鹽度和亞硝酸鹽氮脅迫對(duì)菲律賓蛤仔“斑馬蛤2號(hào)”和莆田群體代謝的影響

周紅，谷晶，朱弦一，郭悅，楊國(guó)軍，霍忠明，王華

(大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023)

菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)隸屬于軟體動(dòng)物門(Mollusca)雙殼綱(Lamellibranchia)簾蛤目(Veneroida)簾蛤科(Veneridae)蛤仔屬(Ruditapes)，是中國(guó)主要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)貝類之一[1]。鹽度是影響菲律賓蛤仔存活和生長(zhǎng)的重要環(huán)境因子之一[2]。研究發(fā)現(xiàn)，在低鹽度海水中，菲律賓蛤仔會(huì)表現(xiàn)出明顯的應(yīng)激反應(yīng)[3]，其攝食率和清濾率均有所下降[4]，當(dāng)鹽度低于15時(shí)，菲律賓蛤仔無法維持其正常的代謝活動(dòng)[5]。鹽度驟降對(duì)菲律賓蛤仔的鰓和肝胰腺影響較明顯[6]，且高溫時(shí)海水鹽度波動(dòng)更容易引起菲律賓蛤仔滲透壓的改變[7]。

亞硝酸鹽氮是養(yǎng)殖水體中常見的污染物之一，水中較高濃度的亞硝酸鹽氮會(huì)影響水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物血液對(duì)氧氣的輸送，降低其抵抗環(huán)境脅迫的能力，從而抑制其生長(zhǎng)發(fā)育。研究表明：亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度增加會(huì)引起凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)能量代謝進(jìn)程加快[8]，急性脅迫時(shí)凡納濱對(duì)蝦死亡率隨亞硝酸鹽氮濃度的增加而升高[9]；亞硝酸鹽氮對(duì)管角螺(Hemifusustuba)稚貝的毒害作用隨pH和鹽度的降低而增大[10]；亞硝酸鹽氮脅迫也會(huì)造成菲律賓蛤仔免疫功能下降和組織再生障礙[11]，且對(duì)菲律賓蛤仔浮游幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育的影響大于幼貝[12]。然而，有關(guān)低鹽度和亞硝酸鹽氮協(xié)同作用對(duì)水生生物呼吸代謝的影響研究鮮見報(bào)道，尤其對(duì)貝類呼吸代謝的協(xié)同作用未見報(bào)道。

菲律賓蛤仔養(yǎng)殖過程中，天然降水可能導(dǎo)致養(yǎng)殖區(qū)海水鹽度下降，而含氮有機(jī)物的硝化過程受到抑制，可能會(huì)導(dǎo)致水中亞硝酸鹽氮積累，海水鹽度下降和亞硝酸鹽氮積累均會(huì)影響菲律賓蛤仔的代謝和生長(zhǎng)。但是，低鹽度和亞硝酸鹽氮協(xié)同脅迫對(duì)菲律賓蛤仔呼吸和代謝的影響尚未見報(bào)道。本研究中，選取菲律賓蛤仔“斑馬蛤2號(hào)”和莆田群體為試驗(yàn)對(duì)象，研究了低鹽度和亞硝酸鹽氮單因子脅迫及二者協(xié)同脅迫對(duì)菲律賓蛤仔呼吸代謝的影響，并觀察了協(xié)同脅迫后菲律賓蛤仔鰓絲的組織結(jié)構(gòu)變化，以期為探討外界環(huán)境脅迫對(duì)菲律賓蛤仔代謝的影響提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用菲律賓蛤仔(以下簡(jiǎn)稱“蛤仔”)“斑馬蛤2號(hào)”和莆田群體，均采自遼寧省大連市獐子島貝類育苗基地，“斑馬蛤2號(hào)”殼長(zhǎng)為(27.5±1.2)mm，莆田群體殼長(zhǎng)為(31.2±1.8)mm。正式試驗(yàn)前將蛤仔暫養(yǎng)7 d，每天全量換水一次，早晚各投喂適量小球藻藻膏(盤錦光合蟹業(yè)有限公司生產(chǎn))一次，正式試驗(yàn)開始前1 d停止投喂。

試驗(yàn)用海水取自大連市黑石礁近岸海域，經(jīng)沉淀、沙濾和紫外消毒后備用，海水鹽度為29.6±0.5，pH為8.0±0.1。試驗(yàn)在遼寧省貝類良種繁育工程技術(shù)研究中心進(jìn)行。

1.2 方法

蛤仔的耗氧率和排氨率試驗(yàn)采用密閉靜水方法，試驗(yàn)水溫為20 ℃，以鹽度30的海水為對(duì)照，調(diào)整試驗(yàn)海水鹽度分別為25、20、15，亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度分別為0、0.15、0.30、0.60 mg/L，分別進(jìn)行低鹽度、亞硝酸鹽氮單因子脅迫試驗(yàn)及二者的協(xié)同脅迫試驗(yàn)。每個(gè)試驗(yàn)用海水2 L，放入試驗(yàn)蛤仔5枚，每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行，試驗(yàn)時(shí)間為4 h。試驗(yàn)前后采用碘量法和次溴酸鹽氧化法(GB 17378.4—2007)分別測(cè)定水中溶解氧和總氨氮含量，取蛤仔體軟體部于70 ℃烘箱中干燥24 h后稱重。呼吸代謝過程中的耗氧率、排氨率和氧氮比(O∶N)計(jì)算公式分別為

RO=(CD0-CDt)×V/(m×t)。

(1)

RN=(CNt-CN0)×V/(m×t)。

(2)

RO∶N=(RO/16)/(RN/14)。

(3)

式中：RO為耗氧率[mg/(g·h)]；RN為排氨率[mg/(g·h)]；RO∶N為氧氮比；CD0和CDt分別為試驗(yàn)前和試驗(yàn)t時(shí)水中的溶解氧含量(mg/L)；CN0和CNt分別為試驗(yàn)前和試驗(yàn)t時(shí)水中的總氨氮質(zhì)量濃度(mg/L)；V為試驗(yàn)用海水體積(L)；m為菲律賓蛤仔質(zhì)量(g)；t為試驗(yàn)時(shí)間(h)。

試驗(yàn)結(jié)束后，從每個(gè)試驗(yàn)組分別取3枚蛤仔，解剖取其鰓，用多聚甲醛固定液固定24 h，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇洗滌3次，再進(jìn)行梯度脫水處理，然后透蠟、包埋、修蠟、切片(切片厚度為5 μm)、展片、脫蠟、染色(蘇木精-伊紅染色法)和脫水，用中性樹膠進(jìn)行封片，最后在顯微鏡(LEICA DM 4000B LED)下觀察并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行單因素和雙因素方差分析(ANOVA)，采用Duncan法進(jìn)行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 低鹽度對(duì)菲律賓蛤仔耗氧率和排氨率的影響

從圖1可見：在鹽度30、25、20、15范圍內(nèi)，“斑馬蛤2號(hào)”和莆田群體的耗氧率均隨鹽度的降低而升高，當(dāng)鹽度降至20、15時(shí)，兩種蛤仔的耗氧率均顯著高于對(duì)照組(鹽度30)(P<0.05)；“斑馬蛤2號(hào)”和莆田群體的排氨率均隨鹽度的降低呈先降低后升高的變化趨勢(shì)，與對(duì)照組相比，“斑馬蛤2號(hào)”的排氨率在低鹽度(25～15)時(shí)均顯著降低(P<0.05)，莆田群體的排氨率在鹽度為25、15時(shí)顯著降低(P<0.05)，在鹽度為20時(shí)又升高且顯著高于其他鹽度組(P<0.05)。

標(biāo)有不同字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)，下同。Different letter means significant difference (P<0.05)，and same letter means no significant difference (P>0.05)，et sequentia.圖1 鹽度對(duì)“斑馬蛤2號(hào)”和莆田群體耗氧率和排氨率的影響Fig.1 Effects of salinity on the oxygen consumption rate and ammonia excretion rate of “Zebra 2” and Putian population

從表1可見：“斑馬蛤2號(hào)”的O∶N值隨鹽度的降低呈先升高后降低的趨勢(shì)，在低鹽度(25～15)時(shí)，其O∶N值均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，且在鹽度20時(shí)最高；莆田群體在低鹽度(25～15)時(shí)，其O∶N值均高于對(duì)照組，僅鹽度為15時(shí)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

表1 鹽度對(duì)“斑馬蛤2號(hào)”和莆田群體O∶N值的影響

2.2 亞硝酸鹽氮對(duì)菲律賓蛤仔耗氧率和排氨率的影響

從圖2可見：在亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度為0.15～0.60 mg/L范圍內(nèi)，“斑馬蛤2號(hào)”和莆田群體的耗氧率隨亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度的增加而升高，均較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)，二者的耗氧率均在亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度為0.60 mg/L時(shí)最高，分別為(2.225±0.007)、(2.442±0.005)mg/(g·h)；“斑馬蛤2號(hào)”的排氨率呈先降低后升高的趨勢(shì)，且在亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度為0.15～0.60 mg/L時(shí)其排氨率均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度為0.15 mg/L時(shí)排氨率降至最低，為(0.052±0.006)mg/(g·h)，而莆田群體的排氨率則隨亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)，在亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度為0.30 mg/L時(shí)達(dá)到最高，為(0.077±0.003)mg/(g·h)。

圖2 亞硝酸鹽氮對(duì)“斑馬蛤2號(hào)”和莆田群體耗氧率和排氨率的影響Fig.2 Effects of nitrite nitrogen concentration on the oxygen consumption rate and ammonia excretion rate of “Zebra 2” and Putian population

從表2可見：隨亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度的增加，“斑馬蛤2號(hào)”的O∶N值呈先升高后降低的趨勢(shì)，而莆田群體O∶N值則呈升高的趨勢(shì)；在亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度為0.15～0.60 mg/L時(shí)，兩種蛤仔的O∶N值均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

表2 亞硝酸鹽氮對(duì)“斑馬蛤2號(hào)”和莆田群體O∶N值的影響

2.3 低鹽度和亞硝酸鹽氮協(xié)同對(duì)菲律賓蛤仔耗氧率和排氨率的影響

通過雙因素方差分析顯示，低鹽度和亞硝酸鹽氮協(xié)同作用對(duì)菲律賓蛤仔的耗氧率和排氨率有顯著性影響(P=0.04)。

從圖3可見，總體上，“斑馬蛤2號(hào)”和莆田群體的耗氧率在同一鹽度下均隨亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度的增加而升高，均在鹽度15和亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度0.60 mg/L協(xié)同脅迫下最高，分別為(2.458±0.033)、(2.583±0.012)mg/(g·h)，表明低鹽度和高質(zhì)量濃度亞硝酸鹽氮協(xié)同脅迫對(duì)蛤仔耗氧率的影響更顯著。從圖4可見，“斑馬蛤2號(hào)”排氨率在鹽度15和亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度0.30 mg/L協(xié)同脅迫下最高，為(0.162±0.007)mg/(g·h)，莆田群體排氨率在鹽度為15和亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度為0.60 mg/L協(xié)同脅迫時(shí)最高，為(0.161±0.007)mg/(g·h)。

標(biāo)有不同大寫字母表示“斑馬蛤2號(hào)”在同一鹽度下不同亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有不同小寫字母表示莆田群體在同一鹽度下不同亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母表示組間無顯著性差異(P>0.05)，下同。Different capital letters indicate that “Zebra 2” has significant differences among groups with different nitrite nitrogen concentrations under the same salinity (P<0.05)；different letters indicate that Putian population has significant differences among groups with different nitrite nitrogen concentrations under the same salinity (P<0.05)；and the means with the same letters are not significant differences(P>0.05)，et sequentia.圖3 低鹽度和亞硝酸鹽氮協(xié)同對(duì)菲律賓蛤仔耗氧率的影響Fig.3 Synergistic effect of low salinity and nitrite nitrogen on the oxygen consumption of Ruditapes philippinrum

圖4 低鹽度和亞硝酸鹽氮協(xié)同對(duì)菲律賓蛤仔排氨率的影響Fig.4 Synergistic effect of low salinity and nitrite nitrogen on the ammonia excretion rate of Ruditapes philippinarum

從表3可見：“斑馬蛤2號(hào)”和莆田群體的O∶N值總體上隨鹽度的降低和亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度的增加呈升高趨勢(shì)，對(duì)照組O∶N值均較低；“斑馬蛤2號(hào)”O(jiān)∶N值在鹽度為30和亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度為0.15 mg/L協(xié)同脅迫時(shí)最高，莆田群體O∶N值在鹽度為30和亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度為0.60 mg/L協(xié)同脅迫時(shí)最高。

表3 鹽度和亞硝酸鹽氮協(xié)同對(duì)菲律賓蛤仔O∶N值的影響

2.4 低鹽度和亞硝酸鹽氮協(xié)同對(duì)菲律賓蛤仔鰓組織結(jié)構(gòu)的影響

經(jīng)低鹽度和亞硝酸鹽氮協(xié)同脅迫4 h后，對(duì)蛤仔的鰓組織結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)：蛤仔對(duì)照組的鰓組織結(jié)構(gòu)完整、呼吸上皮細(xì)胞排列整齊、細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)結(jié)構(gòu)正常(圖5A)；在鹽度15和亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度為0.60 mg/L協(xié)同脅迫下，“斑馬蛤2號(hào)”的鰓絲出現(xiàn)呼吸上皮細(xì)胞脫落、鰓小片上皮細(xì)胞排列發(fā)生紊亂和鰓小片輕微腫脹(圖5B)，莆田群體鰓絲出現(xiàn)了皺縮、呼吸上皮細(xì)胞脫落和鰓間距增大(圖5C)。

A—對(duì)照組；B—“斑馬蛤2號(hào)”；C—莆田群體。A—control group；B—“Zebra 2”；C—Putian population.圖5 低鹽度(鹽度15)和亞硝酸鹽氮(0.60 mg/L)協(xié)同對(duì)菲律賓蛤仔鰓組織結(jié)構(gòu)的影響Fig.5 Synergistic effect of low salinity(salinity 15)and nitrite nitrogen(0.60 mg/L)on the gill tissue structure of Ruditapes philippinarum

3 討論

3.1 低鹽度對(duì)菲律賓蛤仔呼吸代謝的影響

鹽度對(duì)貝類的呼吸和代謝作用具有重要影響，也是決定海洋貝類生態(tài)分布的重要因子之一。河流入?？诟浇蜓匕逗Ｓ?，因降雨、蒸發(fā)和河流流量等因素會(huì)影響該區(qū)域的鹽度。鹽度變化不僅影響貝類的攝食能力，還會(huì)影響其呼吸作用。鹽度過高或過低均會(huì)使貝類關(guān)閉進(jìn)出水管，緊閉雙殼，形成組織隔離和外部環(huán)境隔離，導(dǎo)致呼吸作用和代謝過程減慢[13]。鹽度變化會(huì)影響貝類的耗氧率和排氨率，王剛等[14]研究發(fā)現(xiàn)，近江牡蠣(Crassostreahongkongensis)在低鹽度時(shí)耗氧率增加，而Navarro等[15]卻發(fā)現(xiàn)，殼菜蛤(Choromytiluschorus)的耗氧率隨鹽度的降低而降低。丁天揚(yáng)等[16]研究發(fā)現(xiàn)，文蛤(Meretrixmeretrix)的耗氧率隨鹽度的降低而升高，本研究結(jié)果與此相似，菲律賓蛤仔“斑馬蛤2號(hào)”和莆田群體的耗氧率均隨鹽度的降低而升高，這可能與菲律賓蛤仔通過消耗自身能量來調(diào)節(jié)滲透壓有關(guān)，菲律賓蛤仔生存在等滲點(diǎn)海水環(huán)境中時(shí)，用于維持自身生理活動(dòng)的能量消耗較少，反之則需要較多的能量來適應(yīng)鹽度的變化。上述研究表明，低鹽度脅迫對(duì)不同海水養(yǎng)殖動(dòng)物的呼吸代謝影響不同。

O∶N是動(dòng)物利用能源物質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)之一，代表動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)與脂肪、糖類分解代謝的比率[17]。動(dòng)物體內(nèi)當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)代謝占主導(dǎo)地位時(shí)，O∶N值通常較低。如果機(jī)體消耗的能量完全由蛋白質(zhì)提供，O∶N值約為7；當(dāng)7

3.2 亞硝酸鹽氮對(duì)菲律賓蛤仔耗氧率的影響

亞硝酸鹽氮是水產(chǎn)養(yǎng)殖中的常見污染物，在養(yǎng)殖環(huán)境中積累過量會(huì)降低養(yǎng)殖生物血液輸送氧氣的能力[21]。本研究中，菲律賓蛤仔“斑馬蛤2號(hào)”和莆田群體的耗氧率隨水中亞硝酸鹽質(zhì)量濃度的增加而升高，這可能是因?yàn)閬喯跛猁}氮對(duì)菲律賓蛤仔產(chǎn)生脅迫作用，菲律賓蛤仔需要更多的能量來響應(yīng)亞硝酸鹽氮的脅迫，導(dǎo)致菲律賓蛤仔耗氧率增加。這說明水中高濃度的亞硝酸鹽氮會(huì)對(duì)養(yǎng)殖生物的呼吸代謝造成嚴(yán)重影響。

3.3 低鹽度和亞硝酸鹽氮協(xié)同脅迫對(duì)菲律賓蛤仔呼吸代謝的影響

水環(huán)境因子變化影響貝類的呼吸代謝，亞硝酸鹽氮和鹽度是養(yǎng)殖水體中重要的環(huán)境因子，會(huì)影響生物的呼吸代謝功能。本研究中，首次進(jìn)行了低鹽度和亞硝酸鹽氮協(xié)同對(duì)貝類呼吸代謝的影響試驗(yàn)，菲律賓蛤仔“斑馬蛤2號(hào)”和莆田群體在低鹽度(鹽度15)和高亞硝酸鹽氮(質(zhì)量濃度0.60 mg/L)單因子及二者協(xié)同脅迫下均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，但其耗氧率和排氨率出現(xiàn)明顯變化，且二者協(xié)同脅迫下蛤仔的耗氧率明顯大于單因子脅迫下的耗氧率。出現(xiàn)這種情況的原因，可能是雙因子協(xié)同脅迫下，菲律賓蛤仔出現(xiàn)了更加明顯的應(yīng)激反應(yīng)，需要消耗更多的溶解氧維持自身代謝需求。此外，通過分析低鹽度和亞硝酸鹽氮協(xié)同脅迫下菲律賓蛤仔的O∶N值可以看出，菲律賓蛤仔主要由脂肪或碳水化合物提供能量，表明低鹽度和高亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度對(duì)菲律賓蛤仔呼吸代謝的影響更大。

菲律賓蛤仔的呼吸器官是鰓，在低鹽度環(huán)境中會(huì)造成菲律賓蛤仔鰓絲連接松散、褶皺無法形成、纖毛運(yùn)動(dòng)停止和呼吸濾食受阻等[6]。本研究中，在低鹽度和亞硝酸鹽氮的協(xié)同作用下，菲律賓蛤仔“斑馬蛤2號(hào)”和莆田群體出現(xiàn)了鰓絲呼吸上皮細(xì)胞脫落、鰓小片輕微腫脹、鰓小片上皮細(xì)胞排列發(fā)生紊亂和部分鰓絲出現(xiàn)皺縮等，說明低鹽度和亞硝酸鹽氮協(xié)同脅迫會(huì)對(duì)菲律賓蛤仔的呼吸器官產(chǎn)生不利影響。Galat等[22]研究發(fā)現(xiàn)，低鹽度脅迫會(huì)使鮭(Salmoclarki)鰓上皮裂解、泌氯細(xì)胞增生。Stewart Fielder等[23]研究發(fā)現(xiàn)鹽度脅迫會(huì)影響金頭鯛(Pagrusauratus)鰓絲上泌氯細(xì)胞的數(shù)目和形態(tài)變化。宮春光等[24]發(fā)現(xiàn)，亞硝酸鹽氮急性脅迫會(huì)造成斑尾復(fù)蝦虎魚(Synechogobiushasta)組織結(jié)構(gòu)損傷，使其鰓絲充血，鰓小片上皮細(xì)胞增生等。上述研究均表明，鹽度和亞硝酸鹽氮會(huì)對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的呼吸器官產(chǎn)生影響。

4 結(jié)論

1)低鹽度和亞硝酸鹽氮單因子均會(huì)對(duì)菲律賓蛤仔產(chǎn)生脅迫作用，兩者協(xié)同對(duì)菲律賓蛤仔的脅迫作用大于單因子脅迫，且低鹽度和高濃度亞硝酸鹽氮協(xié)同脅迫對(duì)菲律賓蛤仔“斑馬蛤2號(hào)”和莆田群體的耗氧率和排氨率的影響較大。

2)低鹽度和亞硝酸鹽氮協(xié)同造成菲律賓蛤仔鰓絲連接松散，說明低鹽度和亞硝酸鹽氮協(xié)同作用會(huì)對(duì)菲律賓蛤仔的呼吸器官產(chǎn)生不利影響。