燕麥紅葉病介體蚜蟲獲毒前后差異表達(dá)基因分析

王 穎，魏淑花，張 蓉，馬建華，朱猛蒙

（寧夏農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所，銀川 750002）

燕麥（Avena sativaL.）是一年生糧飼兼用作物，具有耐寒、抗旱、耐貧瘠、耐鹽堿、適應(yīng)性強(qiáng)的特性，燕麥葉片、秸稈多汁柔嫩，適口性好，秸稈中粗蛋白、粗脂肪及無氮抽出物含量高，難消化纖維含量低，是寧夏回族自治區(qū)（以下簡稱寧夏）奶業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的重要飼草支撐，對穩(wěn)定中國畜牧業(yè)發(fā)展、平衡農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)和生態(tài)環(huán)境保護(hù)具有重要作用［1-3］。

隨著燕麥的大面積種植及燕麥產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，病蟲害的發(fā)生愈發(fā)嚴(yán)重［4］。其中，燕麥紅葉病是由蚜蟲傳播大麥黃矮病毒（Barley yellow dwarf virus，BYDV）引起的病毒病。該病不僅會引起燕麥莖葉發(fā)紅發(fā)紫、碳氮代謝紊亂、根際硝酸鹽累積、植株韌皮部組織壞死等，而且會造成植株矮化、分蘗減少、穗粒數(shù)減少乃至小穗不孕等，嚴(yán)重影響燕麥的品質(zhì)和產(chǎn)量，通?？稍斐?0%～50%的產(chǎn)量損失［5，6］，其已成為制約燕麥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要病害［7，8］。麥長管蚜（Sitobion avenae）是燕麥產(chǎn)區(qū)的常發(fā)性蚜蟲，也是燕麥紅葉病的主要媒介昆蟲。探討B(tài)YDV 與麥長管蚜互作的分子機(jī)制，旨在為燕麥產(chǎn)業(yè)病蟲害防控提供理論依據(jù)。

轉(zhuǎn)錄組是生物體特定組織或特定細(xì)胞在某一階段產(chǎn)生的所有轉(zhuǎn)錄的集合，可用于比較該組織或細(xì)胞在不同處理條件下的基因表達(dá)差異［9-11］。利用差異表達(dá)基因分析、基因挖掘及基因結(jié)構(gòu)分析的研究，在對昆蟲生命活動過程中相關(guān)基因、昆蟲與其他生物互作等方面的研究中發(fā)揮重要作用［12，13］。本研究對麥長管蚜進(jìn)行飼毒（獲毒）處理，利用轉(zhuǎn)錄組對感染BYDV 后麥長管蚜的基因表達(dá)進(jìn)行研究，以期從分子層面上探討B(tài)YDV 與麥長管蚜的互作機(jī)制，為防治燕麥紅葉病提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在蚜蟲發(fā)生初期，從寧夏銀川市西夏區(qū)園林場燕麥種植區(qū)田間采集無翅麥長管蚜成蚜，收集所產(chǎn)若蚜，轉(zhuǎn)移至溫室防蟲網(wǎng)內(nèi)栽培的健康燕麥幼苗上飼養(yǎng)，在人工氣候室內(nèi)進(jìn)行續(xù)代繁殖，進(jìn)行PCR 檢測，確保該麥長管蚜群體不攜帶大麥黃矮病毒。在燕麥紅葉病盛發(fā)期，從田間采集帶有燕麥紅葉病典型癥狀的燕麥葉片，帶回實驗室內(nèi)進(jìn)行PCR 檢測，確保采集的葉片攜帶BYDV。

1.2 飼毒（獲毒）處理

將室內(nèi)飼養(yǎng)的無毒麥長管蚜置于20 ℃人工氣候箱中饑餓12 h。饑餓處理后，將無毒蚜蟲分別置于裝有健康燕麥葉片和帶毒燕麥葉片的培養(yǎng)皿內(nèi)，在20 ℃人工氣候箱黑暗條件下飼毒72 h，使無毒蚜蟲充分獲毒。將獲毒的蚜蟲處理組及對照組蚜蟲分別裝入凍存管進(jìn)行編號，每個凍存管由20 頭蚜蟲組成，每個處理設(shè)置3 個生物學(xué)重復(fù)，共計6 份樣品，液氮凍存后置于-80 ℃超低溫冰箱保存，用于RNA的提取。

1.3 總RNA 提取及轉(zhuǎn)錄組測序

總RNA 采用Trizol 法提取，采用1%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000 分光光度計分析RNA 降解程度和純度，使用Agilent 2100 檢測RNA 完整性，委托北京組學(xué)生物科技有限公司采用Illumina HiSeq 測序平臺對獲毒和未獲毒的麥長管蚜樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。

1.4 測序數(shù)據(jù)分析

測序得到的原始數(shù)據(jù)過濾，去除接頭序列以及低質(zhì)量數(shù)據(jù)，獲得高質(zhì)量數(shù)據(jù)，利用Hisat2 將高質(zhì)量數(shù)據(jù)與參考基因組進(jìn)行序列比對，獲得注釋信息。使用BLAST 軟件將獲得的unigenes 與NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、Pfam、KEGG 七大數(shù)據(jù)庫比對，獲得unigenes 的功能分類信息。

利用DEseq2 方法進(jìn)行樣品間的差異表達(dá)分析，然后對差異檢驗的P-value 作多重假設(shè)檢驗校正，通過控制FDR來決定P-value 的閾值，得到差異檢驗的FDR值，根據(jù)基因的表達(dá)量計算該基因在不同樣本間的差異表達(dá)倍數(shù)。將|Fold Change|≥1.5 且FDR＜0.01 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，對篩選獲得的差異表達(dá)的基因進(jìn)行KEGG 和GO 功能分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)分析

利用Illumina HiSeq 測序平臺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，測序數(shù)據(jù)質(zhì)量情況見表1。由表1 可知，獲毒組和對照組6 份樣品共獲得51.57 Gb 的高質(zhì)量數(shù)據(jù)，各樣本平均產(chǎn)出超過7.07 Gb 的高質(zhì)量數(shù)據(jù)，Q20 均在97.76%及以上，Q30 均在92.69%及以上，表明該測序結(jié)果質(zhì)量高，可以用于后續(xù)分析。

表1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量情況

對預(yù)測的unigenes 進(jìn)行基因注釋，分別與七大數(shù)據(jù)庫比對分析，結(jié)果見表2。由表2可知，最終獲得28 798 條有注釋信息的unigenes；11 342 條unigenes注釋到KEGG 數(shù)據(jù)庫的267 個代謝通路上；8 422 條unigenes 比對上KOG 數(shù)據(jù)庫，并被分為25 個功能類別；10 452 條unigenes 被成功注釋到GO 數(shù)據(jù)庫中。

表2 七大數(shù)據(jù)庫比對分析結(jié)果

2.2 差異表達(dá)基因分析

采用|Fold Change|≥1.5，F(xiàn)DR＜0.01 為閾值篩選獲毒蚜蟲和未獲毒蚜蟲2 個轉(zhuǎn)錄本間的差異表達(dá)基因，結(jié)果見圖1。由圖1 可知，2 個轉(zhuǎn)錄本間共篩選到622 個差異表達(dá)基因，其中406 個表達(dá)上調(diào)，216 個表達(dá)下調(diào)。在篩選到的差異表達(dá)基因中，53 個差異基因能與NCBI的非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫比對并獲得注釋。

圖1 獲毒組與對照組麥長管蚜的差異基因火山

2.3 差異表達(dá)基因的GO 功能分析

對差異表達(dá)的基因進(jìn)行GO 分析，36 個差異表達(dá)的基因被聚類到GO 的三大功能中，生物過程、分子功能和細(xì)胞成分中分別有30、53 和26 個基因，并且主要聚類在生物過程的代謝過程、細(xì)胞過程和生物調(diào)節(jié)；分子功能的結(jié)合和催化活性；細(xì)胞成分的細(xì)胞部分、細(xì)胞器和生物膜。篩選出20 個富集最顯著的GO 功能，結(jié)果見圖2。由圖2 可知，在生物過程分類中，注釋數(shù)量最多的是腺嘌呤核苷酸補(bǔ)救代謝，最低的是核苷酸代謝過程。在分子功能中顯著性最高的為黃酮腺嘌呤二核苷酸結(jié)合，數(shù)量最低的為堿性磷酸酶活性。差異表達(dá)與代謝過程和催化活性相關(guān)的基因明顯上調(diào)，說明麥長管蚜感染BYDV 后的代謝活動增強(qiáng)。

圖2 差異表達(dá)基因的GO 富集

2.4 差異表達(dá)基因的KEGG 功能分析

對差異表達(dá)的基因進(jìn)行KEGG 分析，有32 個差異表達(dá)的基因被注釋到KEGG 的77 個代謝通路中。通過進(jìn)一步統(tǒng)計分析代謝通路，篩選出前20 條富集最顯著的通路（圖3），主要有肌動蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)、PI3K-Akt 信號通路、軸突的導(dǎo)向、AMPK 信號通路和Ras 信號通路等。其中，差異基因注釋到通路數(shù)量最多的是軸突導(dǎo)向，其次是PI3K-Akt 信號通路。篩選出8 個與免疫相關(guān)的差異表達(dá)基因，分別參與細(xì)胞免疫相關(guān)的溶酶體途徑、吞噬體途徑、MAPK 信號途徑、Toll 樣受體信號途徑、Jak-STAT 信號途徑以及TGF-beta 信號途徑等，其中6 個基因的表達(dá)量上調(diào)。

圖3 差異表達(dá)基因的KEGG 富集

3 小結(jié)

本研究發(fā)現(xiàn)，帶毒蚜蟲催化活性相關(guān)的基因表達(dá)高于未帶毒蚜蟲。病毒在入侵宿主過程時會消耗大量的物質(zhì)和能量，因此BYDV 可能會通過調(diào)節(jié)麥長管蚜體內(nèi)的物質(zhì)代謝活動，為BYDV 的入侵和增殖提供營養(yǎng)物質(zhì)和能量。

本研究發(fā)現(xiàn)獲毒后的麥長管蚜體內(nèi)與溶酶體、吞噬體等途徑相關(guān)的基因表達(dá)明顯上調(diào)。細(xì)胞自噬是1 個重要的昆蟲抗病毒免疫途徑［14］，這表明細(xì)胞自噬在麥長管蚜中可能起抗病毒的作用。

MAPK 信號途徑、Toll 樣受體信號路徑、Jak-STAT 信號途徑和TGF-beta 信號途徑都參與昆蟲的免疫反應(yīng)［15-17］。帶毒麥長管蚜體內(nèi)與這些信號途徑相關(guān)的基因的表達(dá)部分下調(diào)，說明BYDV 入侵麥長管蚜后，通過下調(diào)這些與免疫信號途徑相關(guān)的基因抑制麥長管蚜的免疫反應(yīng)。此外，這些免疫信號途徑還參與了細(xì)胞增殖、分化等生長發(fā)育過程［18，19］，病毒感染宿主媒介麥長管蚜后抑制了這些基因的表達(dá)，說明這些基因下調(diào)很可能降低麥長管蚜存活率［20］。

麥長管蚜對BYDV 的抵抗能力由多種代謝反應(yīng)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑共同調(diào)控。后續(xù)可以從轉(zhuǎn)錄組學(xué)檢測到的代謝與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路入手，研究代謝與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在麥長管蚜傳毒的作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究BYDV 與蚜蟲互作關(guān)系提供依據(jù)。此外，深入研究昆蟲免疫系統(tǒng)能夠提高農(nóng)藥控害效率［21］，特別是對利用和開發(fā)生物農(nóng)藥進(jìn)行害蟲防治提供了重要的理論依據(jù)。