明顯小于聯(lián)合治療組（cMLV PTX+CARNK），此外，由于提高了遞送的靶向性，相應(yīng)降低了PTX的劑量，減小了PTX相關(guān)的不良反應(yīng)。Im等［46］利用馬來酰亞胺-巰基偶聯(lián)方法，在NK 細胞表面修飾負載Dox的pH敏感型聚合物膠束，以實現(xiàn)對腫瘤細胞的特異性藥物遞送。通過巧妙利用NK細胞與靶細胞結(jié)合形成免疫突觸，釋放酸性顆粒物殺傷靶細胞的特點，借助突觸酸化觸發(fā)結(jié)合在NK 細胞表面的聚合物膠束解離，釋放Dox 從而協(xié)同殺傷腫瘤細胞。

4 展 望

CAR-T 治療在血液腫瘤中的成功應(yīng)用為腫瘤免疫治療開辟了新的途徑，促進了針對實體瘤的過繼性細胞免疫治療的研究。然而由于實體瘤的生理屏障和免疫抑制微環(huán)境，ACT 僅在少數(shù)實體腫瘤中取得進展，同時伴隨了細胞因子釋放綜合征和神經(jīng)毒性等嚴重的不良反應(yīng)，因此仍面臨諸多挑戰(zhàn)。隨著納米技術(shù)和納米醫(yī)學的發(fā)展，納米材料成為促進ACT細胞增殖、活化和腫瘤浸潤，逆轉(zhuǎn)耗竭，克服免疫抑制的重要方法，在臨床前研究方面取得了令人鼓舞的進展，但仍存在一定不足。

首先，需要進一步優(yōu)化納米顆粒靶向遞送的效率?？梢酝ㄟ^構(gòu)建具有精確定位和可控釋放能力的多功能納米藥物，對過繼細胞進行智能的工程化設(shè)計。還可以通過高通量篩選、基于結(jié)構(gòu)-活性分析數(shù)據(jù)集的機器學習算法，以預(yù)測納米藥物的最佳物理化學結(jié)構(gòu)［47］。其次，納米材料需要進一步合理設(shè)計。作為遞送系統(tǒng)時，納米藥物復(fù)雜的組成以及尺寸、表面電荷、形狀、配體密度、剛性等物理性質(zhì)，影響了納米材料與免疫細胞間的生物化學或機械相互作用，從而可能改變ACT 細胞的狀態(tài)與功能，無法實現(xiàn)ACT療效的最優(yōu)化。再次，目前納米材料增強腫瘤ACT治療的研究側(cè)重于CAR-T細胞治療，可以更廣泛地應(yīng)用于其他的過繼細胞治療，如TCR-T、TIL、巨噬細胞和自然殺傷細胞，進一步拓寬納米藥物的應(yīng)用范圍。最后，納米材料的設(shè)計應(yīng)以臨床應(yīng)用為導(dǎo)向。利用納米材料對ACT 細胞工程化改造可能帶來的不良反應(yīng)以及納米材料自身毒性的長期、全面監(jiān)測在臨床評估中非常必要。更重要的是，隨著對納米材料多功能、智能化設(shè)計的深入，整個體系的復(fù)雜性不斷增強，導(dǎo)致在最終應(yīng)用時的生產(chǎn)成本、安全和有效性的質(zhì)量控制要求也相應(yīng)增加。因此，未來研究應(yīng)兼顧原始創(chuàng)新和臨床應(yīng)用，充分考慮商業(yè)化生產(chǎn)與臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用階段的實際需求。

綜上所述，對納米材料的持續(xù)優(yōu)化將進一步拓展ACT療法的應(yīng)用，并加速其臨床轉(zhuǎn)化。對納米材料與免疫細胞相互作用生物學過程的深入理解，也將在免疫學研究和腫瘤臨床免疫治療中取得新的突破。納米藥物在促進免疫細胞擴增、改變免疫細胞活性和克服實體瘤障礙方面取得了重要進展，在增強腫瘤ACT治療中具有良好的應(yīng)用前景。