子宮頸癌組織中白細(xì)胞介素33、腫瘤發(fā)生抑制蛋白2表達(dá)變化分析

張玉蓮，朱玥潔，王碧輝，阿迪萊·扎克爾，陳志芳

1 新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科中心，烏魯木齊 830054；2 省部共建中亞高發(fā)病成因與防治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3 新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖助孕中心

子宮頸癌是常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)慢性的持續(xù)過(guò)程，由人乳頭瘤病毒（HPV）感染形成子宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN），進(jìn)一步發(fā)展為浸潤(rùn)癌［1］。有研究表明，HPV 感染機(jī)體后，免疫細(xì)胞因子在激活免疫系統(tǒng)及清除病毒過(guò)程中發(fā)揮重要作用。白細(xì)胞介素33（IL-33）屬于IL-1基因家族成員，是一種組織來(lái)源的核細(xì)胞因子，在正常人體組織中的內(nèi)皮細(xì)胞及上皮細(xì)胞核中表達(dá)。當(dāng)內(nèi)皮或上皮細(xì)胞受損時(shí)，IL-33 快速分泌或釋放，作為危險(xiǎn)信號(hào)發(fā)揮其警報(bào)作用，構(gòu)成抵御病原體的第一道防線［2-4］。腫瘤發(fā)生抑制蛋白2（ST2）是IL-33 的特異性受體，IL-33 通過(guò)與ST2 結(jié)合形成的異二聚體受體復(fù)合物來(lái)觸發(fā)下游信號(hào)，介導(dǎo)多種生理病理過(guò)程中的生物學(xué)效應(yīng)［5-6］。近年來(lái)，IL-33/ST2 信號(hào)通路已被報(bào)道在越來(lái)越多的疾病發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用，特別是在腫瘤微環(huán)境中具有雙重作用，但兩者是否參與子宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程尚不清楚?；诖?，本研究觀察了子宮頸癌組織中IL-33、ST2 蛋白及mRNA 表達(dá)變化，并初步探討其與子宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系，以期為深入探究IL-33/ST2 信號(hào)通路在子宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（20210226-18），選取2021 年1 月—2022年1月就診于我院行手術(shù)治療或病理活檢的子宮頸病變患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理診斷確診為CIN 或子宮頸癌；子宮頸癌組織學(xué)類(lèi)型屬鱗狀細(xì)胞癌；簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤；有嚴(yán)重心肺、腎臟疾病或免疫性疾病史；臨床資料不完整。共選取140 例子宮頸病變患者，其中CINⅠ級(jí)20 例、CINⅡ～Ⅲ級(jí)30 例、子宮頸癌50 例；另選取在我院因良性子宮肌瘤進(jìn)行子宮全切并且病理診斷為子宮肌瘤患者40例作為對(duì)照。

1.2 子宮頸病變及正常組織樣本獲取 子宮頸癌、CIN 及子宮肌瘤患者分別在行手術(shù)治療或病理活檢時(shí)取子宮頸癌、CIN 及正常子宮頸組織樣本，樣本離體后分為兩份，一份迅速置于液氮或-80 ℃凍存用于RT-qPCR 檢測(cè)，一份在4%多聚甲醛浸泡24 h 后石蠟包埋切片用于免疫組織化學(xué)染色。

1.3 子宮頸病變及正常組織IL-33、ST2 蛋白檢測(cè)采用免疫組織化學(xué)染色。將石蠟包埋的4 μm 厚度子宮頸癌、CIN及正常子宮頸組織切片，60 ℃烤片2 h，在二甲苯中脫蠟，然后在分級(jí)乙醇中水化，蒸餾水溶液沖洗3 次，每次5 min。在pH 9.0 的Tris-EDTA 抗原修復(fù)液中進(jìn)行微波修復(fù)，PBS 緩沖液沖洗3 次，每次5 min，將切片用0.3% Triton X-100 室溫孵育10 min，PBS 緩沖液沖洗3 次，每次5 min，然后用3%過(guò)氧化氫溶液常溫孵育10 min，PBS 緩沖液沖洗3 次，每次5 min。分別加入稀釋至1∶200 的IL-33、ST2 抗體（武漢Proteintech），4 ℃冰箱濕盒過(guò)夜。第二天復(fù)溫1 h，PBS 緩沖液沖洗3 次，每次5 min，與HRP 偶聯(lián)的二抗（武漢Proteintech）室溫下孵育30 min，DAB 顯色2 min，蘇木素染色、鹽酸乙醇分化后用梯度乙醇脫水，二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片后，光學(xué)顯微鏡（×400）下隨機(jī)選取5 個(gè)不同視野，依照陽(yáng)性細(xì)胞百分比及染色強(qiáng)度對(duì)切片進(jìn)行評(píng)分。染色強(qiáng)度評(píng)分：不著色為0 分，淺黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3分。陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分：＜10%為0分，10%～＜25%為1分，25%～＜50%為2分，50%～＜80%為3 分，≥80%為4。將兩項(xiàng)評(píng)分相乘，乘積＜4 分為IL-33、ST2陰性，≥4為IL-33、ST2陽(yáng)性。

1.4 子宮頸病變及正常組織IL-33、ST2 mRNA檢測(cè)采用RT-qPCR法。取凍存的子宮頸癌、CIN及正常子宮頸組織樣本，每50～100 mg 組織剪碎后加入1 mL TRIzol用組織研磨儀研磨后取上清，加入200 μL氯仿4 ℃離心15 min后加入到新的EP管，加入500 μL異丙醇室溫靜置10 min，離心10 min棄上清，加入用DEPC水配置的75%乙醇1 mL，離心5 min清洗兩次，干燥后加入50～100 μL RNA-free 水溶解RNA 沉淀。用NanoDrop2000測(cè)定RNA 樣品濃度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa）操作首先去除RNA中的DNA，37 ℃15 min、85 ℃ 5 s反轉(zhuǎn)錄為cDNA。參照實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒（日本TaKaRa）擴(kuò)增DNA，反應(yīng)體系為10 μL，引物濃度為0.4 μmol/L。引物由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司合成，引物序列：IL-33上游引物5'-CTGTGGAGTGCTTTGCCTTT-3'，下游引物5'-TCCTTGTTGTTGGCATGCAA-3'；ST2 上游引物5'-ATGTGATGACTGAGGACGCA-3'，下游引物5'-CTTGCTCATCCTTGACCGTG-3'；GAPDH 上游引物5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAG-3'，下游引物5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。PCR 擴(kuò)增條件：95 ℃30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，以2-ΔΔCt計(jì)算IL-33、ST2 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0 及GraphPad Prism9.5.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用Kolmogorov-Smirnov進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，Bartlett法進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊且呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以-x±s表示，組間兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，組間比較行χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮頸病變及正常組織IL-33、ST2蛋白表達(dá)比較 子宮頸癌、CIN及正常子宮頸組織IL-33陽(yáng)性表達(dá)率分別為35.60%、28.00%、8.06%，ST2陽(yáng)性表達(dá)率分別為28.63%、17.65%、6.58%；IL-33、ST2蛋白表達(dá)子宮頸癌組織＞CIN組織＞正常子宮頸組織（P均＜0.05）。

2.2 子宮頸病變及正常組織IL-33、ST2 mRNA表達(dá)比較 子宮頸癌、CIN 及正常子宮頸組織IL-33 mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為1.74 ± 0.25、1.42 ±0.18、1.01 ± 0.01，ST2 mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為1.84 ± 0.18、1.55 ± 0.22、1.01 ± 0.01；IL-33、ST2 mRNA 表達(dá)子宮頸癌組織＞CIN 組織＞正常子宮頸組織（P均＜0.05）。

2.3 不同臨床病理特征子宮頸癌患者癌組織IL-33、ST2 蛋白表達(dá)比較 不同腫瘤肌層浸潤(rùn)深度分化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的子宮頸癌患者癌組織IL-33、ST2 蛋白表達(dá)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），不同年齡、腫瘤大小、分化程度及FIGO 分期的子宮頸癌患者癌組織IL-33、ST2 蛋白表達(dá)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 不同臨床病理特征子宮頸癌患者癌組織IL-33、ST2蛋白表達(dá)比較

3 討論

子宮頸癌是女性常見(jiàn)惡性腫瘤，發(fā)病率及病死率均較高。盡管目前普及了子宮頸癌篩查和疫苗接種，但是子宮頸癌高發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)依然存在，并且晚期子宮頸癌的存活率較低［7］。得益于靶向免疫治療研究的發(fā)展，近年來(lái)免疫分子的在腫瘤治療中的作用越來(lái)越受到重視［8］。IL-33 是近年來(lái)頗受關(guān)注的多效性免疫分子，因?yàn)榫哂信c其他IL-1 家族成員相似的三維結(jié)構(gòu)，所以被定義為IL-1 家族的成員［9］。研究發(fā)現(xiàn)，IL-33在Th2細(xì)胞上表達(dá)，并且可以激活Th1細(xì)胞、Ⅱ型固有淋巴（ILC2）細(xì)胞、Treg 細(xì)胞、CD8+T 淋巴細(xì)胞及NK 細(xì)胞等免疫細(xì)胞，其在屏障組織上皮細(xì)胞和淋巴器官成纖維細(xì)胞網(wǎng)狀細(xì)胞中具有強(qiáng)烈的核表達(dá)，當(dāng)機(jī)體感染或屏障受損時(shí)，IL-33 釋放起到警示作用。IL-33 能夠驅(qū)動(dòng)細(xì)胞因子發(fā)揮Th1 細(xì)胞介導(dǎo)的抗病毒免疫應(yīng)答保護(hù)［10］；也可作為2 型免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)劑，通過(guò)腫瘤微環(huán)境驅(qū)動(dòng)2型免疫，介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生發(fā)展［11］。研究表明，IL-33與多種疾病的免疫機(jī)制有關(guān)，包括過(guò)敏、纖維化、感染及腫瘤等。

ST2 作為IL-33 的特異性受體，在ILC2 細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞中表達(dá)。IL-33 可以與其受體ST2 及共受體IL-1 受體輔助蛋白（IL-1RAP）形成的異二聚體結(jié)合，通過(guò)IL-1RAP 的TIR 結(jié)構(gòu)域進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)，激活核因子κB 及MAP 激酶，并驅(qū)動(dòng)體外極化Th2 細(xì)胞產(chǎn)生Th2 相關(guān)細(xì)胞因子來(lái)發(fā)揮其活性。相關(guān)研究表明，IL-33/ST2信號(hào)通路可以通過(guò)激活免疫抑制細(xì)胞重塑腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)癌癥的發(fā)展。XU 等［12］研究發(fā)現(xiàn)，IL-33/ST2 軸能夠通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞改變腫瘤微環(huán)境，介導(dǎo)線粒體自噬及其極化來(lái)影響腫瘤生長(zhǎng)。EISSMANN 等［13］通過(guò)建立IL-33 缺乏ST2-/-小鼠模型證明IL-33/ST2 信號(hào)缺乏可以降低小鼠胃腫瘤的生長(zhǎng)，且小鼠在100 日齡時(shí)總體腫瘤負(fù)荷顯著降低，提示IL-33/ST2 信號(hào)通路激活可能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

本研究首先通過(guò)免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，IL-33、ST2 在子宮頸癌組織中的表達(dá)高于CIN 組織和正常子宮頸組織，而在正常子宮頸組織中幾乎未檢測(cè)到IL-33、ST2陽(yáng)性表達(dá)，并且腫瘤肌層浸潤(rùn)深度深、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮頸癌患者癌組織中IL-33、ST2 表達(dá)更高，提示IL-33、ST2可能參與了子宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，IL-33/ST2信號(hào)通路的激活與子宮頸癌的惡性進(jìn)展有關(guān)。但目前關(guān)于IL-33/ST2 信號(hào)通路參與調(diào)控子宮頸癌發(fā)病的免疫學(xué)機(jī)制尚不清楚，需要體外實(shí)驗(yàn)和小鼠模型研究其在子宮頸癌及其腫瘤微環(huán)境中如何通過(guò)介導(dǎo)免疫細(xì)胞因子發(fā)揮促癌作用。

綜上所述，IL-33、ST2在子宮頸癌組織中表達(dá)升高，其表達(dá)與子宮頸癌患者肌層浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，提示IL-33、ST2 可能參與了子宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，其異常表達(dá)可能與子宮頸病變的惡性進(jìn)展存在相關(guān)性，且在腫瘤形成后可能促進(jìn)了子宮頸癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。我們計(jì)劃在日后的研究中通過(guò)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)分析IL-33/ST2 信號(hào)通路如何通過(guò)激活腫瘤微環(huán)境中的多種免疫相關(guān)細(xì)胞發(fā)揮促癌或抑癌作用。