5個(gè)不同品系迷迭香精油對(duì)金線蓮尖孢鐮刀菌的抑菌活性及GC-MS成分分析

李珊珊，鄒 暉，楊 敏，林江波，戴藝民，吳維堅(jiān)

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所，漳州 363005）

金線蓮Anoectochilusroxburghii（Wall.） Lindl.[1]學(xué)名金線蘭，又稱花葉開唇蘭，蘭科開唇蘭屬A.Blume植物；產(chǎn)于浙江、江西、福建、等省，日本、泰國、老撾、越南等多個(gè)國家也有分布，本變種全草民間可作藥用[2]。作為閩臺(tái)特色中草藥，金線蓮的民間臨床應(yīng)用廣泛，素有“藥王”“神藥”“鳥人參”之稱[3]。其味甘，性平[4]、涼；歸肺、肝、腎、膀胱經(jīng)；有清熱涼血、除濕解毒的功效，主肺熱咳血、肺結(jié)核咯血、尿血、小兒驚風(fēng)、破傷風(fēng)、腎炎水腫、風(fēng)濕痹痛和跌打損傷[5]。因過度開采，加之自然競(jìng)爭(zhēng)力差，造成野生金線蓮資源稀缺，《國家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄》（第二批）已將野生金線蓮列為二級(jí)保護(hù)植物，目前市場(chǎng)上流通的金線蓮以人工培養(yǎng)無性繁殖苗為主[6]，隨著金線蓮栽培面積不斷擴(kuò)大，莖腐病不斷蔓延擴(kuò)散，已成為福建省金線蓮的重要病害之一，嚴(yán)重威脅金線蓮產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[7]。

已知金線蓮莖腐病的致病菌為尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum[8]。尖孢鐮刀菌是常見的植物病原真菌，被列為世界第三大土傳病原真菌，可誘發(fā)100 種以上植物的枯萎病[9]，會(huì)導(dǎo)致多種經(jīng)濟(jì)作物的根腐、莖腐和維管束枯萎病等[10]。目前能防治尖孢鐮刀菌的化學(xué)藥劑對(duì)周圍環(huán)境、微生物甚至人體都存在安全隱患[11]，有效且安全的環(huán)境友好型殺菌劑尚待研究[12]。

植物精油是一類從植物中提取的次生代謝產(chǎn)物[13]，可通過水蒸汽蒸餾等方法從植物的花、葉、莖、根等部位獲取[14]，因其抗菌、殺菌活性[15]被做為合成農(nóng)藥的安全替代品而受到越來越廣泛的關(guān)注[16]。有研究證實(shí)，香青蘭DracocephalummoldavicaL.[17]、留蘭香MenthaspicataL.、歐薄荷M.longifolia(L.) Hudson[18]、牛至OriganumvulgareL.[19]、濱香草ThymbraSpicataL.和迷迭香RosmarinusofficinalisL.[20]等多種唇形科LamiaceaeMartinov 植物精油對(duì)尖孢鐮刀菌具有抑制活性。

雖然迷迭香精油已被證實(shí)對(duì)尖孢鐮刀菌具有抑制活性，但現(xiàn)有研究使用的均為迷迭香原生種，且并未明確其中起主要抑制作用的具體成分。本研究通過水蒸汽蒸餾法提取漳州產(chǎn)5 個(gè)不同品系迷迭香的精油，以分離自發(fā)病金線蓮的尖孢鐮刀菌為供試菌種，評(píng)價(jià)迷迭香精油對(duì)該病原菌的抑菌活性，為植物源殺菌劑的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 迷迭香和匍匐迷迭香均引自中國臺(tái)灣，伍德迷迭香、闊葉迷迭香和粉花迷迭香引自浙江寧波，均保育于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所芳香植物資源圃，為露地栽培2 年以上品種。供試植物信息詳見表1。

表1 供試植物信息Table 1 Directory of tested plants

1.1.2 供試病原菌 尖孢鐮刀菌分離自金線蓮莖腐病發(fā)病株，保存于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室（基因GenBank 登錄號(hào)：OQ244517.1），根據(jù)Koch 氏法則將爬滿菌絲的接種針回接金線蓮無菌苗莖基部，以無菌水浸泡的接種針做為空白對(duì)照，確定供試病原菌具有顯著致病性[21]。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，超純水1000 mL。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器及化學(xué)試劑 揮發(fā)油測(cè)定器（密度＜1.0）、球形冷凝管、圓底燒瓶及其他玻璃器皿，漳州市騰信化玻儀器有限公司；XB.K.25 血球計(jì)數(shù)板，上海市求精生化試劑儀器有限公司；電熱套，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；Basic-Q15-IT 純水機(jī)，上海和泰儀器有限公司；GF54DA 立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器，致微（廈門）儀器有限公司；MJ-250 恒溫光照培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-1F 潔凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Trace 1300/TSQ9000 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Thermo Fisher Scientific 公司；皇家園藝學(xué)會(huì)（Royal Horticultural Society，RHS）植物比色卡（2015），英國皇家園藝學(xué)會(huì)；制霉菌素（nystatin）、正己烷標(biāo)準(zhǔn)溶液[n-Hexane，≥99%（GC）]，上海麥克林生化科技股份有限公司；二甲基亞砜（DMSO）分子生物學(xué)級(jí)，生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 迷迭香精油提取及含量測(cè)定 揮發(fā)油測(cè)定法[22]提取并測(cè)定不同品系迷迭香鮮葉的精油含量，略有改動(dòng)。供試樣品統(tǒng)一選擇栽培2 年以上植株，于晴天的早上9 點(diǎn)之前，采用五點(diǎn)式采樣法收集嫩梢距頂端15 cm之內(nèi)干凈無露水無澆灌水的新鮮葉片置于1000 mL 硬質(zhì)圓底燒瓶?jī)?nèi)，每瓶200 g，加水300 mL，振搖混合后，連接揮發(fā)油測(cè)定器與回流冷凝管。自冷凝管上端加蒸餾水使充滿揮發(fā)油測(cè)定器的刻度部分，并溢流入燒瓶時(shí)為止。燒瓶置電熱套中緩慢加熱至瓶?jī)?nèi)液面沸騰，保持微沸5 h，停止加熱1 h 后讀取精油容積，RHS 植物比色卡比對(duì)油色，計(jì)算供試品的精油含量并收集于棕色試劑瓶?jī)?nèi)26 ℃以下密封保存?zhèn)溆?，精油含量?）＝精油容積（mL）/樣品鮮重（g）×100。

1.2.2 抑菌活性篩選及EC50值測(cè)定 菌絲生長(zhǎng)抑制法[17]進(jìn)行4 個(gè)迷迭香栽培變種精油的抑菌活性篩選，略有改動(dòng)。試驗(yàn)分為2 個(gè)階段：第1 階段設(shè)計(jì)1 個(gè)空白對(duì)照和3 個(gè)濃度梯度，以迷迭香精油為陽性對(duì)照。在無菌條件下，分別向三角瓶中加入40、20 和10 μL 供試精油，用滅菌PDA 培養(yǎng)基分別定容至40 mL，配置成濃度為1.00、0.50、0.25 μL/mL 的含藥培養(yǎng)基，倒入直徑90 mm 的無菌培養(yǎng)皿，制成相應(yīng)濃度的含藥平板。設(shè)不加精油的PDA 培養(yǎng)基為空白對(duì)照。第2 階段根據(jù)第1 階段的試驗(yàn)結(jié)果，利用SPSS 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析篩選出抑菌活性最佳的2 種精油，根據(jù)抑菌率制定回歸方程y=b+ax，預(yù)測(cè)其可抑制尖孢鐮刀菌的半數(shù)有效濃度（EC50）；以此濃度為參考，同樣采用上述方法設(shè)計(jì) 3 個(gè)濃度梯進(jìn)行抑菌活性篩選，設(shè)含10 μL/mL DMSO 的PDA 培養(yǎng)基為空白對(duì)照，以相同濃度的DMSO 為不同處理中精油的溶劑，將2 mg 制霉菌素溶解于DMSO 中并定容至400 μL，再用滅菌PDA 定容至40 mL，制得0.005%含藥平板，以此為陽性對(duì)照[18]。

菌餅制備：在無菌條件下取直徑6 mm 的濾紙浸泡于濃度為106～107CFU/mL 的菌懸液中備用。

接種：在無菌條件下取菌餅分別置于含藥平板及空白對(duì)照平板中心，將培養(yǎng)基置于恒溫培養(yǎng)箱（28 ℃）中，正置暗培養(yǎng)24 h，倒置暗培養(yǎng)6～9 d。

活性測(cè)定方法[23]：待對(duì)照組菌絲接近培養(yǎng)皿邊緣時(shí)，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑（cm），重復(fù)3次，取平均值，計(jì)算抑制率，抑制率（%）＝（對(duì)照菌落直徑－處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑－菌餅直徑）×100。利用Microsoft Excel 計(jì)算相對(duì)抑制率，利用SPSS V13.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析及毒力回歸方程計(jì)算。

1.2.3 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Gas chromatograph- mass spectrometer，GC-MS）測(cè)定精油化學(xué)成分 每種精油均以正己烷稀釋為5 μL/mL 的混合溶液，以正己烷標(biāo)準(zhǔn)品做為進(jìn)樣針清洗劑，分別進(jìn)行GC-MS 成分分析。

氣相色譜條件：Thermo TG-5SilMS GC 極性柱（長(zhǎng)度30 m，內(nèi)徑0.25 mm，膜厚0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；進(jìn)樣量：0.4 μL，分流比1:50，載氣：氦氣。升溫程序：起始溫度50 ℃，停留5 min，以5 ℃/min 的速度升至160 ℃，再以10 ℃/min 升溫至250 ℃，保持5 min。

質(zhì)譜條件：EI 電離方式，EI 離子源溫度：210 ℃；傳輸線溫度：250 ℃，電子倍增電壓：1847 V；電離電壓：70 eV；離子源溫度：300 ℃；掃描質(zhì)量范圍（m/z）：30～550，通過譜庫檢索和資料分析，結(jié)合文獻(xiàn)進(jìn)行人工譜圖解析確定各化學(xué)成分，依據(jù)總離子流各色譜峰平均峰面積，運(yùn)用峰面積歸一化法求得各成分的相對(duì)含量，小數(shù)點(diǎn)后保留二位有效數(shù)字。

1.2.4 目標(biāo)核心成分篩選 結(jié)合抑菌活性測(cè)試及精油成分分析結(jié)果，利用Simca 14.1 對(duì)供試的5 種精油進(jìn)行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA），從中篩選可能存在抑菌活性的目標(biāo)功能成分。

2 結(jié)果與分析

2.1 迷迭香鮮葉精油含量及油色

水蒸汽蒸餾法回流提取收集的5 個(gè)品系迷迭香精油含量及油色如表2 所示。粉花迷迭香鮮葉的含油量與陽性對(duì)照接近，無顯著差異；伍德迷迭香含油量顯著低于粉花迷迭香及陽性對(duì)照，與匍匐迷迭香含油量接近；闊葉迷迭香葉的含油量最低，與其他品系之間存在極顯著差異。從油色上看，雖然不同迷迭香精油的顏色存在少許差異，但總體來說闊葉迷迭香精油的顏色與陽性對(duì)照較為接近，匍匐迷迭香與伍德迷迭香精油的顏色較為接近，粉花迷迭香油的顏色最淡，與其他四者差異較大。

表2 5 種迷迭香葉精油含量及油色對(duì)比Table 2 Comparison of essential oil content and oil colour from leaves of 5 rosemary varieties

2.2 不同迷迭香精油的抑菌活性篩選及EC50 測(cè)定

2.2.1 抑菌活性篩選 5 個(gè)品系迷迭香精油對(duì)尖孢鐮刀菌的抑菌活性如表3 所示，采用SPSS 對(duì)同一濃度下不同精油的抑菌率進(jìn)行單因素方差分析可知，在精油體積濃度為1.00 μL/mL 時(shí)不同品系迷迭香精油的抑菌率均表現(xiàn)出極顯著差異，其中匍匐迷迭香油的抑菌率最高，達(dá)27.13%，闊葉迷迭香的抑菌率最低，僅8.44%；除闊葉迷迭香外，其余品系精油的抑菌率均極顯著優(yōu)于陽性對(duì)照。當(dāng)精油體積濃度為0.50 μL/mL時(shí)，匍匐迷迭香及伍德迷迭香精油的抑菌率極顯著優(yōu)于其他品系及陽性對(duì)照，仍以匍匐迷迭香精油的抑菌率最高，達(dá)19.92%。當(dāng)精油體積濃度為0.25 μL/mL 時(shí)，闊葉迷迭香油的抑菌率最高，達(dá)2.36%，顯著優(yōu)于匍匐迷迭香，極顯著優(yōu)于其他品系；其中，陽性對(duì)照、伍德迷迭香和粉花迷迭香在該濃度下無抑菌活性。從方差分析的整體結(jié)果來看，5 種精油的抑菌活性與添加濃度均為正相關(guān)，當(dāng)濃度達(dá)到1.00 μL/mL 時(shí)出現(xiàn)極顯著差異，其中匍匐迷迭香及粉花迷迭香的抑菌表現(xiàn)最為突出。

表3 迷迭香精油對(duì)尖孢鐮刀菌的抑菌活性Table 3 Fungicial activity of rosemary essential oils against F.oxysporum

2.2.2 匍匐迷迭香及粉花迷迭香精油EC50值測(cè)定 利用SPSS 計(jì)算匍匐迷迭香及粉花迷迭香油對(duì)尖孢鐮刀菌的EC50值結(jié)果如表4。匍匐迷迭香油對(duì)尖孢鐮刀菌的EC50值約為1.719 μL/mL。粉花迷迭香油對(duì)尖孢鐮刀菌的EC50值約為1.856 μL/mL。

表4 2 種迷迭香精油對(duì)尖孢鐮刀菌的EC50 值和EC95 值Table 4 EC50 and EC95 value of the essential oil from leaves of 2 rosemary varieties

以預(yù)測(cè)的濃度為參考值設(shè)置濃度梯度，將匍匐迷迭香精油和粉花迷迭香精油分別配置成濃度為0.25%、0.20%和0.15%的含藥平板。

抑菌效果如圖1 及表5 所示。從結(jié)果可知，在同等濃度情況下匍匐迷迭香精油對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制效果極顯著優(yōu)于陽性對(duì)照和粉花迷迭香。當(dāng)匍匐迷迭香精油的添加濃度高于0.15%時(shí)抑菌率高于50%；粉花迷迭香精油的添加濃度需達(dá)到0.25%時(shí)抑菌率高于50%。以此初步確定匍匐迷迭香和粉花迷迭香對(duì)尖孢鐮刀菌的EC50分別為0.15%和0.25%。

圖1 28 ℃培養(yǎng)7 d 后2 種迷迭香精油不同濃度下對(duì)尖孢鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)抑制效果Fig.1 Effects of the two studied EOs at different concentrations on mycelial growth reduction results of F.oxysporum after 7 days of incubation at 28 ℃

表5 2 種迷迭香精油對(duì)尖孢鐮刀菌的抑菌效果Table 5 Bacteriostatic effect of the essential oil from leaves of 2 rosemary varieties

2.3 GC-MS 分析迷迭香葉精油的揮發(fā)性成分

經(jīng)GC-MS 檢測(cè)鑒定，發(fā)現(xiàn)不同栽培變種的迷迭香精油，其成分含量略有差異。從圖2-6 可以看出，迷迭香和伍德迷迭香的精油成分較為接近，含量最高的成分均為α-蒎烯；匍匐迷迭香和闊葉迷迭香的精油成分較為接近，含量最高的成分均為桉葉油醇和樟腦；粉花迷迭香與其余4 個(gè)品種迷迭香的精油成分差異較大，含量最高的成分為β-蒎烯。

圖2 迷迭香精油色譜圖Fig.2 Chromatogram of essential oil from Rosmarinus officinalis L.

圖3 匍匐迷迭香精油色譜圖Fig.3 Chromatogram of essential oil from Rosmarinus officinalis L.‘Severn sea’

圖5 闊葉迷迭香精油色譜圖Fig.5 Chromatogram of essential oil from Rosmarinus officinalis L.‘Rex’

圖6 粉花迷迭香精油色譜圖Fig.6 Chromatogram of essential oil from Rosmarinus officinalis L.‘Majorca Pink’

由表6 的質(zhì)譜分析結(jié)果可知，迷迭香葉中含量最高的3 種成分依次是：α-蒎烯（29.58%）、桉葉油醇（20.69%）和馬鞭草酮（14.87%）。匍匐迷迭香葉中含量最高的3 種成分依次是：桉葉油醇（19.32%）、樟腦（19.06%）和α-蒎烯（13.44%）。伍德迷迭香葉中含量最高的3 種成分依次是：α-蒎烯（36.09%）、桉葉油醇（10.20%）和馬鞭草酮（8.08%）。闊葉迷迭香葉中含量最高的3 種成分依次是：樟腦（16.92%）、桉葉油醇（14.59%）和乙酸龍腦酯（8.79%）。粉花迷迭香葉中含量最高的3 種成分依次是：β-蒎烯（28.79%）、樟腦（15.20%）和α-蒎烯（13.83%）?？梢钥闯觯? 種迷迭香精油的成分中含量最高的均為單萜類化合物。

表6 5 種迷迭香精油化學(xué)成分分析Table 6 Chemical constituents of essential oil from 5 species of rosemaries

2.4 目標(biāo)成分篩選

利用Simca 14.1 對(duì)供試精油進(jìn)行主成分分析（PCA）結(jié)果見圖7。在所有供試成分中，與尖孢鐮刀菌的抑制率呈正相關(guān)的成分為樟腦、桉葉油醇、β-蒎烯、內(nèi)-龍腦、乙酸龍腦酯、d-檸檬烯、莰烯、α-松油醇和十二烷；其中樟腦、桉葉油醇和β-蒎烯的貢獻(xiàn)率最大。

圖7 與抑菌率呈正相關(guān)的成分得分圖Fig.7 Composition score chart with positive correlation with bacteriostatic rate

3 討論

目前國內(nèi)外對(duì)于植物精油及其中單萜類化合物對(duì)真菌具有抑制活性的研究屢見報(bào)道[24-27]。其中迷迭香（原生種）精油被發(fā)現(xiàn)對(duì)黃瓜尖孢鐮刀菌及甜瓜尖孢鐮刀菌均具有抑菌活性[20]。迷迭香做為唇形科常綠灌木，原產(chǎn)歐洲及北非地中海沿岸，曹魏時(shí)引入我國[28]，經(jīng)多年栽培已出現(xiàn)多份栽培變種，但對(duì)其相關(guān)研究多集中于種植技術(shù)、精油成分及抗氧化活性等方面，對(duì)同一地區(qū)產(chǎn)不同栽培變種迷迭香的出油率及抑菌活性方面的比較仍較罕見[29]。經(jīng)頂空固相微萃取法測(cè)試不同變種迷迭香鮮葉中的揮發(fā)性成分可知，其所含成分之間存在差異[30,31]。其中或存在對(duì)尖孢鐮刀菌的抑菌活性優(yōu)于原生種的更佳選擇。

從本文可知，無論從直觀的油色判斷，還是通過GC-MS 成分分析，迷迭香不同變種的葉片中提取的精油所含成分確實(shí)存在差異，其中匍匐迷迭香和粉花迷迭香精油對(duì)目標(biāo)菌種的抑菌活性均極顯著高于迷迭香原生種，這一結(jié)論為進(jìn)一步篩選植物源抑菌劑的原材料方面開拓了新的思路。

普遍認(rèn)為抑菌活性或與精油中含量較高的成分呈正相關(guān)，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，雖然5 種迷迭香精油在適當(dāng)?shù)臐舛认戮嬖谝志钚?，但其中諸如α-蒎烯和馬鞭草酮這一類高含量物質(zhì)對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制率并未呈現(xiàn)正相關(guān)，而內(nèi)-龍腦、乙酸龍腦酯及d-檸檬烯這些易被忽略的微量成分反而對(duì)迷迭香精油的抑制活性表現(xiàn)出正向貢獻(xiàn)值。本研究也進(jìn)一步明確了可抑制尖孢鐮刀菌的主要目標(biāo)活性成分樟腦、桉葉油醇和β-蒎烯。

有研究發(fā)現(xiàn)樟腦雖然無法破壞大腸桿菌的菌體結(jié)構(gòu)，但可以抑制其代謝、趨化性和某些抗性反應(yīng)，對(duì)大腸桿菌具有強(qiáng)烈的抑制效果[32]；桉葉油醇可破壞蘭州百合病原細(xì)菌B-6 的菌體結(jié)構(gòu)并使菌絲表現(xiàn)出大量褶皺、斷裂和扭曲[33]；β-蒎烯可有效抑制意大利青霉菌孢子的萌發(fā)與芽管伸長(zhǎng)，進(jìn)而損傷青霉菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)[34]。以上發(fā)現(xiàn)或與迷迭香精油對(duì)尖孢鐮刀菌具有抑菌活性有關(guān)，但確切的抑菌作用機(jī)制尚未明確，值得進(jìn)一步研究，為新型植物源殺菌劑主要活性成分的合成提供依據(jù)。