川渝部分地區(qū)育肥豬偽狂犬病的血清流行病學(xué)調(diào)查

劉傳敏

（駐馬店農(nóng)業(yè)學(xué)校，河南 駐馬店 463000）

豬偽狂犬?。≒seudorabies，PR）是由皰疹病毒科、皰疹病毒亞科中的偽狂犬病病毒（Pseudorabies Virus，PRV）引起豬的一種急性傳染病。該病主要導(dǎo)致母豬繁殖障礙和2 周齡內(nèi)仔豬大量死亡，育肥豬主要表現(xiàn)呼吸道癥狀和增重滯緩，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約了我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展。有學(xué)者對(duì)我國(guó)14 個(gè)省市89 個(gè)規(guī)模化豬場(chǎng)進(jìn)行PRV 野毒抗體調(diào)查顯示，陽(yáng)性豬場(chǎng)65 個(gè)，豬場(chǎng)陽(yáng)性率為73.03%，總樣品陽(yáng)性率為23.40%；調(diào)查中成年豬的PRV 感染率最高為27.23%，后備母豬、育肥豬、哺乳仔豬和保育仔豬的PRV 陽(yáng)性率分別是21.95%、16.85%、8.11%和7.84%。

四川、重慶歷來(lái)是我國(guó)的養(yǎng)豬大?。▍^(qū)）。2019年，四川省的生豬年出欄量在9000 萬(wàn)頭以上，年存欄量和出欄量均居全國(guó)第一；重慶市2019 年生豬年出欄量達(dá)2000 萬(wàn)頭，并且近兩年的養(yǎng)殖數(shù)量呈上升趨勢(shì)。隨著川渝地區(qū)生豬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，PR 的發(fā)生也日益頻繁。對(duì)豬偽狂犬病流行的認(rèn)識(shí)，更多集中在種豬的帶毒傳播作用方面，而往往忽略育肥豬在該病傳播中的作用。由于育肥豬的頻繁商貿(mào)運(yùn)輸、屠宰加工以及病死豬的非法肉品交易，大大增加了PRV 擴(kuò)散的廣泛性與危險(xiǎn)性，形成了PRV 的長(zhǎng)期擴(kuò)散與傳播。崔巍山等對(duì)陜西榆林市豬偽狂犬病的血清學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，母豬場(chǎng)的PRV 感染率為0%～50.0%，而商品豬場(chǎng)PRV 感染率為25.7%～42.8%。

目前，有關(guān)四川、重慶地區(qū)育肥豬偽狂犬病感染和流行情況的資料報(bào)道較為少見。本試驗(yàn)根據(jù)血清流行病學(xué)方法，選用PRV IgG 抗體ELISA 方法對(duì)四川、重慶14 個(gè)地區(qū)的養(yǎng)豬場(chǎng)和散養(yǎng)戶養(yǎng)殖的PR 非免育肥豬進(jìn)行血清學(xué)調(diào)查，以了解四川、重慶兩地育肥豬PRV 的感染和PR 的流行情況。

1 試驗(yàn)材料

1.1 采樣點(diǎn)的選取根據(jù)四川省、重慶市各地區(qū)的地理特點(diǎn)以及生豬養(yǎng)殖的情況，并結(jié)合試驗(yàn)的人力物力及財(cái)力條件，選擇養(yǎng)殖豬數(shù)量相對(duì)較多的渝西地區(qū)和四川盆地中部地區(qū)，另外選擇養(yǎng)殖量相對(duì)較少并以山地養(yǎng)殖為主的渝東地區(qū)和川西山地區(qū)域，在重慶所轄有江北、大足、北碚、榮昌、璧山、忠縣；四川所轄有內(nèi)江、綿陽(yáng)、資陽(yáng)、資中、蓬溪、廣安、遂寧以及自貢，共14 個(gè)地區(qū)作為采樣地點(diǎn)，詳情見表1、圖1、圖2。

表1 采樣調(diào)查地點(diǎn)的分組情況

圖1 四川的樣本來(lái)源地點(diǎn)

圖2 重慶的樣本來(lái)源地點(diǎn)

1.2 血樣的采集與處理血液樣品采集時(shí)間為2019 年9 月～2022 年1 月。采血前詢問(wèn)戶（場(chǎng)）畜主，選擇未注射豬偽狂犬病疫苗的豬場(chǎng)或養(yǎng)殖戶的育肥豬。用一次性注射器或真空采血管自豬耳靜脈或前腔靜脈采集血液5～10mL，血樣置3000r/min離心5min，分離血清；對(duì)沒有條件分離血清的地區(qū)，采取室溫靜置，自然析出血清，并分裝于滅菌后的Eppendorf 管中，置-20℃冷凍保存待檢。本次共采集育肥豬血樣1110 頭份，其中，四川710 頭份，重慶400 頭份。

1.3 檢測(cè)試劑豬偽狂犬病毒IgG 抗體檢測(cè)ELISA 試劑盒（生產(chǎn)批號(hào)為20190101，有效期為20220104），包括豬偽狂犬病毒抗原包被96 微孔板條、豬偽狂犬病毒抗體陽(yáng)性對(duì)照血清、豬偽狂犬病毒抗體陰性對(duì)照血清、酶標(biāo)記物、樣品稀釋液、顯色劑A、顯色劑B、終止液等。購(gòu)自北京華安麥科生物技術(shù)有限公司。

1.4 主要儀器設(shè)備

TDL-5A 型低溫離心機(jī) 上海菲恰爾公司

JL-084 型Thermo 酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo Fisher 公司

FZ-237 型EL×405TM洗板機(jī) 美國(guó)BIOTEK 公司

DHP-9272 型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器公司

BCD-177 型冰箱 河南新飛電器有限公司

Eppendorf 單道微量移液器 德國(guó)

Eppendorf 多道可調(diào)移液器（排槍） 德國(guó)

2 試驗(yàn)方法

應(yīng)用豬偽狂犬病IgG 抗體檢測(cè)ELISA 試劑盒檢測(cè)被檢血清。具體操作方法按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行：

2.1 加 樣使用前將試劑盒置室溫30 min，恢復(fù)至室溫。用樣品稀釋液將被測(cè)樣品作20 倍稀釋。然后取所需用量的包被板，設(shè)空白、陰性及陽(yáng)性對(duì)照各2 孔，分別加陰性、陽(yáng)性對(duì)照血清100 μL；樣品孔加20 倍稀釋好的血清樣品100 μL；空白對(duì)照孔不加，在記錄表上記錄樣品的位置?；靹?，置于37 ℃溫浴30 min?？廴タ變?nèi)的液體，在每孔里加滿稀釋好的洗滌液，靜置60 s 后棄去，重復(fù)洗滌5 次，拍干。

2.2 加酶標(biāo)記物除空白對(duì)照孔外，每孔均加酶標(biāo)記物100 μL。置37 ℃溫浴30 min 后，甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，靜置60 s 后棄去，重復(fù)洗滌5 次，拍干。

2.3 顯色反應(yīng)每孔依次加顯色劑A、顯色劑B 各50μL，混勻，置37 ℃避光反應(yīng)10 min，再在每孔加終止液50 μL，混勻，置酶標(biāo)儀450nm 處測(cè)各孔吸光度（OD）值。記錄被檢樣品和對(duì)照孔的OD 值數(shù)據(jù)。

3 結(jié)果判定

（1）陰性對(duì)照：正常情況下，陰性對(duì)照孔OD值≤0.1。

（2）陽(yáng)性對(duì)照：正常情況下，陽(yáng)性對(duì)照孔OD值≥0.4。

（3）臨界值（Cut Off，C.O.）的計(jì)算：臨界值=0.15＋陰性對(duì)照孔均值；所有陰性、陽(yáng)性對(duì)照和樣品孔的OD 值均須減去空白平均值后作為計(jì)算值。

（4）檢測(cè)標(biāo)本OD450 值≥臨界值，判定為本試驗(yàn)陽(yáng)性。

檢測(cè)標(biāo)本OD450 值＜臨界值，判定為本試驗(yàn)陰性。

4 試驗(yàn)結(jié)果

4.1 川渝兩地14 個(gè)市（區(qū)、縣）育肥豬PRV 的抗體陽(yáng)性率結(jié)果對(duì)四川、重慶14 個(gè)市（區(qū)、縣）的1110頭份PR 非免育肥豬血清樣品進(jìn)行PRV 的血清抗體檢測(cè)。結(jié)果顯示：共有201 份血清樣品呈PRV 抗體陽(yáng)性，抗體陽(yáng)性率在13.48%～22.39%，平均抗體陽(yáng)性率為18.11%（201/1110）。其中，四川的育肥豬PRV 抗體陽(yáng)性率在13.48%～19.81%，平均抗體陽(yáng)性率是17.61%（125/710），蓬溪縣的育肥豬PRV 抗體陽(yáng)性率最高為19.81%，陽(yáng)性率最低的是內(nèi)江為13.48%；重慶地區(qū)的育肥豬PRV 抗體陽(yáng)性率在14.71%～22.39%，平均抗體陽(yáng)性率為19.00%（76/400）， 忠 縣 的 育 肥 豬PRV 陽(yáng) 性 率 最 高（22.39%），陽(yáng)性率最低的是榮昌縣，陽(yáng)性率為14.71%（詳見表2，圖3）。

表2 四川、重慶14 個(gè)地區(qū)育肥豬PRV 的抗體陽(yáng)性率

圖3 四川、重慶兩地育肥豬PRV 抗體陽(yáng)性率的比較

4.2 川渝地區(qū)不同地理?xiàng)l件和養(yǎng)殖方式下育肥豬PRV 的抗體陽(yáng)性率本次調(diào)查對(duì)川渝地區(qū)不同地理?xiàng)l件和養(yǎng)殖方式下的育肥豬進(jìn)行了血清抗體檢測(cè)。調(diào)查顯示：丘陵地區(qū)的育肥豬PRV 陽(yáng)性率為17.74%（160/902），低于山區(qū)的育肥豬PRV 抗體陽(yáng)性率（19.71%）；散養(yǎng)的育肥豬PRV 抗體陽(yáng)性率較高于規(guī)模養(yǎng)殖的PRV 抗體陽(yáng)性率，其規(guī)模養(yǎng)殖的育肥豬PRV 陽(yáng)性率為17.11%（96/561），散養(yǎng)的豬抗體陽(yáng)性率為19.13%（詳見表3，圖4）。

表3 川渝地區(qū)不同地理?xiàng)l件及養(yǎng)殖方式下育肥豬PRV 的抗體陽(yáng)性率

圖4 地理?xiàng)l件與養(yǎng)殖方式下豬偽狂犬病毒感染抗體陽(yáng)性率的比較

5 討 論

大多數(shù)成年豬感染偽狂犬病毒后，多呈隱形潛伏感染狀態(tài)，不表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀。因此，在偽狂犬病的流行中，人們往往只重視種豬的散毒作用，而沒有注意到呈隱形感染的育肥豬在該病傳播中的重要作用，忽略了育肥豬同樣是該病毒的長(zhǎng)期帶毒者。其唾液、尿液、鼻分泌物、乳汁及精液等都可持續(xù)向外排毒，成為重要的感染源。尤其是豬肉產(chǎn)品的商貿(mào)運(yùn)輸、屠宰、加工以及銷售環(huán)節(jié)更成為PRV 帶毒豬污染的過(guò)程。Duffy S J 的研究證實(shí)了偽狂犬病病毒在育肥豬群中的循環(huán)是該病擴(kuò)散的危險(xiǎn)因素（Duffy S J 等，1991）。

陜西榆林市豬PRV 的血清學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，商品豬場(chǎng)PRV 感染率為25.7%～42.8%（崔巍山等，2019），因此，育肥豬的偽狂犬病毒感染情況應(yīng)受到足夠的重視。養(yǎng)殖戶（場(chǎng)）應(yīng)加強(qiáng)對(duì)育肥豬偽狂犬病的免疫監(jiān)測(cè)，一旦發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性豬，應(yīng)立即隔離飼養(yǎng)，避免污染其它易感豬群。同時(shí)，在商品豬的貿(mào)易運(yùn)輸過(guò)程中，嚴(yán)格實(shí)行檢疫、消毒等措施，控制偽狂犬病病毒向外擴(kuò)散。

豬偽狂犬病的流行已給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和貿(mào)易損失，制約了我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。目前，疫苗免疫接種是預(yù)防和控制PR 的根本措施，國(guó)內(nèi)外已成功研制出豬偽狂犬病的常規(guī)弱毒疫苗、滅活疫苗以及基因缺失疫苗，這些疫苗都能有效地減輕或防止該病的臨診癥狀，降低疾病的發(fā)生。廣東省的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，未免疫豬PR 疫苗的豬群感染率（52.41%）比免疫豬群的感染率（5.58%）高很多（臧瑩安等，2010）。但在該病的免疫過(guò)程中，免疫效果受許多因素的影響，如疫苗的質(zhì)量、免疫時(shí)間、免疫劑量、免疫注射部位等因素都可造成免疫失敗，并且疫苗免疫并不能阻止野毒病毒的潛伏感染。

在周緒斌的調(diào)查中，全國(guó)11 個(gè)省市免疫過(guò)豬PR 疫苗的規(guī)?；i場(chǎng)中，仍有18.2%的豬受到野毒PRV 的感染，陽(yáng)性場(chǎng)種豬的陽(yáng)性率為27.2%（周緒斌等，2019）。江西和新疆的豬PRV 血清調(diào)查顯示，江西母豬和仔豬血清的PRV 抗體陽(yáng)性率分別為63.34%和20.56%，新疆豬PRV 抗體陽(yáng)性率在16%～74%（鄧舜洲等，2008；李巖等，2006）。眾多研究表明，我國(guó)目前對(duì)豬偽狂犬病的免疫控制力度不夠，還應(yīng)大力加強(qiáng)。定期開展豬群偽狂犬病毒的血清抗體檢測(cè)，可以及時(shí)了解豬群偽狂犬病的感染情況，預(yù)測(cè)未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)，為制定防控措施提供依據(jù)。同時(shí)，也對(duì)免疫豬群的抗體水平監(jiān)測(cè)、合理免疫程序的制定以及該病的控制和凈化具有非常積極的作用。

本試驗(yàn)對(duì)四川、重慶地區(qū)的非免疫育肥豬進(jìn)行了PRV 血清流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果顯示，川渝地區(qū)的育肥豬PRV平均陽(yáng)性率為18.81%，表明在川渝兩地已存在豬PRV 的感染。程龍嬌和郭莉的研究也同樣表明四川地區(qū)存在豬偽狂犬病的感染（程龍嬌和朱玲，2010；郭莉等，2019）。在國(guó)內(nèi)其它地區(qū)，云南、貴州及青海的調(diào)查結(jié)果顯示，PRV 抗體陽(yáng)性率分別為3.78%、6.75%、8.96%，明顯低于本次試驗(yàn)對(duì)川渝兩地的調(diào)查結(jié)果（李喬金，2016；戴雪等，2012；王曉玲和張國(guó)華，2006）。而在廣東和黑龍江地區(qū)，其豬群的PRV 陽(yáng)性率明顯高于本次的調(diào)查結(jié)果（白挨泉等，2015；高睿等，2017）?？赡苁怯捎诖ㄓ宓貐^(qū)的豬群飼養(yǎng)密度大，豬調(diào)運(yùn)頻繁，特別是育肥豬的商品貿(mào)易調(diào)運(yùn)，大大加快了病原的傳播，提高了偽狂犬病毒的傳播機(jī)率。而云南、貴州及青海屬高原地區(qū)，豬飼養(yǎng)量少，豬的流通相對(duì)較少，接觸傳染源的機(jī)會(huì)小。

我國(guó)是養(yǎng)豬大國(guó)，養(yǎng)豬的數(shù)量居世界第一，與發(fā)達(dá)國(guó)家相比，除了有大型集約化養(yǎng)豬場(chǎng)和中小型規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)外，還有眾多農(nóng)戶散養(yǎng)的養(yǎng)殖群體。一些學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)不同的飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下，豬PRV的抗體陽(yáng)性率存在明顯的差異。

對(duì)江西、安徽的豬PRV 血清調(diào)查結(jié)果顯示，養(yǎng)殖規(guī)模較大的養(yǎng)殖場(chǎng)的PRV 抗體陽(yáng)性率低于散養(yǎng)戶的（鄧舜洲等，2008；涂健等，2008），之外在豫南地區(qū)，散養(yǎng)戶的豬PRV 陽(yáng)性率（37.25%）明顯高于中小規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)（21.74%）（張敏，2009），這與本次我們?cè)谒拇?、重慶進(jìn)行的調(diào)查結(jié)果基本一致。但也有不同的報(bào)道，在貴州、廣西地區(qū)規(guī)模化豬場(chǎng)PRV 抗體陽(yáng)性率高于散養(yǎng)戶的豬陽(yáng)性率（戴雪等，2010；覃慶玉等，2009）。表明在不同的地方調(diào)查結(jié)果不一致，其養(yǎng)殖方式和地方養(yǎng)殖水平存在差異。因此，養(yǎng)殖戶（場(chǎng)）應(yīng)加強(qiáng)豬群的飼養(yǎng)管理，提高豬舍的衛(wèi)生環(huán)境，對(duì)引種豬進(jìn)行抗體檢測(cè)，同時(shí)注重豬群的免疫預(yù)防工作，定期開展豬群的免疫抗體監(jiān)測(cè)。