貝萊斯芽胞桿菌YL2021高產(chǎn)嗜鐵素的搖瓶發(fā)酵工藝優(yōu)化

沈佳慧，喬俊卿，左 楊，劉永鋒，劉郵洲*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，南京 210095；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，南京 210014）

嗜鐵素是生物體在長期進化過程中應對低鐵環(huán)境條件下獲取鐵元素所分泌的一種小分子量的螯合因子，與Fe3+的結合能力非常強（生成常數(shù)可達1023～1052），且具有特異性[1]。目前，國內外報道的嗜鐵素種類已超過500 種[2]。按照對 Fe3+的螯合基團不同，嗜鐵素可分為4 類：兒茶酚型（catecholate）嗜鐵素、異羥肟酸型（hydroxamate）嗜鐵素、羧酸鹽型（carboxylate）嗜鐵素及混合型嗜鐵素[3]。

多數(shù)芽胞桿菌，如炭疽芽胞桿菌Bacillusanthracis、蘇云金芽胞桿菌B.thuringiensis、蠟質芽胞桿菌B.cereus、解淀粉芽胞桿菌B.amyloliquefaciens等[4-6]，能分泌兒茶酚型嗜鐵素bacillibactin。Bacillibactin最早是從枯草芽胞桿菌B.subtilis發(fā)酵培養(yǎng)液中分離獲得的[7]，由3 個組合單元[甘氨酸+蘇氨酸+二羥基苯甲酸（dihydroxybenzoate，DHB）]環(huán)化形成。此外，部分芽胞桿菌還可以分泌產(chǎn)生羧酸型嗜鐵素pertrobactin[5,6]。貝萊斯芽胞桿菌B.velezensisYL2021 是一株對多種病原菌均有良好防治效果的生防菌，其基因組中含有完整的兒茶酚型嗜鐵素合成基因簇。前期試驗結果表明，菌株YL2021 缺鐵條件下能產(chǎn)生具有抑菌作用的兒茶酚型嗜鐵素[8]。

目前，響應曲面法（response surface methodology，RSM）廣泛應用于微生物發(fā)酵工藝優(yōu)化，是一種可以在多因子系統(tǒng)中擬合因子和響應值之間全局函數(shù)關系的數(shù)學統(tǒng)計方法[9]。為了提高貝萊斯芽胞桿菌YL2021 嗜鐵素的產(chǎn)量，本研究首先通過比較8 種常見的發(fā)酵培養(yǎng)基對菌株YL2021 產(chǎn)生嗜鐵素的影響，篩選出菌株YL2021 產(chǎn)嗜鐵素的最佳基礎培養(yǎng)基，隨后采用Plackett-Burman（PB）試驗、中心組合試驗（central composite design，CCD）和響應曲面法（RSM），對影響菌株YL2021 高產(chǎn)嗜鐵素的培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，以期獲得更高的嗜鐵素產(chǎn)量，為嗜鐵素的高效發(fā)酵和產(chǎn)業(yè)化應用提供理論依據(jù)和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株 拮抗細菌-貝萊斯芽胞桿菌 YL2021 由本實驗室保存并提供。供試細菌-水稻白葉枯病菌Xanthomonasoryzaepv.oryzaePXO99 和歐文氏菌Erwiniaamylovora2029 由本實驗室保存并提供；供試真菌-稻瘟病菌MagnaporthegriseaGuy11 由南京農(nóng)業(yè)大學惠贈，水稻紋枯病菌RhizoctoniasolaniRH-2 由本實驗室保存并提供。

1.1.2 培養(yǎng)基及營養(yǎng)液 拮抗細菌的8 種培養(yǎng)基為 ① Luria-Bertani (LB) 培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.00 g、酵母提取物5.00 g、NaCl 10.00 g、水1000 mL；② 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(Nutrient Broth, NB)：牛肉膏3.00g、蛋白胨 10.00 g、NaC1 5.00 g、水1000 mL，pH 值7.0；③ 1/2 胰蛋白胨大豆肉湯液體培養(yǎng)基(Trypticase Soy Broth,TSB)：胰酪大豆胨培養(yǎng)基粉15.00 g、水1000 mL；④ 丁二酸培養(yǎng)基(Succinic acid medium, (SM))[10]：KH2PO43.00 g、K2HPO46.00 g、MgSO4·7H2O 0.10 g、(NH4)2SO41.00 g、丁二酸4.00 g、水1000 mL，pH 值7.0；⑤ 丁二酸鈉(NaSM)培養(yǎng)基[10]：KH2PO43.00 g、K2HPO46.00 g、MgSO4·7H2O 0.10 g、(NH4)2SO41.00 g、丁二酸鈉 4.00 g、水1000 mL；⑥ M9 基礎培養(yǎng)基(M9 Minimal Medium)[11]：配置10×M9 鹽溶液：Na2HPO460.00 g、KH2PO430.00 g、NaCl 5.00 g、NH4Cl 10.00 g，水1000 mL，pH 7.4，滅菌備用。1 mol/L MgSO4溶液：MgSO4·7H2O 2.46 g，水10 mL，滅菌備用。1 mol/L CaCl2溶液：CaCl21.11 g，水10 mL，滅菌備用。40%葡萄糖溶液：葡萄糖 8.00 g，蒸餾水20 mL，0.22 微米濾器過濾除菌。無菌操作配制M9 培養(yǎng)基：10×M9鹽溶液100 mL、1 mol/L MgSO4溶液 2 mL、1 mol/L CaCl2溶液0.1 mL、40%葡萄糖溶液5 ml、加水至1000 mL；⑦ MSA 培養(yǎng)基[12]：蔗糖 20.00 g、天冬氨酸 2.00 g、K2HPO41.00 g、MgSO4·7H2O 0.50 g、水1000 mL；⑧ MKB 培養(yǎng)基[13]：酪蛋白氨基酸 5.00 g、K2HPO42.50 g、MgSO4·7H2O 2.50 g、甘油15.00 mL、水1000 mL。

1.1.3 拮抗細菌種子液的制備 挑取拮抗細菌YL2021 的新鮮菌苔接種于100 mL LB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min 搖培至OD600值1.0 時，10000 r/min 離心10 min 后，菌泥用無菌水稀釋至菌含量108CFU/mL，得到拮抗菌種子液，備用。

1.2 兒茶酚型嗜鐵素產(chǎn)量的測定

參考文獻[14]，不同濃度梯度的2,3-DHB 標準品（分析純，上海生工生物有限公司）發(fā)生Arnow 反應：吸取液體1 mL，依次加入1 mL 0.5 mol/L HCl，1 mL 鉬酸鹽溶液和1 mL 1 mol/L 的NaOH，溶液顏色變紅，并保持15 min 不變色，用分光光度計檢測反應液在510 nm 處的光度值，繪制標準曲線，獲得回歸方程。試驗重復3 次。將1.1.3 種子液以1:100 比例轉接至100 mL 培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min 搖培48 h。取2 mL發(fā)酵液10000 r/min 離心10 min，吸取1 mL 上清液發(fā)生Arnow 反應，檢測OD510值。根據(jù)2,3-DHB 標準品的線性回歸方程，計算發(fā)酵液中嗜鐵素產(chǎn)量。

1.3 菌株YL2021 高產(chǎn)嗜鐵素發(fā)酵培養(yǎng)基及其配方的優(yōu)化篩選試驗

1.3.1 基礎培養(yǎng)基的篩選 將1.1.3 種子液以1:100 比例轉接8 種培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min 搖瓶培養(yǎng)48 h后，取2 mL 菌液10000 r/min 離心10 min，吸取1 mL 上清液，檢測其中嗜鐵素含量，篩選最佳的基礎培養(yǎng)基。試驗重復3 次。

1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)基單因素篩選試驗 保持基礎培養(yǎng)基中其他組分不變，開展用蔗糖、甘油、檸檬酸鈉、水溶性淀粉和麥芽糖替換基礎培養(yǎng)基中的碳源；用蛋白胨、(NH4)2SO4、酵母膏、尿素和黃豆餅粉替換基礎培養(yǎng)基中的氮源；在基礎培養(yǎng)基中分別添加甘氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸鈉；逐一去除基礎培養(yǎng)基中金屬鹽離子等單因素篩選試驗。種子液以1:100 比例轉接不同培養(yǎng)基中，28 ℃，150 r/min 搖培48 h 后，取2 mL 菌液10000 r/min 離心10 min，吸取1 mL 上清液，檢測其中嗜鐵素含量，篩選菌株YL2021 產(chǎn)生嗜鐵素的最佳碳源、氮源、氨基酸和金屬鹽離子。試驗重復2 次。

1.3.3 培養(yǎng)基成分關鍵因子PB 試驗與最陡爬坡試驗 根據(jù)1.2.2 部分單因素篩選試驗結果，采用Design Expert 8.0 軟件設計PB 試驗，從以下6 個因素中篩選影響嗜鐵素產(chǎn)量的關鍵因子，試驗中每因素取“1”（高水平，范圍區(qū)間最大值）和“-1”（低水平，范圍區(qū)間最小值）兩水平，即葡萄糖2.50 和17.50 g/L（A），NH4Cl 0.50 和3.50 g/L（B），谷氨酸鈉1.00 和11.00 g/L（C），KH2PO40.50 和7.50 g/L（D），MgSO40.50 和3.00 g/L（E），CaCl20.01 和0.14 g/L（F）。試驗重復 3 次。

根據(jù)PB 試驗結果，綜合選出3 個對嗜鐵素產(chǎn)量有顯著影響的培養(yǎng)基關鍵因子：葡萄糖（A）、NH4Cl（B）和KH2PO4（D）。采用最陡爬坡試驗對3 個關鍵因素的用量范圍進行摸索，確定合適的步長，為后續(xù)的中心組合試驗提供依據(jù)。試驗重復3 次。

1.3.4 培養(yǎng)基成分關鍵因子中心組合試驗（CCD）設計 根據(jù)PB 試驗和最陡爬坡試驗結果，利用中心組合試驗對葡萄糖、NH4Cl 和KH2PO4進行3 因素5 水平試驗，依據(jù)其設計原理，分別按照軸向點α值為1.682，角點值為1，設計5 水平試驗（表 1），共設20 組。試驗重復3 次。對培養(yǎng)基成分關鍵因子進行響應曲面分析，獲得培養(yǎng)基成分關鍵因子的最優(yōu)組合。

1.4 菌株YL2021 高產(chǎn)嗜鐵素培養(yǎng)條件的優(yōu)化篩選試驗

1.4.1 培養(yǎng)條件關鍵因子PB 試驗與最陡爬坡試驗 以優(yōu)化后的培養(yǎng)基為研究對象，采用Design Expert 8.0軟件設計PB 試驗，從溫度、pH、轉速、接種量、裝液量以及培養(yǎng)時間6 個因素中篩選影響嗜鐵素產(chǎn)量的培養(yǎng)條件關鍵因子，試驗中每因素取“1”（高水平，范圍區(qū)間最大值）和“-1”（低水平，范圍區(qū)間最小值）兩水平，即pH 值6.0 和8.0（A），溫度25 ℃和33 ℃（B），轉速150 和220 r/min（C），裝液量25 和125 mL（250 mL 三角瓶中）（D），接種量0.5%和3.0%（E），培養(yǎng)時間24 和 48 h（F）。試驗重復3 次。

根據(jù)PB 試驗結果，綜合選出3 個對嗜鐵素產(chǎn)量有顯著影響的培養(yǎng)條件關鍵因子：pH 值（A）、接種量（E）和培養(yǎng)時間（F）。采用最陡爬坡試驗對3 個關鍵因素的范圍進行摸索，確定合適的步長，為后續(xù)的中心組合試驗提供依據(jù)。試驗重復3 次。

1.4.2 培養(yǎng)條件關鍵因子中心組合（CCD）試驗 根據(jù)PB 試驗和最陡爬坡試驗結果，利用中心組合試驗對pH 值、接種量和培養(yǎng)時間進行3 因素5 水平試驗，依據(jù)其設計原理，分別按照軸向點α值為1.682，角點值為1，設計5 水平試驗（表2），共設20 組。試驗重復3 次。對培養(yǎng)條件關鍵因子進行響應曲面分析，獲得培養(yǎng)條件關鍵因子的最優(yōu)組合。

1.5 搖瓶發(fā)酵驗證試驗

根據(jù)響應曲面優(yōu)化結果，將種子液轉接至優(yōu)化培養(yǎng)基中，按優(yōu)化后的培養(yǎng)條件進行振蕩搖培。取2 mL菌液10000 r/min 離心10 min，吸取1 mL 上清液，檢測OD510值，計算嗜鐵素產(chǎn)量。

1.6 嗜鐵素的室內抑菌試驗

優(yōu)化后菌株YL2021 發(fā)酵液中嗜鐵素的提取見參考文獻[8]，獲得嗜鐵素粗提液。

稻瘟病菌Guy11 和水稻紋枯病菌RH-2 在PDA 平板28 ℃培養(yǎng)2～7 d 后，沿菌落邊緣用直徑5 mm 打孔器打孔，將菌塊置于PDA 平板中央。培養(yǎng)皿四周呈“十”字形（距培養(yǎng)皿中心 30 mm）打孔，孔徑為5 mm?？變确謩e滴加清水對照10 μL、空白培養(yǎng)基對照10 μL、嗜鐵素粗提液5 和10 μL 共計4 個處理。每處理重復3 皿。28 ℃恒溫培養(yǎng)，待清水對照處理病原菌菌落長滿平板時測量各處理菌落生長情況。

歐文氏菌2029 和水稻白葉枯病菌PXO99 用LB 培養(yǎng)液28 ℃、150 r/mim 振蕩培養(yǎng)48 h，用無菌水稀釋至2.0×108cfu/mL，備用。分別吸取清水對照 10 μL、空白培養(yǎng)基對照10 μL、嗜鐵素粗提液5 和10 μL，點接在M9 平板中央，吹干。供試細菌-歐文氏菌和水稻白葉枯病菌稀釋液均勻噴霧平板1 秒，約100 μL，28 ℃培養(yǎng)過夜，測定抑菌圈直徑。每處理重復3 次，取平均值。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

上述PB 試驗、CCD 試驗及響應面分析均利用Design Expert 8.0 軟件進行設計和分析。用Excel 2010和DPS 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)7.05 軟件進行統(tǒng)計分析，采用鄧肯氏新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 2,3-DHB 標準曲線的建立

試驗結果表明，2,3-DHB標準曲線的線性方程為y=0.0014x+0.0802，R2=0.9817；2,3-DHB濃度100～700 μmol/L與其Arnow 反應后的OD510值呈良好的線性關系（圖1）。因此，菌株YL2021 發(fā)酵上清液Arnow 反應后測定OD510值，依據(jù)上述方程可以計算出發(fā)酵液中兒茶酚型嗜鐵素產(chǎn)量。

圖1 建立2,3-DHB 標準曲線Fig.1 The standard cruve of the 2,3-DHB

2.2 確定發(fā)酵基礎培養(yǎng)基

8 種候選培養(yǎng)基中，菌株YL2021 在M9 液體培養(yǎng)基中OD510數(shù)值最高，達到0.141，表明該培養(yǎng)條件下嗜鐵素產(chǎn)量較高；其次是MSA 培養(yǎng)基，OD510為0.135；以每升培養(yǎng)基的成本進行核算，M9 培養(yǎng)基成本約1.32 元，而MSA 培養(yǎng)基成本約4.06 元。菌株YL2021 在LB、NB、1/2 TSB、SM、NaSM 和MKB液體培養(yǎng)基中OD510數(shù)值較低，表明其產(chǎn)生的兒茶酚型嗜鐵素較少。因此，基于嗜鐵素產(chǎn)量和經(jīng)濟成本綜合考慮，選擇M9 培養(yǎng)基作為菌株YL2021 產(chǎn)生嗜鐵素的基礎培養(yǎng)基（圖2）。

圖2 貝萊斯芽胞桿菌YL2021 高產(chǎn)嗜鐵素的基礎培養(yǎng)基篩選Fig.2 Screening of basal culture medium for siderophore production of B.velezensis YL2021

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基成分優(yōu)化篩選試驗

菌株YL2021 在添加甘油為碳源的M9 液體培養(yǎng)基中嗜鐵素產(chǎn)量最高，OD510值為0.280；其次為M9培養(yǎng)基中碳源-葡萄糖，OD510值為0.203。基于經(jīng)濟成本考慮，繼續(xù)選擇葡萄糖為碳源進一步優(yōu)化。菌株YL2021 在添加尿素為氮源的M9 液體培養(yǎng)基中嗜鐵素產(chǎn)量最高，OD510值為0.247；其次為M9 培養(yǎng)基中氮源-NH4Cl，OD510值為0.203。基于經(jīng)濟成本考慮，繼續(xù)選擇以M9 培養(yǎng)基中的NH4Cl 作為氮源進一步優(yōu)化。M9 液體培養(yǎng)基中添加谷氨酰胺和蘇氨酸時，菌株YL2021 產(chǎn)生的嗜鐵素較多，OD510值均為0.232；其次為谷氨酸鈉，OD510值為0.218?；诮?jīng)濟成本考慮，選擇谷氨酸鈉進行下一步優(yōu)化。M9 液體培養(yǎng)基中金屬離子KH2PO4、MgSO4和CaCl2不能去除，否則會直接影響菌株YL2021 嗜鐵素產(chǎn)量；而M9 液體培養(yǎng)基中去除NaCl，菌株YL2021 嗜鐵素產(chǎn)量基本不影響，OD510值為0.201，與去除前無差異。有趣的是，M9 液體培養(yǎng)基中去除Na2HPO4有利于菌株YL2021 產(chǎn)生嗜鐵素，OD510值可達0.502，嗜鐵素產(chǎn)量明顯增加（圖3）。因此，在M9 液體培養(yǎng)基的基礎上去除Na2HPO4和NaCl 進行下一步的優(yōu)化。

圖3 貝萊斯芽胞桿菌YL2021 高產(chǎn)嗜鐵素的培養(yǎng)基成分單因素篩選Fig.3 Single-factor screening of culture medium components for siderophore production of B.velezensis YL2021

2.4 培養(yǎng)基成分關鍵因子PB 試驗與最陡爬坡試驗

基于單因素試驗結果，選取6 個培養(yǎng)基組分開展PB 試驗，共設計12 組培養(yǎng)基，發(fā)酵液OD510值見表3。將試驗結果利用Design Expert 8.0 軟件進行回歸分析和方差統(tǒng)計分析，所得各因子的回歸方程為：Y=0.38+0.010A－0.076B+0.011C+0.11D+0.007E+0.011F，校正系數(shù)R2=0.8714，式中Y代表OD510預測值。方差分析結果表明（表4）：回歸模型P值為0.0386，在0.05 水平上顯著，葡萄糖（A）、NH4Cl（B）和KH2PO4（D）三個因子的變化顯著影響菌株YL2021 嗜鐵素產(chǎn)量（P＜0.05），其中KH2PO4（D）的影響最為顯著，P值為0.0120。因此，選擇葡萄糖、NH4Cl、KH2PO4三個因子作為培養(yǎng)基成分中影響菌株YL2021嗜鐵素產(chǎn)量的關鍵因子。

最陡爬坡試驗設計與結果見表5。當葡萄糖、NH4Cl 和KH2PO4的用量分別為19.00、2.00 和6.50 g/L時，發(fā)酵液OD510值達到最高值0.769，即菌株YL2021 嗜鐵素產(chǎn)量達到最大，表明該組合的變量水平已接近最佳用量，可作為中心組合試驗的中心值進行試驗。

2.5 培養(yǎng)基成分關鍵因子的中心組合實驗及響應面分析

在PB 試驗和最陡爬坡試驗的基礎上，設計中心組合試驗以確定各因素最佳用量，試驗設計及結果見表6。采用Design Expert 8.0 軟件對試驗結果進行回歸分析，獲得回歸方程為：Y=0.78+0.011A+0.033B+0.036C－0.023AB－0.009AC－0.051BC－0.041A2－0.038B2－0.027C2，校正系數(shù)R2=0.9380，式中Y是OD510預測值，A、B 和C 分別是葡萄糖、NH4Cl 以及K2HPO4。方差分析結果見表7，模型的P值＜0.0001，表明該模型正確可靠，菌株YL2021 發(fā)酵液OD510實際測定值與方程預測值存在顯著相關性。該模型變異系數(shù)CV 為2.69 %(＜10 % )，屬于弱變異，進一步表明試驗數(shù)據(jù)的可靠性。響應面分析可知，回歸模型可以確定3 個因素的最佳中心點，即3 個變量的最優(yōu)值：葡萄糖19.43 g/L、NH4Cl 1.93 g/L 以及KH2PO49.02 g/L時，OD510預測值為0.794，菌株YL2021 嗜鐵素產(chǎn)量為509.86 μmol/mL。

響應面分析結果見圖4。葡萄糖和NH4Cl 兩因素交互作用的P值為0.0060，在0.05 水平上交互作用顯著，葡萄糖和KH2PO4兩因素交互作用的P值為0.2050，在0.05 水平上交互作用不顯著，NH4Cl 和KH2PO4兩因素交互作用的P值＜0.0001，在0.05 水平上交互作用顯著。

圖4 葡萄糖和NH4Cl（A）、葡萄糖和KH2PO4（B）、NH4Cl 和KH2PO4（C）的響應曲面分析Fig.4 Response surface curves showing the interface of glucose, NH4Cl and KH2PO4

2.6 培養(yǎng)條件關鍵因子PB 試驗與最陡爬坡試驗

基于優(yōu)化后的培養(yǎng)基，采用PB 試驗從溫度、pH、接種量、裝液量、培養(yǎng)時間、轉速6 個因素中篩選對菌株YL2021 嗜鐵素產(chǎn)量具有顯著影響的培養(yǎng)條件關鍵因子。試驗設計及結果見表8。將試驗結果利用Design Expert 8.0 軟件進行回歸分析和方差統(tǒng)計分析，獲得回歸方程為：Y=0.82+0.14A－0.052B+0.086C－0.023D+0.19E+0.12F，校正系數(shù)R2=0.9346，式中Y為OD510值。由校正系數(shù)可知Y的變化中 93.46%能被回歸方程解釋。方差分析結果表明（表9）：回歸模型P值為0.0078，在0.05 水平上顯著，pH 值（A）、接種量（E）和培養(yǎng)時間（F）三個因子的變化顯著影響菌株YL2021 嗜鐵素產(chǎn)量（P＜0.05）。因此，在后續(xù)的中心組合試驗中將pH 值、接種量和培養(yǎng)時間作為研究對象進行進一步優(yōu)化。

最陡爬坡試驗設計與結果見表10。當pH 值為7.5、接種量為2.0%和培養(yǎng)時間30 h 時，發(fā)酵液OD510值達到最高值1.063，表明該組合的變量水平已接近最佳用量，可作為中心組合試驗的中心值進行試驗。

表1 培養(yǎng)基成分關鍵因子中心組合實驗各因素水平Table 1 Central composite experimental design of key media composition

表2 培養(yǎng)條件關鍵因子中心組合實驗各因素水平Table 2 Central composite experimental design of key culture condition

表3 培養(yǎng)基成分關鍵因子Plackett-Burman 試驗設計及結果Table 3 Experimental design and response of Plackett-Burman design of media compositions

表4 培養(yǎng)基成分關鍵因子Plackett-Burman 試驗方差分析Table 4 Analysis of variance for Plackett-Burman design of media compositions

表5 培養(yǎng)基成分關鍵因子最陡爬坡試驗設計及結果Table 5 The design and results of the steepest climbing path experiments for key component of medium

表6 培養(yǎng)基成分關鍵因子中心組合試驗及結果Table 6 The design and results of central composite experiments for key component of medium

表7 培養(yǎng)基關鍵因子中心組合試驗回歸方程的方差分析Table 7 The variance analysis of regression equation from central composite experiments of key component of medium

表8 培養(yǎng)條件關鍵因子Plackett-Burman 試驗設計及結果Table 8 Experimental design and response of Plackett-Burman design of culture conditions

表9 培養(yǎng)條件關鍵因子Plackett-Burman 試驗方差分析Table 9 Analysis of variance for Plackett-Burman design of culture conditions

表10 培養(yǎng)條件關鍵因子最陡爬坡試驗設計及結果Table 10 The design and results of the steepest climbing path for culture condition

2.7 培養(yǎng)條件關鍵因子中心組合試驗及響應曲面分析

中心組合試驗和結果見表11。采用Design Expert 8.0 軟件對試驗結果進行回歸分析，獲得主回歸方程為：Y=0.95－0.045A+0.170B+0.078C+0.0036AB－0.014AC－0.074BC－0.1A2－0.047B2－0.084C2，校正系數(shù)R2=0.9375，式中Y為OD510預測值，A、B 和C 分別是pH 值、接種量和培養(yǎng)時間。方差分析結果見表12，模型的P值＜0.0001，表明該模型正確可靠，菌株YL2021 發(fā)酵液OD510實際測定值與方程預測值存在顯著相關性。由響應面分析可知，回歸模型可以確定3 個因素的最佳中心點，即3 個變量的最優(yōu)值，分別為pH 值7.0、接種量5%以及培養(yǎng)時間36.5 h，OD510預測值為1.079，此時菌株YL2021 的嗜鐵素產(chǎn)量最高，為713.43 μmol/mL。

表11 培養(yǎng)條件關鍵因子中心組合試驗及結果Table 11 The design and results of central composite experiments for culture condition

表12 培養(yǎng)條件關鍵因子中心組合試驗回歸方程的方差分析Table 12 The variance analysis of regression equation from central composite experiments of key culture condition

響應面分析結果見圖5。接種量和培養(yǎng)時間兩因素交互作用的P值為0.0024，在0.05 水平上交互作用顯著，pH 值和接種量兩因素交互作用的P值為0.8495，在0.05 水平上交互作用不顯著，pH 值和培養(yǎng)時間兩因素交互作用的P值為0.4776，在0.05 水平上交互作用亦不顯著。

圖5 pH 值和接種量（A）、pH 值和培養(yǎng)時間（B）、接種量和培養(yǎng)時間（C）的響應曲面分析Fig.5 Response surface curves showing the interface of pH value, inoculating volume and culture time

2.8 搖瓶發(fā)酵驗證

以初始發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件作對照，對優(yōu)化后的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進行搖瓶驗證。結果表明：無論是優(yōu)化前還是優(yōu)化后，菌株YL2021 發(fā)酵液OD510實測值與模型預測值在0.05 水平上均無顯著差異，驗證了該模型具有較高的擬合性。培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件優(yōu)化前，菌株YL2021 發(fā)酵液OD510實測值為0.141±0.018，對應的兒茶酚型嗜鐵素產(chǎn)量為64.81 μmol/L；優(yōu)化后，菌株YL2021 發(fā)酵液OD510實測值為1.109±0.023，對應的嗜鐵素產(chǎn)量為734.86 μmol/L，嗜鐵素產(chǎn)量提高了10.34 倍，優(yōu)化效果良好。

2.9 嗜鐵素粗提物的室內抑菌作用

嗜鐵素粗提物對稻瘟病菌和水稻紋枯病菌的平板對峙生長抑制試驗結果見圖6。清水和空白培養(yǎng)基均無抑制作用，而菌株YL2021 嗜鐵素粗提液對稻瘟病菌和水稻紋枯病菌生長均具有抑制作用，當清水對照處理的稻瘟病菌菌絲幾乎長滿平板時，嗜鐵素粗提液5 和10 μL 處理的病原菌生長半徑分別為17.4 和13.1 mm；當清水對照處理的水稻紋枯病菌菌絲幾乎長滿平板時，嗜鐵素粗提液5 和10 μL 處理的病原菌生長半徑分別為19.5 和15.1 mm。隨著嗜鐵素粗提液劑量的增加，抑菌作用明顯增強。

圖6 嗜鐵素粗提液對稻瘟病菌和水稻紋枯病菌的室內抑菌能力檢測Fig.6 Effect of siderophore produced by strain YL2021 on M.grisea and R.solani

清水和空白培養(yǎng)基對歐文氏菌、水稻白葉枯病菌均無抑制作用，不能形成抑菌圈（圖7）。嗜鐵素粗提液5 和10 μL 處理對兩種供試細菌均具有較好的室內抑制作用，并且隨著劑量的增加，抑菌圈直徑增大。嗜鐵素粗提液5 μL 處理對水稻白葉枯病菌和歐文氏菌的抑菌圈直徑分別為26.1 和15.3 mm，嗜鐵素粗提液10 μL 處理對水稻白葉枯病菌和歐文氏菌的抑菌圈直徑分別為30.5 和34.3 mm（圖8）。

圖7 嗜鐵素粗提液對水稻白葉枯病菌和歐文氏菌的室內抑菌能力檢測Fig.7 Effect of siderophore produced by strain YL2021 on X.oryzae pv.oryzae and E.amylovora

3 討論

自20 世紀六十年代起，隨著生物防治相關研究的深入，生物農(nóng)藥在世界范圍內被廣泛研究應用[15]。發(fā)酵工藝優(yōu)化是微生物產(chǎn)品化的重要環(huán)節(jié)，由于微生物培養(yǎng)發(fā)酵的影響因素復雜繁多，因此基于不同理論系統(tǒng)形成了多種試驗方法，其中研究應用較多的有：單因素試驗法、正交設計試驗法、響應曲面法等[16]。目前，國內研究報道的嗜鐵素發(fā)酵工藝優(yōu)化大多通過單因素設計試驗進行，如梁建根等[17]通過單因素試驗優(yōu)化惡臭假單胞菌PseudomondsputidaHZ-2 產(chǎn)嗜鐵素的發(fā)酵條件，嗜鐵素相對含量提高約10%；伊艷杰等[18]通過單因素試驗優(yōu)化熒光假單胞菌P.fluorescensRB5 產(chǎn)嗜鐵素的發(fā)酵條件，優(yōu)化后 RB5 發(fā)酵液中OD400值為2.35，嗜鐵素產(chǎn)量較優(yōu)化前提高了3 倍左右；余賢美等[19]通過單因素試驗研究不同培養(yǎng)條件對枯草芽胞桿菌B.subtilisBS-15 嗜鐵素產(chǎn)量的影響，結果表明：外源氨基酸的添加（如色氨酸）可以顯著提高枯草芽胞桿菌BS-15 嗜鐵素產(chǎn)量，發(fā)酵液OD510值可以達到0.387。本文在前人研究的基礎上，除了在培養(yǎng)基中添加外源氨基酸外，采用響應曲面法優(yōu)化貝萊斯芽胞桿菌YL2021 高產(chǎn)嗜鐵素的發(fā)酵工藝，構建的回歸模型具有較高的擬合性，菌株YL2021 發(fā)酵液OD510實測值與模型預測值在0.05 水平上無顯著差異。優(yōu)化后，菌株YL2021 發(fā)酵液OD510實測值為1.109，嗜鐵素產(chǎn)量提高了10.34 倍，優(yōu)化效果非常明顯。

有研究表明，嗜鐵素的合成大都受到轉錄因子-鐵攝取調節(jié)蛋白Fur（ferric uptake regulator）的調控[20]，holo-Fur 負調控嗜鐵素的合成，即當細菌體內鐵離子充足時，F(xiàn)ur 蛋白通過感應胞內的Fe2+濃度，并與Fe2+結合形成holo-Fur 復合物，該復合物可以識別靶標基因啟動子區(qū)的特殊序列（FUR box），阻止RNA 聚合酶與DNA 結合，從而抑制靶標基因的轉錄[21]。當細菌體內鐵離子匱乏時，F(xiàn)e2+從holo-Fur 復合物解離，靶標基因可以正常轉錄[22]。因此，可以運用生物信息學分析和遺傳改良的方法，解除Fur 蛋白阻遏作用，以進一步提高菌株YL2021 中嗜鐵素的產(chǎn)量。

近年來，生物農(nóng)藥具有可持續(xù)發(fā)展、保護農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境、保障食品安全等優(yōu)勢發(fā)展較快[23]，其中應用廣泛的有蘇云金芽胞桿菌[24]、枯草芽胞桿菌[25]及木霉[26]等，但生物農(nóng)藥在全球農(nóng)藥市場份額占比仍然很低[27]，主要原因包括：產(chǎn)品貨架期短、防治效果見效慢、應用技術要求高等[28]。其中，影響產(chǎn)品貨架期的因素包括：產(chǎn)品自身特性、產(chǎn)品制劑類型、產(chǎn)品環(huán)境條件要求等[29]。前期工作結果表明，在缺鐵條件下，貝萊斯芽胞桿菌YL2021 產(chǎn)生的嗜鐵素是其重要的生防因子。本文研究結果進一步發(fā)現(xiàn)，菌株YL2021產(chǎn)生的嗜鐵素對病原真菌和病原細菌的生長抑制作用隨著嗜鐵素劑量增加而增強。但是在田間應用時，嗜鐵素對環(huán)境條件的要求（紫外光、溫度等）、持效期及其對植株和土壤中土著微生物的影響等還有待深入研究。