子宮內(nèi)膜癌組織LncRNA OGFRP1、TDRG1表達變化及其與PI3K/AKT信號通路和預后的關(guān)系

邢堃，宋丹，康程

1 北京航天總醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100076；2 首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦瘤科

子宮內(nèi)膜癌（EC）是女性生殖系統(tǒng)常見惡性腫瘤，早期EC預后較好，但中晚期EC因缺乏有效治療方式預后較差［1］。因此，尋找相關(guān)分子標志物有利于指導EC 的臨床治療。長鏈非編碼核糖核酸（LncRNA）是一類真核生物中長度大于200 nt的非編碼RNA 分子，能夠通過調(diào)控多種靶基因和信號通路參與EC的發(fā)生發(fā)展［2］。阿片類生長因子受體假基因1（OGFRP1）是新近發(fā)現(xiàn)的一種LncRNA，可用于預測結(jié)直腸癌患者的預后［3］，近期研究發(fā)現(xiàn)其在EC 中異常表達［4］。另有研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA TDRG1 對宮頸癌預后有一定的預測作用［5］，且其異常表達參與了EC 的發(fā)生發(fā)展［6］。既往研究顯示，磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號通路參與EC 的發(fā)生發(fā)展［7］。但是，LncRNA OGFRP1、TDRG1 在EC 中是否與PI3K/AKT 存在調(diào)控關(guān)系及其與預后的關(guān)系尚不明確。2016 年1 月—2019 年12 月，本研究觀察了EC 組織LncRNA OGFRP1、TDRG1 表達變化并分析其與PI3K/AKT 信號通路和預后的關(guān)系，旨在為臨床防治EC提供更多依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 經(jīng)北京航天總醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準［（2015）臨床（139）］，選取2016年1月—2019年12 月我院及首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院收治的EC患者作為研究對象。納入標準：①經(jīng)實驗室檢查、病理檢查確診為EC；②心肝腎等臟器功能正常；③臨床資料完整；④受試者及家屬簽署知情同意書。排除標準：①國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）分期為Ⅳ期；②伴有急慢性感染、免疫系統(tǒng)疾??；③合并其他部位惡性腫瘤；④無法配合檢查及隨訪。共收集符合標準的EC 患者90 例，患者年齡（50.17 ± 5.82）歲，分化程度低分化39例、中高分化51例，組織學分型Ⅰ型75 例、Ⅱ型15 例，F(xiàn)IGO 分期Ⅰ～Ⅱ期55 例、Ⅲ期35例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例、未轉(zhuǎn)移72例。

1.2 EC 和癌旁組織LncRNA OGFRP1、TDRG1 及PI3K、AKT mRNA 檢測方法 采用RT-qPCR 法。取EC患者病理活檢時腫瘤組織及相應癌旁組織（距腫瘤組織≥5 cm 且經(jīng)病理證實為正常組織），使用TRIzol 試劑盒（上海源葉生物科技有限公司）提取EC患者癌組織和癌旁組織的總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京伊塔生物科技有限公司）合成cDNA，使用實時熒光定量試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司）進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應，嚴格按照試劑盒說明書操作。引物序列：LncRNA OGFRP1上游引物5'-TGGCTGCCCACAAGATAATG-3'，下游引物5'-GCCTCCCATCAAAAGCTCCT-3'；LncRNA TDRG1上游引物5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'，下游引物5'-TGGGCCAGGGAGCAGCTGGTG-3'；PI3K上游引物5'-CCACGACCATCATCAGGTGAA-3'，下游引物5'-CCACGACCATCATCAGGTGAA-3'；AKT上游引物5'-TCCTCCTCAAGAATGATGGCA-3'，下游引物5'-GTGCGTTCGATGACAGTGGT-3'；GAPDH上游引物5'-TCAATGTCGGCGCCTATTTC-3'，下游引物5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'。反應條件：90 ℃ 95 s，90 ℃ 35 s，60 ℃ 35 s，70 ℃ 18 s，共40個循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參，按2-ΔΔCt計算LncRNA OGFRP1、TDRG1 及PI3K、AKT mRNA 的相對表達量。根據(jù)EC 組織中LncRNA OGFRP1、TDRG1 的表達均值將患者分為LncRNA OGFRP1、TDRG1 高表達者及低表達者。

1.3 預后隨訪方法 EC 患者出院后隨訪3 年，隨訪形式為電話或門診，隨訪終止事件為患者死亡或隨訪截止時間（2022 年12 月），統(tǒng)計并計算患者3 年總生存率。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS28.0 統(tǒng)計軟件。計量資料采用Kolmogorov-Smirnov進行正態(tài)性分析，符合正態(tài)分布的以-x±s表示，組間比較行t檢驗；計數(shù)資料以例（%）表示，數(shù)據(jù)比較行χ2檢驗。采用Pearson相關(guān)性分析EC 組織中LncRNA OGFRP1、LncRNA TDRG1 與PI3K mRNA、AKT mRNA 的相關(guān)性；K-M法繪制EC 組織中不同LncRNA OGFRP1、LncRNA TDRG1 表達患者的生存曲線，Log-Rank 檢驗分析EC 組織LncRNA OGFRP1、LncRNA TDRG1 表達與患者預后的關(guān)系；COX 回歸分析EC 患者預后的影響因素，取單因素COX 回歸分析結(jié)果P＜0.05 的臨床指標進一步納入多因素COX 回歸分析，總結(jié)影響EC 患者預后的獨立危險因素。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 EC 和癌旁組織LncRNA OGFRP1、TDRG1 及PI3K、AKT mRNA 表達比較 EC 及癌旁組織中LncRNA OGFRP1 表達分別為1.19 ± 0.23、0.56 ±0.13，LncRNA TDRG1 表達分別為1.35 ± 0.31、0.74 ± 0.19，PI3K mRNA 表達分別為1.24 ± 0.25、0.80 ± 0.20，AKT mRNA 表達分別為1.22 ± 0.27、0.89 ± 0.17；EC 組織中LncRNA OGFRP1、LncRNA TDRG1 及PI3K、AKT mRNA 表達均高于癌旁組織（P均＜0.05）。

2.2 EC 組織LncRNA OGFRP1、TDRG1 與PI3K、AKT mRNA 表達的相關(guān)性 Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，EC 組織中LncRNA OGFRP1 表達與PI3K、AKT mRNA 表達呈正相關(guān)（r分別為0.584、0.571，P均＜0.01），LncRNA TDRG1 表達與PI3K、AKT mRNA 表達呈正相關(guān)（r分別為0.593、0.584，P均＜0.01）。

2.3 LncRNA OGFRP1、TDRG1 高低表達EC 患者預后比較 90 例EC 患者中LncRNA OGFRP1 高表達47 例、低表達43 例，LncRNA TDRG1 高表達45 例、低表達45 例。至隨訪結(jié)束，90 例EC 患者死亡29 例，3 年總生存率為67.78%。Log-Rank 檢驗顯示，LncRNA OGFRP1 高、低表達EC 患者3 年總生存率分別為55.32%、81.40%，LncRNA OGFRP1 高表達EC 患者3 年總生存率低于LncRNA OGFRP1 低表達患者；LncRNA TDRG1高、低表達EC 患者3 年總生存率分別為53.33%、82.22%，LncRNA TDRG1 高表達EC 患者3 年總生存率低于LncRNA TDRG1 低表達患者（P均＜0.01）。見OSID 碼圖1、2。

2.4 LncRNA OGFRP1、TDRG1 表達與EC 患者預后的關(guān)系 以EC 患者生存狀態(tài)為因變量（死亡=1，存活=0），年齡（≥50 歲=1，＜50 歲=0）、組織學分型（Ⅱ型=1，Ⅰ型=0）、分化程度（低分化=1，中高分化=0）、FIGO 分期（Ⅲ期=1，Ⅰ～Ⅱ期=0）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（是=1，否=0）、LncRNA OGFRP1（≥1.19=1，＜1.19=0）、LncRNA TDRG1（≥1.35=1，＜1.35=0）為自變量納入單因素Cox 回歸分析。結(jié)果顯示，分化程度中高分化、FIGO 分期Ⅲ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、LncRNA OGFRP1≥1.19 及LncRNA TDRG1≥1.35 是影響EC 患者預后的危險因素（P均＜0.05）。多因素Cox 回歸分析顯示，F(xiàn)IGO 分期Ⅲ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、LncRNA OGFRP1≥1.19、LncRNA TDRG1≥1.35為影響EC 患者預后的獨立危險因素（P均＜0.05）。見表1。

表1 EC患者預后影響因素的COX回歸分析結(jié)果

3 討論

EC 以陰道不規(guī)則流血、排液為主要臨床表現(xiàn)，其發(fā)病可能與遺傳、性激素紊亂、代謝異常、高血壓、雌激素暴露等因素有關(guān)［1］。盡管近年來腹腔鏡手術(shù)、精準放化療、免疫治療等取得較大進展，但仍有很多患者治療效果一般，且獲得性耐藥患者隨著治療時間的延長逐漸增加［8］。因此，深入探索EC 相關(guān)標志物，分析EC患者預后不良的危險因素和分子機制對于指導臨床治療及改善患者預后具有積極的意義。

相關(guān)報道表明，表觀遺傳能夠通過影響多種基因表達參與EC 的發(fā)生發(fā)展［9］。LncRNA 可通過直接與蛋白質(zhì)相互作用、與微小RNA（miRNA）相互作用形成內(nèi)源競爭RNA、編碼蛋白質(zhì)或多肽等多種方式調(diào)控EC 進程［2］。CHEN 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)LncRNA OGFRP1 能通過抑制AKT/mTOR 及Wnt/β-catenin 信號通路抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲，提示LncRNA OGFRP1 參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程。DONG 等［11］研究顯示，抑制LncRNA OGFRP1 表達能靶向miR-423-5p/CCCTC軸結(jié)合因子抑制結(jié)直腸癌細胞的血管生成和上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化。上述研究均提示，LncRNA OGFRP1 可能是一種促癌基因。同時有研究報道，LncRNA OGFRP1 高表達還與結(jié)直腸癌［3］、肺腺癌［12］患者的預后不良有關(guān)。但是關(guān)于LncRNA OGFRP1 與EC 患者預后的關(guān)系尚未明確。本研究結(jié)果顯示，EC 組織中LncRNA OGFRP1 表達上調(diào)，且與分化程度、FIGO 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示LncRNA OGFRP1 高表達參與了EC 進程。分析其原因可能為LncRNA OGFRP1 高表達可靶向miR-124-3p 上調(diào)沉默信息調(diào)節(jié)因子1，促進EC 細胞上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進而促進EC 的惡性進展［4］。PI3K/AKT 信號通路主要受體酪氨酸激酶激活，上調(diào)PI3K 復合物活性可導致AKT 激活，AKT 可通過激活mTOR、糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）等分子，促進EC 細胞增殖、分化、遷移和侵襲等生理病理過程［13］。CHEN 等［10］研究報道，LncRNA OGFRP1 參與AKT/mTOR 信號通路調(diào)控。本研究結(jié)果顯示，EC 組織中LncRNA OGFRP1 與PI3K mRNA、AKT mRNA 表達呈正相關(guān)，提示LncRNA OGFRP1 高表達可能通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT 信號通路參與EC 進展。LV 等［4］研究也表明，LncRNA OGFRP1 高表達可導致EC 中PI3K/AKT/GSK-3β信號通路激活，進而促進EC 細胞增殖、遷移和侵襲。

多項研究表明，LncRNA TDRG1 參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程［14］。王帥奇等［15］研究報道，敲低LncRNA TDRG1 能夠靶向miR-101-3p 抑制結(jié)直腸癌細胞增殖、侵襲和遷移。LU 等［16］研究發(fā)現(xiàn)，抑制LncRNA TDRG1 表達可靶向miR-423-5p/KLF5 信號通路，抑制非小細胞肺癌細胞的生長、遷移和侵襲并加速其凋亡。上述研究提示，LncRNA TDRG1 可能也是一種促癌基因。同時，DONG 等［17］通過分析EC 細胞中的LncRNA 發(fā)現(xiàn)，LncRNA TDRG1 在EC 細胞中高表達。有學者指出，LncRNA TDRG1 高表達與非小細胞肺癌［18］、卵巢癌［19］患者的預后不良有關(guān)，而關(guān)于LncRNA TDRG1 與EC 患者預后的關(guān)系尚未明確。

本研究結(jié)果顯示，EC組織中LncRNA TDRG1表達上調(diào)，與分化程度、FIGO 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示LncRNA TDRG1 高表達參與EC 進程。分析其原因可能為LncRNA TDRG1 高表達能夠靶向上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子A，刺激新生血管生成，從而促進EC細胞增殖和侵襲［6］。本研究結(jié)果顯示，EC組織中LncRNA TDRG1 與PI3K、AKT mRNA 表達呈正相關(guān)，提示LncRNA TDRG1 高表達可能通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT 信號通路參與EC 進展。SUN 等［20］研究也發(fā)現(xiàn)，敲低LncRNA TDRG1 能通過PI3K/AKT/mTOR 信號通路抑制EC 細胞增殖、遷移、侵襲并促進其凋亡。

本研究通過隨訪發(fā)現(xiàn)，LncRNA OGFRP1、TDRG1 高表達的EC 患者的3 年總生存率低于低表達患者，提示LncRNA OGFRP1、TDRG1 表達與EC患者預后有關(guān)。進一步分析發(fā)現(xiàn)，LncRNA OGFRP1≥1.19、LncRNA TDRG1≥1.35 為影響EC 患者預后的獨立危險因素，提示LncRNA OGFRP1、TDRG1 升高會增加EC患者死亡風險，兩者有望成為輔助評估EC患者預后的潛在指標。

綜上所述，EC 組織中LncRNA OGFRP1、TDRG1表達升高，LncRNA OGFRP1、TDRG1 表達與PI3K/AKT信號通路相關(guān)分子表達存在相關(guān)性，且為EC患者預后不良的獨立危險因素。然而LncRNA OGFRP1、TDRG1表達通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路影響預后的具體分子機制尚不明確，期待后續(xù)研究進一步深入分析。