分散固相萃取結(jié)合UPLC-MS/MS測(cè)定不同人參加工品中46 種皂苷類化合物

王艷紅，吳雨桐，曹虹芳，許煊煒，趙 丹，李月茹,*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部參茸產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118）

人參是五加科植物人參（Panax ginsengC.A.Meyer）的干燥根和根莖，具有大補(bǔ)元?dú)狻?fù)脈固脫、補(bǔ)脾益腎、生津養(yǎng)血、安神益智之功效[1]，是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥材，一直以來(lái)素有“中藥之首，百草之王”的美譽(yù)。現(xiàn)代藥物化學(xué)和藥理學(xué)研究結(jié)果表明，人參中皂苷類物質(zhì)是其主要的活性成分，具有抗腫瘤、抗衰老、抗氧化、降血糖和增強(qiáng)免疫功能等多種藥理作用[2-3]。人參皂苷根據(jù)在人參中的量被分為常量人參皂苷（主要人參皂苷）和稀有人參皂苷，常量人參皂苷如人參皂苷Ra1、Ra2、Ra3、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rg1、Rg2、Rf等含有較多糖基、在人參中含量相對(duì)較高，但其生物活性較低，在人體內(nèi)的吸收率也很低；稀有人參皂苷如人參皂苷Rg3、Rg5、Rg6、F4、Rh1、Rh2、Rh3、Rh4、Rk1、Rk2、Rk3、F1、F2等在人參屬植物中含量很少，很難從人參屬植物中直接分離得到，一般通過(guò)降解常量人參皂苷的方法制備稀有人參皂苷，但稀有人參皂苷含糖基較少，生物活性更好，身體吸收率更高[4-5]。此外，人參通過(guò)不同的加工方式，部分常量皂苷也會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生稀有人參皂苷[6-7]。市場(chǎng)上最常見的人參加工產(chǎn)品為生曬參和紅參，近年來(lái)，人參經(jīng)過(guò)九蒸九曝加工方法而成的黑參也逐漸出現(xiàn)在市場(chǎng)上，且由于黑參除了部分稀有皂苷含量較高，還含有一些特異性的稀有人參皂苷，并表現(xiàn)出更強(qiáng)的生物活性，越來(lái)越受到廣大消費(fèi)者的歡迎[8]。可見不同的加工方式引起了人參皂苷含量和種類的差異，對(duì)其藥理活性和臨床應(yīng)用也有較大的影響。為此，評(píng)估人參皂苷水平對(duì)人參加工產(chǎn)品的質(zhì)量控制和正確有效使用至關(guān)重要。而人參皂苷種類繁多，且結(jié)構(gòu)具有多樣性和相似性，針對(duì)人參相關(guān)產(chǎn)品復(fù)雜體系中多種皂苷類成分的快速鑒定及定量分析檢測(cè)技術(shù)，國(guó)內(nèi)外研究者們也一直在不斷的探索和研究。

近20年來(lái)，利用高效液相色譜法和超高效液相色譜法定量分析人參皂苷的含量已經(jīng)是一種比較成熟的分析手段[9-12]，但由于檢測(cè)種類有限，分析時(shí)間較長(zhǎng)，單一液相色譜方法難以滿足人參及人參相關(guān)產(chǎn)品復(fù)雜體系中多種皂苷類成分同時(shí)快速分析檢測(cè)。隨著現(xiàn)代質(zhì)譜技術(shù)的快速發(fā)展，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)因其具有靈敏度高、分辨率好且高效快速便捷等優(yōu)點(diǎn)已被廣泛用于人參皂苷定性定量分析研究中。目前，雖然已有大量研究報(bào)道了應(yīng)用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析及鑒定人參皂苷類成分的檢測(cè)方法，從液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，到超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等。但既簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、快速又覆蓋皂苷種類多的定量檢測(cè)分析方法還有限。三重四極桿質(zhì)譜通常采用的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式需要已知的標(biāo)準(zhǔn)品優(yōu)化儀器參數(shù)和對(duì)分析物進(jìn)行定量分析檢測(cè)，具靈敏度高、選擇性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，更適用于已知物質(zhì)的定量分析。如Xia Yonggang等[13]采用超高效液相色譜結(jié)合電噴霧電離和三重四極桿質(zhì)譜分析測(cè)定了西洋參中22 種人參皂苷的含量；石婧婧等[14]建立了超快速液相色譜-三重四極桿/線性離子阱質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定紅參中17 種人參皂苷類成分；趙立春等[15]建立了人參中28 種人參皂苷含量的超高效液相色譜-質(zhì)譜法（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）檢測(cè)方法。這些超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法，操作簡(jiǎn)單、快速準(zhǔn)確，但是分析皂苷種類和數(shù)量覆蓋面較窄，難以滿足人參不同產(chǎn)品中皂苷類化合物復(fù)雜多樣的分析檢測(cè)要求。郝穎[16]和戴雨霖[17]等采用了高分離度快速液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜法分析鑒定了不同人參樣品中40多種皂苷類成分；Lee等[18]采用超高效液相色譜-高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析鑒定了人參根、莖、葉和果中的58 種皂苷類化合物。這些高分辨質(zhì)譜法檢測(cè)人參皂苷的多組分常采用飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)器，具有超高的分辨率和精確分子質(zhì)量測(cè)定功能，更適用于未知物質(zhì)的定性鑒別。且超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀不僅價(jià)格昂貴，還需具備較高的專業(yè)技術(shù)水平等，在大部分領(lǐng)域的應(yīng)用仍處于發(fā)展階段，大部分實(shí)驗(yàn)室仍未普及，液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀仍然是當(dāng)前科研和檢測(cè)機(jī)構(gòu)的主流定量分析手段。

由于人參不同產(chǎn)品中含有較多的糖類、脂類及色素等成分，為了降低基質(zhì)的干擾，保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，并減少對(duì)色譜柱和儀器的污染，需要對(duì)其進(jìn)行凈化處理。目前最常見的人參皂苷前處理凈化方法仍是傳統(tǒng)的固相萃取法[19-20]、液液萃取法[21-22]，這些方法存在過(guò)程繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、成本高、需要大量有毒有機(jī)溶劑等問(wèn)題，且無(wú)法滿足批量樣品中多種皂苷的同時(shí)簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確檢測(cè)的需求。分散固相萃取法作為一種簡(jiǎn)便、快速、價(jià)格低廉的分析方法，已成功用于農(nóng)藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域。近年來(lái)該方法在中藥有效成分提取凈化及分析中的應(yīng)用研究也有報(bào)道，如藥用狗牙花中生物堿、五味子中木脂素[23-24]。但將分散固相萃取法用于人參中皂苷類成分凈化分析方面的研究鮮見報(bào)道。本研究在前人研究基礎(chǔ)上，采用了分散固相萃取法對(duì)人參樣品進(jìn)行凈化處理，利用超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀建立46 種皂苷類成分的檢測(cè)方法，并對(duì)人參不同加工品中皂苷類化合物的含量和組成進(jìn)行檢測(cè)分析和比較。該方法進(jìn)一步拓展了現(xiàn)有方法的檢測(cè)范圍，增加了樣品前處理的凈化技術(shù)和皂苷類化合物的檢測(cè)種類，操作簡(jiǎn)便、快速，為不同人參加工品中多種皂苷類化合物的快速分析檢測(cè)提供了技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3 種人參加工品（生曬參、紅參和黑參）為吉林省撫松萬(wàn)良人參市場(chǎng)隨機(jī)購(gòu)買。

46 種皂苷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)照品（純度均不小于95%）購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司和成都曼斯特生物科技有限公司。

甲醇、乙腈（均為色譜純） 德國(guó)Merck公司；甲酸（色譜純） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；其他試劑均為分析純。

N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）、十八烷基鍵合硅膠（C18）吸附劑、石墨化碳黑（graphitized carbon black，GCB）吸附劑 北京恩加壹科技有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水（Milli-Q純水處理系統(tǒng)制備，美國(guó)Millipore公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

Sep-pak C18固相萃取小柱（1 g/6 mL） 美國(guó)Waters公司；LC-30A超高效液相色譜儀 日本Shimadzu公司；AB QTRAP 4500三重四極桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜儀、Analyst、Peak View和MultiQuant數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 美國(guó)AB SCIEX公司；Kinetex XB-C18色譜柱（2.1 mm ×100 mm，2.6 μm） 美國(guó)Phenomenex公司；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；Heraeus Multifuge XIR臺(tái)式冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司；AL204型電子天平 美國(guó)Sartorius公司；VORTEX-6旋渦混合器 北京海天友誠(chéng)科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取4 6 種皂苷標(biāo)準(zhǔn)品各1 0 m g（精確至0.1 mg），分別以甲醇溶解并定容，配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，于4 ℃避光保存?zhèn)溆?。取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，以甲醇稀釋成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液。分別取適量標(biāo)準(zhǔn)中間液，根據(jù)各化合物的響應(yīng)情況，分別用甲醇稀釋成不同質(zhì)量濃度的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 樣品前處理

提?。喝「稍镏梁阗|(zhì)量的人參加工品樣品粉碎，過(guò)60 目篩，準(zhǔn)確稱取1 g（精確到0.000 1 g）樣品粉末，加入50 mL 80%甲醇溶液，浸泡過(guò)夜，超聲40 min，以5 000 r/min離心15 min，精密移取上清液2 mL，60 ℃下氮?dú)獯蹈?，用甲醇溶解并定容? mL，待凈化。

凈化：準(zhǔn)確移取提取液2 mL至裝有100 mg PSA的離心管中，渦旋振蕩2 min，5 000 r/min離心6 min。上清液過(guò)0.22 μm濾膜，備用。或根據(jù)實(shí)際濃度用甲醇適當(dāng)稀釋至線性范圍內(nèi)，作為供試品溶液待測(cè)。

1.3.3 色譜條件

Kinetex XB-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.6 μm）；柱溫40 ℃；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量2.0 μL；流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液，B為乙腈；梯度洗脫：0～1.0 min，81% A、19% B；1.0～2.0 min，81%～72% A、19%～28% B；2.0～14.0 min，72%～65% A、28%～35% B；14.0～20.0 min，65%～55% A、35%～45% B；20.0～25.0 min，55%～43% A、45%～57% B；25.0～28.0 min，43%～0% A、57%～100% B；28.0～30.0 min，0% A、100% B；30.0～32.0 min，0%～81% A、100%～19% B；32.0～35.0 min，81% A、19% B。

1.3.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源負(fù)離子模式；MRM模式；霧化電壓-4 500 V；離子化溫度450 ℃；霧化氣壓力45 psi；輔助氣壓力4 5 p s i；碰撞氣壓力M e d i u m；氣簾氣壓力35 psi。

1.3.5 基質(zhì)效應(yīng)計(jì)算

基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）/%=A/B×100。其中A為樣品中皂苷類物質(zhì)的峰面積；B為純?nèi)軇┲型瑵舛仍碥疹愇镔|(zhì)對(duì)應(yīng)的峰面積。當(dāng)ME＞1時(shí)，表示基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，當(dāng)ME＜1時(shí)，表示基質(zhì)抑制效應(yīng)。若ME為80%～120%時(shí)，表示ME不明顯，可以忽略；若ME在50%～80%或120%～150%時(shí)，表現(xiàn)為中等ME；若ME＜50%或者M(jìn)E＞150%時(shí)，則表現(xiàn)為強(qiáng)ME[25]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過(guò)與儀器配套的AB SCIEX公司的Analyst 1.6軟件系統(tǒng)完成數(shù)據(jù)采集與處理，在Multi Quant 3.0和Peak View 2.0軟件上定性定量處理和譜圖分析，采用Excel和分析軟件SIMCA 14.1對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)所測(cè)的皂苷類化合物種類多，但結(jié)構(gòu)相似，性質(zhì)差異較小，且含有多對(duì)同分異構(gòu)體，這些化合物具有相同的前體和產(chǎn)物離子，在質(zhì)譜上無(wú)法通過(guò)離子對(duì)其進(jìn)行區(qū)分，若要準(zhǔn)確定量這些化合物，色譜峰要有一定程度的分離。因此實(shí)驗(yàn)對(duì)色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，以實(shí)現(xiàn)皂苷類化合物的最佳色譜分離以及各化合物的良好峰形和最佳響應(yīng)。實(shí)驗(yàn)首先考察了在相同參數(shù)條件下，不同型號(hào)色譜柱Waters HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、Waters BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）和Kinetex XB-C18（2.1 mm×100 mm，2.6 μm）的分離效果，結(jié)果表明，HSS T3色譜柱對(duì)于部分皂苷類物質(zhì)分離效果較差，特別是無(wú)法實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)多對(duì)同分異構(gòu)體化合物的基線分離；而Waters BEH C18和Kinetex XB-C18色譜柱對(duì)46 種目標(biāo)化合物均呈現(xiàn)較好的色譜峰形和分離度，但考慮到對(duì)系統(tǒng)壓力的影響，選擇具有低柱壓的Kinetex XB-C18作為分離色譜柱。在流動(dòng)相選擇方面，考察反相色譜常用的有機(jī)相溶劑（甲醇、乙腈）與水組成的流動(dòng)相體系對(duì)皂苷類成分的分離效果，發(fā)現(xiàn)以乙腈體系為流動(dòng)相時(shí)，系統(tǒng)平衡時(shí)間相對(duì)較快，且洗脫能力和分離效果均優(yōu)于甲醇體系。在流動(dòng)相中加入適量的甲酸可以減少色譜峰的拖尾，提高皂苷類化合物的離子化效率，改善色譜峰形，并增強(qiáng)目標(biāo)化合物的響應(yīng)信號(hào)和穩(wěn)定性。因此，本實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相選擇最常用的乙腈-0.1%甲酸溶液系統(tǒng)，在很大程度上減少了溶劑系統(tǒng)帶來(lái)的背景和基質(zhì)干擾。最后，通過(guò)調(diào)節(jié)梯度洗脫程序使互為同分異構(gòu)體的皂苷類化合物進(jìn)一步分離，由待測(cè)目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)可知，本研究中46 種皂苷類化合物中同分異構(gòu)體較多，但可通過(guò)保留時(shí)間和離子碎片的不同加以區(qū)分。例如，人參皂苷Rb2、Rb3和Rc與人參皂苷Rs1和Rs2這兩組同分異構(gòu)體，它們各自產(chǎn)生的檢測(cè)離子碎片雖然相同，但可通過(guò)保留時(shí)間的不同得到較好分離；而另一組同分異構(gòu)體原人參三醇型皂苷Rf和擬人參皂苷F11，二者保留時(shí)間較接近，通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相梯度也無(wú)法得到較好分離，但由于二者產(chǎn)生的離子碎片不同則可加以區(qū)分。在優(yōu)化的儀器條件下，各皂苷類化合物靈敏度和和峰形均可滿足檢測(cè)要求，整個(gè)梯度運(yùn)行時(shí)間為35 min，46 種皂苷類化合物均得到有效分離，能夠達(dá)到準(zhǔn)確定性定量目的。46 種目標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖見圖1，46 種化合物信息見表1。

表1 46 種人參皂苷類化合物的質(zhì)譜參數(shù)、線性關(guān)系、檢出限和定量限Table 1 Mass spectrometric parameters, linearities, LODs and LOQs of 46 ginsenoside compounds

圖1 46 種人參皂苷類化合物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of 46 ginsenoside standards

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用針泵直接將標(biāo)準(zhǔn)溶液注入離子源的方式對(duì)7 種皂苷類化合物質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。分別將46 種待測(cè)皂苷類化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液（質(zhì)量濃度均為1.0 μg/mL）以7 μL/min注入電噴霧離子源，采用正、負(fù)2 種離子模式進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)皂苷類化合物在負(fù)離子模式下具有較高的穩(wěn)定性和較高的響應(yīng)值，這與文獻(xiàn)[26]相關(guān)報(bào)道一致，因此選擇負(fù)離子模式。皂苷類物質(zhì)在負(fù)離子模式下的一級(jí)質(zhì)譜圖中，其準(zhǔn)分子離子主要以[M-H]-和[M＋HCOOH-H]-的形式存在。在Q1進(jìn)行全掃描中，找出母離子，母離子在Q2打碎后，在Q3進(jìn)行子離子全掃描以確定各組分的主要碎片離子，選擇2 個(gè)無(wú)干擾、靈敏度相對(duì)較高的穩(wěn)定的特征子離子，組成MRM離子對(duì)，作為定性定量的離子對(duì)。在MRM模式下優(yōu)化去簇電壓和碰撞能量，最終確定了46 種皂苷類化合物的MRM離子對(duì)、去簇電壓及碰撞能量。優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

2.3 提取條件的選擇

人參皂苷類化合物的提取相關(guān)報(bào)道較多，常用的提取溶劑和方法有甲醇回流提取[27]、甲醇超聲提取[28]、80%甲醇超聲提取[12]、水飽和正丁醇超聲提取[29]和60%乙醇超聲提取[14]。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，選用提取方法較簡(jiǎn)單的超聲提取法，并考察甲醇、80%甲醇、水飽和正丁醇和60%乙醇作為提取溶劑時(shí)，各個(gè)皂苷類化合物的提取效果。經(jīng)過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，80%甲醇和60%乙醇對(duì)大部分皂苷類化合物的提取效率優(yōu)于純甲醇和水飽和正丁醇，但60%乙醇為提取溶劑時(shí)，提取液的顏色較濃，雜質(zhì)較多，且基線不穩(wěn)定，不利于后續(xù)的凈化處理，而80%甲醇溶液的提取效果總體最佳，基線和峰形也較好，因此最終選用80%甲醇溶液作為提取溶劑。

2.4 凈化條件的優(yōu)化

人參加工品提取液中的糖類、色素及有機(jī)酸等雜質(zhì)會(huì)產(chǎn)生ME，干擾待測(cè)物的分析，而且會(huì)損壞檢測(cè)儀器和色譜柱，需要對(duì)樣品進(jìn)一步凈化。為了使凈化時(shí)盡可能多地去除雜質(zhì)干擾，又能減少對(duì)目標(biāo)物的損失，同時(shí)使實(shí)驗(yàn)方法達(dá)到簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，具有時(shí)效性。實(shí)驗(yàn)對(duì)Sep-pak C18（1 g/6 mL）為固相萃取柱的固相萃取法[9]和分散固相萃取2 種凈化方式進(jìn)行比較。發(fā)現(xiàn)C18固相萃取柱凈化后，各化合物的回收率可達(dá)到80%～105%，凈化效果也較明顯，但C18固相萃取柱凈化過(guò)程需要活化、平衡、洗脫等多個(gè)步驟，處理時(shí)間長(zhǎng)，過(guò)程也較繁瑣。分散固相萃取凈化方法具有快速、簡(jiǎn)單、廉價(jià)、有效等特點(diǎn)，可將提取液直接達(dá)到凈化目的，是較為理想的樣品前處理凈化方法。常用的吸附劑有C18、GCB、PSA等。實(shí)驗(yàn)分別考察3 種吸附劑C18、GCB和PSA對(duì)46 種皂苷類化合物回收率的影響，結(jié)果如圖2所示，當(dāng)使用C18作為吸附劑時(shí)，46 種目標(biāo)化合物的回收率為8.9%～31.6%，這是因?yàn)镃18吸附劑具有疏水作用，除了能吸附色素、脂肪和維生素等非極性的組分，對(duì)中等極性或極性小的分子也有吸附[30]，因此對(duì)皂苷類化合物的吸附作用較強(qiáng)，不利于凈化。當(dāng)使用GCB作為吸附劑時(shí)，凈化后的提取液顏色最淺，雖然對(duì)人參樣品提取液中色素類物質(zhì)凈化效果最好，但由于GCB其表面光滑無(wú)孔的石墨晶型結(jié)構(gòu)決定其對(duì)非極性化合物、弱極性化合物和部分極性化合物都具有一定的吸附作用[31]。因此GCB不僅對(duì)色素類物質(zhì)吸附性好，還會(huì)吸附目標(biāo)化合物，使目標(biāo)化合物的回收率降低，GCB對(duì)46 種目標(biāo)化合物凈化后的回收率為30.1%～69.5%。PSA對(duì)46 種目標(biāo)化合物的吸附作用均較弱，回收率在80.2%～103.8%之間，而且PSA對(duì)脂肪酸、色素、有機(jī)酸、及糖等極性干擾物的去除效果較好，基本可滿足凈化需求[32]。

圖2 3 種吸附劑對(duì)46 種目標(biāo)化合物回收率的影響Fig.2 Effects of three sorbents on recoveries of 46 analytes

為了進(jìn)一步提高樣品的凈化效果，實(shí)驗(yàn)對(duì)PSA用量進(jìn)行調(diào)整，在2 mL提取液中分別加入60 、80、100、120、140 mg的吸附劑PSA進(jìn)行凈化處理，同樣以凈化回收率作為考察指標(biāo)進(jìn)行比較，結(jié)果如圖3所示，發(fā)現(xiàn)PSA添加量為60、80、100 mg時(shí)46 種皂苷類化合物的回收率無(wú)明顯變化，回收率為81.9%～113.5%，其中100 mg PSA的回收率和凈化效果均較好。隨著PSA用量的增加，目標(biāo)化合物的回收率受到嚴(yán)重影響，添加量120 mg PSA的回收率為72.2%～85.8%，添加量140 mg PSA的回收率為65.6%～80.8%，這是由于吸附劑用量過(guò)高時(shí)，會(huì)對(duì)目標(biāo)化合物產(chǎn)生部分吸附，從而降低目標(biāo)化合物的回收率。因此，綜合考慮回收率和凈化效果，實(shí)驗(yàn)最終選擇2 mL提取液中加入100 mg PSA作為凈化劑，可以獲得良好的凈化效果，基質(zhì)干擾小，且不會(huì)對(duì)待測(cè)皂苷類化合物產(chǎn)生明顯吸附。

圖3 PSA吸附劑用量對(duì)46 種目標(biāo)化合物回收率的影響Fig.3 Effect of PSA dosage on recoveries of 46 analytes

2.5 ME考察

由于人參加工樣品基質(zhì)復(fù)雜，可能會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度造成干擾，為此對(duì)方法中的ME進(jìn)行考察。分別以生曬參、紅參、黑參樣品為基質(zhì)，按照1.3.2節(jié)樣品前處理方法制備基質(zhì)溶液，分別用基質(zhì)溶液和純?nèi)軇┡渲埔幌盗谢旌匣|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)工作液，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定。利用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)算出基質(zhì)中目標(biāo)物質(zhì)本底濃度和峰面積，再用純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)算出對(duì)應(yīng)濃度下純?nèi)軇┲心繕?biāo)物質(zhì)的峰面積，利用公式計(jì)算ME。

本研究中分別比較了樣品在分散固相萃取法凈化前后的ME，如圖4所示，分散固相萃取凈化前生曬參、紅參、黑參樣品中部分目標(biāo)化合物的ME值在120%～150%之間，表現(xiàn)為中等基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；部分目標(biāo)化合物的ME值在50%～80%之間，表現(xiàn)為中等基質(zhì)抑制效應(yīng)。經(jīng)分散固相萃取凈化后，46 種目標(biāo)化合物在生曬參、紅參、黑參樣品中的ME值分別為88.6%～110.9%、86.5%～109.6%和84.8%～112.2%，ME表現(xiàn)不明顯，說(shuō)明樣品基質(zhì)經(jīng)過(guò)前處理過(guò)程的分散固相萃取凈化和較大體積的稀釋，有效降低了人參加工品中ME的影響，保證了定性定量結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠。

圖4 46 種目標(biāo)化合物MEFig.4 Matrix effects of 46 analytes

2.6 方法學(xué)驗(yàn)證

2.6.1 方法的線性范圍、檢出限及定量限結(jié)果

在優(yōu)化的分析條件下，測(cè)定46 種皂苷類化合物系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，以各目標(biāo)化合物定量離子對(duì)的峰面積為縱坐標(biāo)（y），以相應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各目標(biāo)物的線性回歸方程。以3 倍信噪比確定方法的檢出限，以10 倍信噪比確定方法的定量限。46 種人參皂苷類化合物在0.02～50 μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，所對(duì)應(yīng)的相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.99。方法的檢出限和定量限分別在0.4～3.2 mg/kg和1.4～10.5 mg/kg范圍內(nèi)，均滿足檢測(cè)需要，結(jié)果見表1。

2.6.2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在已知皂苷類化合物含量的生曬參、紅參和黑參樣品中，分別添加低、中、高3 個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)添加水平重復(fù)5 次。計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果見表2。46 種皂苷類化合物除20(S)-人參皂苷Rh2和20(R)-人參皂苷Rh2在3 種人參加工產(chǎn)品中平均加標(biāo)回收率為80.5%～84.6%，其余44 種皂苷類化合物的平均加標(biāo)回收率均達(dá)到85.2%～111.6%之間，RSD均在1.3%～6.8%之間，表明本實(shí)驗(yàn)方法有較好的回收率，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表2 皂苷類化合物的加標(biāo)回收率、日內(nèi)和日間精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性Table 2 Spiked recoveries, intra-day and intra-day precision, repeatability and stability for the determination of 46 ginsenosides

2.6.3 精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性結(jié)果

取5 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別在1 d內(nèi)（6 次）和3 d內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣（2 次/d）。計(jì)算各成分含量的日內(nèi)和日間RSD，用以表征日內(nèi)和日間精密度。取同一樣品分析溶液，分別在0、2、4、8、12 h和24 h進(jìn)樣6 次，測(cè)定目標(biāo)化合物峰面積的RSD，考察其穩(wěn)定性。取同一批樣品粉末6 份，按1.3.2節(jié)方法制備供試品溶液，在1.3.3節(jié)和1.3.4節(jié)條件下進(jìn)樣，計(jì)算目標(biāo)化合物測(cè)得含量的RSD，考察其重復(fù)性。結(jié)果見表2。46 種皂苷類化合物的日內(nèi)精密度和日間精密度分別為0.5%～4.5%、1.1%～6.6%。重復(fù)性RSD范圍為1.5%～7.3%，穩(wěn)定性RSD范圍為0.9%～5.8%，表明該測(cè)定方法具有較高的精密度和較好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

2.7 實(shí)際樣品分析

應(yīng)用本方法對(duì)市售的15 批生曬參、紅參和黑參3 種不同人參加工品進(jìn)行分析檢測(cè)，每種人參加工品5 批，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3 次（圖5）。皂苷類成分在3 類人參加工品中呈現(xiàn)明顯不同的含量分布特征，結(jié)果如表3所示。為了更直觀地區(qū)分不同加工方式的人參產(chǎn)品，以46 種人參皂苷的含量為變量，采用多元變量統(tǒng)計(jì)分析軟件SIMCA 14.1對(duì)15 份不同人參加工品進(jìn)行主成分分析（principle component analysis，PCA），見圖6。PC1和PC2的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到95.4%，可代表皂苷類成分指標(biāo)。得分圖中生曬參、紅參和黑參樣品之間相距較遠(yuǎn)，彼此之間可獲得良好區(qū)分，表明不同加工方式的人參產(chǎn)品皂苷類成分的含量差異較大。

表3 3 種人參加工產(chǎn)品中人參皂苷類化合物的含量（n=3）Table 3 Contents of ginsenosides in three processed ginseng products (n = 3)mg/kg

圖5 代表性樣品的總離子流色譜圖Fig.5 Total ion current chromatograms of representative samples

圖6 3 種人參加工產(chǎn)品的PCA得分Fig.6 PCA score plot for three processed ginseng products

生曬參是通過(guò)在陽(yáng)光下使鮮人參脫水生產(chǎn)，而紅參和黑參是通過(guò)不同的高溫循環(huán)蒸制生產(chǎn)[33-34]，這些不同的加工方法誘導(dǎo)了人參皂苷的化學(xué)變化，部分人參皂苷轉(zhuǎn)化成了稀有人參皂苷[35]。因此，加工方式的不同是導(dǎo)致人參產(chǎn)品中皂苷類成分含量差異較大的主要原因。

為了進(jìn)一步明確不同加工方式的人參差異性成分，在PCA基礎(chǔ)上，采用變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）法篩選，VIP值見圖7。以VIP值大于1為標(biāo)準(zhǔn)[36]，篩選出造成不同加工方式人參差異的17 個(gè)皂苷成分，包括20-葡萄糖人參皂苷Rf、西洋參皂苷R1、人參皂苷Re、Rg1、Rf、Rh1(S)、Ra2、Rb1、Rc、Ra1、Rb2、Rg6、Rk3、Rg3(S)、Rg3(R)、Rk1、Rg5。如圖8所示，20-葡萄糖人參皂苷Rf、人參皂苷Re、Rg1、Rf、Ra2、Rb1、Rc和Rb2在生曬參和紅參中相對(duì)含量較高，在黑參中相對(duì)含量較低，這些皂苷均為常量人參皂苷，可作為生曬參和紅參的主要成分；而人參皂苷Rh1(S)、Rg6、Rk3、Rg3(S)、Rg3(R)、Rk1、Rg5在黑參中相對(duì)含量較高，在紅參中相對(duì)含量較低，在生曬參中幾乎不含，且這些皂苷均為稀有人參皂苷，可見經(jīng)過(guò)蒸制的紅參和黑參樣品中部分原有的人參皂苷發(fā)生了轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生了稀有人參皂苷，這些差異性皂苷成分可作為區(qū)分黑參、紅參和生曬參的標(biāo)志物群。

圖7 各成分的正交偏最小二乘判別分析VIP值圖Fig.7 Orthogonal partial least squares-discriminant analysis VIP plot for 46 ginsenosides

圖8 3 種人參加工品中差異性成分含量Fig.8 Contents of differential ginsenosides in three processed ginseng products

3 結(jié) 論

本研究采用分散固相萃取凈化，建立了人參加工品中46 種皂苷類化合物的UPLC-MS/MS檢測(cè)方法。實(shí)現(xiàn)在35 min內(nèi)可同時(shí)完成46 種皂苷類化合物的快速分析和定量檢測(cè)，與已有方法相比，本方法引入了分散固相萃取技術(shù)，即降低了基質(zhì)干擾，又能減少對(duì)目標(biāo)物的損失，且簡(jiǎn)化了操作步驟，使樣品前處理更加簡(jiǎn)便高效，實(shí)用性強(qiáng)。通過(guò)儀器條件的優(yōu)化，采用MRM檢測(cè)，在很大程度上提高了皂苷類化合物的檢測(cè)通量，可有效縮短分析檢測(cè)時(shí)間，提高工作效率。通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證，證明該法具有準(zhǔn)確快速、重復(fù)性好且雜質(zhì)干擾小等特點(diǎn)。經(jīng)3 類人參加工品生曬參、紅參和黑參共15 批實(shí)際樣品的檢測(cè)分析驗(yàn)證，完全能夠滿足檢測(cè)需求，可應(yīng)用于實(shí)際人參加工品中皂苷類化合物的直接測(cè)定。