產(chǎn)低溫脂肪酶菌株鑒定、發(fā)酵條件優(yōu)化及酶學性質(zhì)分析

劉思遠，申東晨，劉 崢，魯麗穎，徐 恒，董愛榮

（東北林業(yè)大學 林學院，黑龍江哈爾濱 150040）

脂肪酶（Lipase）是一類特殊的酯酶，能水解三酰甘油酯為脂肪酸、甘油二酯、單酸甘油酯及甘油[1]，廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域，如食品[2-3]，醫(yī)藥[4-5]，生活[6]，能源[7]等。脂肪酶來源廣泛，目前可以從一些油料種子[8]，動物的胰臟[9]及微生物[10]中獲取。相對于動植物所產(chǎn)生的脂肪酶，微生物產(chǎn)生的脂肪酶具有來源廣泛、生產(chǎn)周期短、產(chǎn)量高、易提取、對外界環(huán)境要求低等特點，更易工業(yè)化生產(chǎn)。

近些年國內(nèi)外關(guān)于產(chǎn)脂肪酶菌株發(fā)酵條件優(yōu)化的研究報道層出不窮，如Behera 等[11]通過CCD 實驗設(shè)計，得到了葡萄球菌（Staphylococcus）產(chǎn)脂肪酶的最佳的pH 值、溫度和攪拌速度，優(yōu)化后的最大酶活為1.82 U/mL，柳萌等[12]通過單因素實驗對灰霉菌（Botrytis cinerea）的培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件進行優(yōu)化，篩選出其產(chǎn)胞外脂肪酶的最優(yōu)發(fā)酵條件。Salgado 等[13]從橄欖磨廢水中分離出產(chǎn)孢外脂肪酶的菌株Magnusiomyces capitatus，并通過氧氣利用率和氮濃度雙因素的正交試驗實現(xiàn)了脂肪酶產(chǎn)量的優(yōu)化，并在培養(yǎng)基中添加了一定濃度的橄欖油，來提高脂肪酶的產(chǎn)量，最高可達3.96 U/mL。林仙菊等[14]從海鰻腸道內(nèi)容物中篩選到洋蔥伯克霍爾德菌（Burkholderia cepacia），采用單因素實驗和均勻?qū)嶒炘O(shè)計進行發(fā)酵條件優(yōu)化，優(yōu)化后的脂肪酶活力較之前提高了4.7 倍。劉元利等[15]通過優(yōu)化碳源、氮源、溫度、鹽度等條件，優(yōu)化后產(chǎn)脂肪酶可達1326 U/mL。但大多數(shù)研究集中在中高溫脂肪酶方面，對于低溫脂肪酶的研究較少[16]，普通脂肪酶的適合反應(yīng)溫度通常在30～50 ℃，但低溫脂肪酶的最適反應(yīng)溫度為40 ℃以下[17]，且其最大特點是在0 ℃下依舊具有一定的活性。

隨著各個領(lǐng)域?qū)χ久傅男枨笕找嬖黾?，開發(fā)低溫脂肪酶，探尋最優(yōu)發(fā)酵條件及工業(yè)化生產(chǎn)顯得尤為重要。本研究擬從漠河土壤中分離出一株產(chǎn)低溫脂肪酶活性較高的菌株，通過形態(tài)學及分子生物學鑒定，確定其分類地位，通過單因素實驗，Plackett-Burman實驗，爬坡試驗及響應(yīng)曲面設(shè)計，探究溫度、pH、裝液量、接種量、碳源、氮源、金屬離子、誘導(dǎo)劑對脂肪酶酶活的影響，從而篩選出最優(yōu)發(fā)酵條件，以達到高產(chǎn)優(yōu)勢菌株的目的。并對該菌株產(chǎn)的脂肪酶進行初步純化，探究其酶學性質(zhì)。對開發(fā)低溫脂肪酶及工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

土壤樣品 采樣地點位于黑龍江省漠河縣洛古河村的林下土壤（53°21'21" N，121°37’15" E），觀音山林下土壤（53°25'2" N，122°15’36" E）以及北極村林下土壤（53°25'2"N，122°15’36" E），在每個樣地分別隨機設(shè)置三個采樣點，采樣前除去地表枯落物，采集距地表5 cm 左右的土壤，每份50 g 置于密封袋中，編號記錄并于保溫箱中保存，于實驗室進行后續(xù)處理；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL，pH7.4～7.6；脂肪酶篩選培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉5 g，氯化鈣0.1 g，Tween-80 10 mL，蒸餾水1000 mL，瓊脂15 g；LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1000 mL，pH7.4，固體LB 培養(yǎng)基再加入15 g 瓊脂；液體發(fā)酵培養(yǎng)基：麥芽糖5 g，蛋白胨10 g，七水硫酸鎂0.5 g，橄欖油20 mL，蒸餾水1000 mL；DNA 試劑盒 上海生工生物工程有限公司；脂肪酶（LPS）活性檢測試劑盒 蘇州格銳思生物科技有限公司；牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、瓊脂、酵母提取物、氯化鈉、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、七水硫酸鎂、硫酸亞鐵等 分析純，哈爾濱兆奎致遠生物科技有限公司。

SE402F 型電子天平 奧豪斯儀器有限公司；DL-CJ-2NDI 型超凈工作臺 哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；T-100 型PCR 儀 BioRad；HC-3016R型低溫超速冷凍離心機 安徽中科中佳儀器有限公司；SuPerMax 3100 型酶標儀 上海閃普生物科技有限公司；ZQZY-B8 型恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細菌菌株的分離與純化 菌株分離采用平板稀釋法[18]，將5 g 土樣與45 mL無菌水混合后加入玻璃珠，160 r/min 振蕩30 min，制成濃度為10-1的菌懸液。之后用無菌水分別稀釋成濃度梯度為10-2、10-3、10-4、10-5的菌懸液。分別取150 μL 各濃度梯度菌懸液至牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，涂布均勻，標記后在恒溫培養(yǎng)箱中16 ℃培養(yǎng)。3 d 后，用接種環(huán)分別挑取不同的細菌菌落，采用劃線法接種至細菌選擇培養(yǎng)基上，以獲得純化的細菌菌落，16 ℃培養(yǎng)3 d，進行后續(xù)試驗。

1.2.2 產(chǎn)脂肪酶菌株的初篩與復(fù)篩 將上述分離純化得到的細菌菌株接種于LB 培養(yǎng)基上活化，活化后點接于脂肪酶篩選培養(yǎng)基上，16 ℃培養(yǎng)。根據(jù)脂肪酶能夠分解吐溫80 且產(chǎn)物能夠與Ca2+結(jié)合而在菌落周圍形成白色沉淀圈[19]，初篩出能產(chǎn)脂肪酶的菌株。將初篩得到的細菌菌株以1%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，16 ℃，160 r/min 條件下培養(yǎng)32 h，取發(fā)酵液，在12000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液為粗酶液，進行酶活力測定。篩選出活性最高的菌株進行后續(xù)實驗。

1.2.3 脂肪酶活性的測定 依據(jù)蘇州格銳思脂肪酶（LPS）活性試劑盒進行脂肪酶活性測定（對硝基苯酚法[20]），具體操作詳見說明書。

1.2.4 菌株的鑒定及生理生化特性 形態(tài)學鑒定：觀察產(chǎn)酶菌落形狀、顏色、表面、邊緣、隆起情況，并對菌株進行革蘭氏染色以及相應(yīng)的生理生化實驗如VP 實驗、甲基紅（MR）實驗、明膠水解實驗、產(chǎn)H2S實驗等[21]。

分子生物學鑒定：采用16S rDNA 通用引物27F和1492R 進行PCR 擴增，將PCR 產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進行測序，將測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進行BLAST 比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 產(chǎn)脂肪酶菌株發(fā)酵條件優(yōu)化

1.2.5.1 單因素實驗 以酶活為指標進行單因素實驗測定，以液體發(fā)酵培養(yǎng)基，溫度16 ℃，2%接種量，pH 為7，裝液量30 mL 為基礎(chǔ)。分別研究溫度、pH、裝液量、接種量、碳源、氮源、金屬離子、誘導(dǎo)劑對脂肪酶酶活的影響。分別選取溫度：10、15、20、25、30、35 ℃；pH：6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5；裝液量10、20、30、40、50 mL 的培養(yǎng)基倒入50 mL 錐形瓶；接種量0.5%、1%、2%、3%、4%、5%；碳源：葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉，確定最佳碳源后，配制添加量分別為0、5、10、15、20 g/L；氮源：蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、酵母粉，確定最佳氮源后，配制添加量分別為0、5、10、15、20 g/L；金屬離子：Mg2+、Mn2+、Cu2+、Fe2+的硫酸鹽，確定最佳金屬離子后，配制添加量分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g/L 的發(fā)酵培養(yǎng)基；誘導(dǎo)劑：不添加誘導(dǎo)劑和分別添加橄欖油、葵花籽油、亞麻籽油。確定最佳誘導(dǎo)劑后，配制添加量分別為10、20、30、40、50 mL/L。

1.2.5.2 Plackett-Burman 試驗 對八個單因素（溫度、pH、裝液量、接種量、碳源、氮源、金屬離子、誘導(dǎo)劑）進行Plackett-Burman 設(shè)計，每個因素取高低兩個水平，如表1。

表1 Plackett-Burman 試驗設(shè)計Table 1 Plackett-Burman experimental design

1.2.5.3 爬坡試驗 根據(jù)上述單因素實驗確定的單因素正負效應(yīng)，在PB 試驗的基礎(chǔ)上，依據(jù)顯著性分析結(jié)果確定3 個顯著因素的最陡爬坡。

1.2.5.4 響應(yīng)曲面試驗優(yōu)化 對PB 試驗結(jié)果進行顯著性分析，選取顯著性最高的三個因素（蛋白胨、裝液量、橄欖油），以脂肪酶為響應(yīng)值，設(shè)計Box-Behnken 試驗，如表2 所示，得出菌株產(chǎn)脂肪酶的最優(yōu)發(fā)酵條件。

表2 Box-Behnken 試驗因素水平Table 2 Box-Behnken experimental factor level

1.2.6 脂肪酶的純化 以實驗所得最優(yōu)發(fā)酵條件進行菌株發(fā)酵，將發(fā)酵液離心取上清得到粗酶液。在冰水浴及磁力攪拌條件下緩慢加入研磨好的硫酸銨粉末，按飽和度（10%～90%）依次添加，靜止1 h 后冷凍離心，得到第一個分級沉淀，以相同的方式吸取上清液加入硫酸銨，得到多個分級沉淀，將沉淀收集。沉淀置于pH7.5 的磷酸緩沖液中溶解，利用透析袋脫鹽至濾液中加入BaCl2沒有沉淀析出為止。所得沉淀進行后續(xù)酶學性質(zhì)研究。

1.2.7 酶學性質(zhì)分析

1.2.7.1 溫度對酶活的影響及酶的熱穩(wěn)定性 在磷酸緩沖液中加入純化后酶液，在不同溫度下（0、4、15、20、25、30、35、40 ℃）置于水浴鍋中保溫15 min，測定各溫度下的酶活；同時在不同溫度下（20、30、40、50、60 ℃）保存1 h，每10 min 測定酶活。

1.2.7.2 pH 對酶活的影響及酶對pH 的耐受性 配制濃度為50 mmol/L 的不同pH 緩沖液：檸檬酸緩沖液（pH3.0～5.0）、磷酸鹽緩沖液（pH6.0～8.0）、Tris-HCl 緩沖液（pH9.0）、碳酸鈉緩沖液（pH10.0～11.0），在緩沖液中加入純化后的酶液，30 min 后測定各pH 下的酶活；同時將酶液與各緩沖液按1:3 的比例混合后，在最適溫度下保溫4 h，每30 min 測定酶活。

1.2.7.3 金屬離子對酶活的影響 配制濃度10 mmol/L的含Mg2+、Ca2+、Cu2+、Fe2+、Zn2+、Mn2+的磷酸鹽緩沖液，在緩沖液中加入純化后的酶液，以不添加金屬離子為對照，測定酶活。

1.2.7.4 有機溶劑對酶活的影響 在酶活測定體系中分別加入甲醇、乙醇、異丙醇、乙酸乙酯、正己烷、三氯乙烷等有機溶劑[22]，有機溶劑體積分數(shù)為10%，對照組為不添加有機溶劑，最適溫度處理1 h，測定酶活。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)均平行測定3 次，采用Microsoft Excel 2017 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，采用SPSS.25 進行單因素方差分析及顯著性分析，采用Design-expert 8.0 進行Plackett-Burman 和Box-Behnken 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計及分析驗證，使用Origin 2021 進行圖像繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)脂肪酶菌株的初篩和復(fù)篩

經(jīng)過初篩，有5 株菌株（X1、X2、X4、X16、X21）能夠在篩選培養(yǎng)基上產(chǎn)生白色沉淀圈，表明這5 株菌株均能產(chǎn)生脂肪酶。對初篩結(jié)果中的5 株菌株進行復(fù)篩，提取粗酶液，通過測定酶活大小（圖1），菌株X16 酶活最高，為8.47 U/mL，因此選取X16 進行后續(xù)實驗。

圖1 5 株產(chǎn)低溫脂肪酶菌株活力Fig.1 5 strains producing cold-active lipase

2.2 菌株鑒定結(jié)果

2.2.1 菌株形態(tài)學鑒定 由圖2A 可以看出菌株X16 在篩選培養(yǎng)基上產(chǎn)生的白色沉淀圈，由圖2B 可知，X16 菌株呈粉紅色，邊緣光滑整齊，表面呈凸起狀，表面濕潤。

圖2 菌株形態(tài)學圖片F(xiàn)ig.2 Morphological pictures of the strains

2.2.2 菌株生理生化特性 菌株X16 生理生化結(jié)果顯示（表3），該菌株為革蘭氏陰性菌，可分解葡萄糖、蔗糖、麥芽糖，不產(chǎn)氣，VP 實驗為陽性，MR 實驗陰性，可產(chǎn)生蛋白酶與脂肪酶。

表3 菌株X16 生理生化鑒定Table 3 Physiological and biochemical identification of strain X16

2.2.3 菌株分子生物學鑒定 將測序結(jié)果在NCBI上進行BLAST 同源性比對，通過形態(tài)學與分子生物學鑒定，并結(jié)合《伯杰氏細菌鑒定手冊》，使用MEGA11構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），比較不同菌株間的同源性，確定菌株X16 為普城沙雷氏菌（Serratia plumuthica）。

圖3 菌株X16 及其相似序列的進化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree analysis of strain X16 and its similar sequences

2.3 產(chǎn)低溫脂肪酶菌株發(fā)酵條件優(yōu)化

在10～20 ℃之間，菌株X16 的酶活逐漸增加，在20 ℃時，酶活達到最大值，為9.66 U/mL，隨著溫度逐漸上升，酶的活性呈現(xiàn)下降的趨勢（圖4A）。隨著pH 從6 升至7.5 時，酶活逐漸增大，在pH 7.5 時達到最大值，為18.35 U/mL，當pH 大于7.5 后，酶活逐漸下降（圖4B）。當裝液量為20 mL/50 mL 時，酶活最大為14.25 U/mL，隨著裝液量逐漸增加，酶活呈下降趨勢（圖4C）。當接種量為0.5%時，酶活最大為12.43 U/mL，當接種量大于0.5%時，酶活逐漸降低（圖4D）。

圖4 菌株發(fā)酵條件優(yōu)化Fig.4 Optimization of fermentation conditions of strains

探究不同碳源對菌株X16 產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖5A 所示，當以麥芽糖為單一碳源時，酶活最高，其次為蔗糖，無碳源，葡萄糖，淀粉。同時麥芽糖的添加量對酶活也有顯著影響，當麥芽糖濃度為20 g/L 時酶活最高。如圖5B，當分別添加胰蛋白胨，牛肉膏，酵母粉為氮源時，菌株酶活很低，以蛋白胨為唯一氮源時酶活最高。蛋白胨濃度對菌株酶活影響如圖表明，當?shù)鞍纂藵舛葹?5 g/L 時，菌株酶活最高。金屬離子同樣會對菌株的產(chǎn)酶情況存在影響，由圖5C 所示，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同成分的金屬離子均對菌株的酶活存在促進效應(yīng)，當Mg2+為唯一金屬離子時，菌株酶活最高。當Mg2+濃度達到0.5 g/L 時，此時菌株酶活達到最高值。誘導(dǎo)劑的添加會促進酶活的提高，如圖5D 所示，當添加橄欖油和亞麻籽油時，菌株酶活顯著提高，當添加橄欖油時，菌株的酶活有最大值，當誘導(dǎo)劑為葵花籽油時，菌株酶活并沒有明顯上升。進一步探究橄欖油濃度對酶活的影響時，發(fā)現(xiàn)當橄欖油濃度為40 mL/L 時，菌株酶活達到最大。

圖5 菌株培養(yǎng)基優(yōu)化Fig.5 Optimization of strain culture medium

2.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

2.4.1 Plackett-Burman 試驗設(shè)計 采用 Plackett-Burman 試驗設(shè)計進行脂肪酶活性測定，試驗設(shè)計及結(jié)果見表4，各試驗因素顯著性分析見表5。

表4 Plackett-Burman 試驗設(shè)計及結(jié)果Table 4 Plackett-Burman experimental design and results

表5 Plackett-Burman 試驗各因素顯著性分析Table 5 Significance analysis of each factor in Plackett-Burman

各因素P值由表可知，該線性回歸模型顯著。在發(fā)酵條件優(yōu)化實驗中，各個因素對產(chǎn)酶影響的重要性排序為：橄欖油>裝液量>蛋白胨>接種量>溫度>鎂離子>pH>麥芽糖，其中裝液量，蛋白胨添加量，橄欖油添加量三者P值均小于0.05，表明3 個因素對菌株產(chǎn)脂肪酶有顯著影響，因此選擇這3 個因素進行后續(xù)爬坡實驗。

2.4.2 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果 根據(jù)上述PB 試驗確定的單因素正負效應(yīng)，確定爬坡試驗設(shè)計。由表6 可知，第4 組酶活最高，選定第4 組為中心點進行響應(yīng)曲面優(yōu)化。

表6 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果Table 6 Experimental design and results of steepest climbing

2.4.3 響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果 以裝液量、蛋白胨、橄欖油為響應(yīng)面設(shè)計的三個因素，以脂肪酶活力為響應(yīng)值，通過三因素三水平的Box-Behnken 試驗設(shè)計和響應(yīng)面分析方法，探究菌株的最優(yōu)發(fā)酵條件，設(shè)計及結(jié)果如表7 所示。

表7 響應(yīng)面設(shè)計方案及結(jié)果Table 7 Response surface design scheme and results

如表8 所示，響應(yīng)曲面整體模型十分顯著，但是失擬項并不顯著，說明該模型可以真實反應(yīng)裝液量、蛋白胨、橄欖油與脂肪酶酶活之間的關(guān)系，可以用該模型進行分析與最優(yōu)值預(yù)測。響應(yīng)曲面結(jié)果如圖6所示，酶活隨著裝液量、蛋白胨、橄欖油的變化先上升后下降，其中裝液量和橄欖油的交互作用極為顯著，但是蛋白胨與橄欖油的交互作用不顯著。通過響應(yīng)器優(yōu)化得到的優(yōu)化結(jié)果為裝液量42.17 mL，蛋白胨13.95 g/L，橄欖油45.60 mL/L，優(yōu)化后的脂肪酶酶活預(yù)測值為98.79 U/mL?？紤]到實際操作的便捷性，將裝液量調(diào)整為42 mL，蛋白胨調(diào)整為14 g/L，橄欖油為46 mL/L，其余因素為溫度20℃，pH7.5，接種量0.5%，20g/L 麥芽糖及0.5g/L MgSO4·7H2O，經(jīng)過驗證得到脂肪酶平均酶活為98.05 U/mL，與預(yù)測值擬合性較好。

圖6 各因素交互作用對菌株產(chǎn)酶影響Fig.6 Response surface plots showing the interactive effects on lipase production

表8 響應(yīng)面設(shè)計方差及結(jié)果Table 8 Response surface design variance and results

2.5 硫酸銨沉淀結(jié)果

硫酸銨沉淀法對酶活損傷小，且沉淀能長時間保存，不同飽和度硫酸銨對酶脂肪酶純化效果存在差異，沉淀結(jié)果如表9 所示，當硫酸銨飽和度為50%～80%時，酶活性較高，其中飽和度為70 時酶活性最高，為93.18 U/mL，飽和度低于40%時，純化效果降低。

表9 硫酸銨沉淀結(jié)果Table 9 Results of ammonium sulfate precipitation

2.6 低溫脂肪酶酶學性質(zhì)

2.6.1 酶最適反應(yīng)溫度及溫度對酶穩(wěn)定性的影響取純化后的酶液，在0～40 ℃條件下分別進行酶活測定。結(jié)果如圖7A 所示，菌株所產(chǎn)的脂肪酶活性在30 ℃達到最高，且在0 ℃時仍有30%的相對活性，證明該酶屬于低溫脂肪酶。將酶液在不同溫度下保存一定時間后，酶的活性如圖7B 所示，該脂肪酶在30 ℃條件下相對酶活性最好，且熱穩(wěn)定性較好，處理60 min 后仍有80%以上的相對活性。60 ℃時熱穩(wěn)定性最差，60 ℃下處理10 min 酶活就損失了60%。

圖7 不同處理對酶的影響Fig.7 Effect of different treatments on enzyme

2.6.2 酶最適反應(yīng)pH 及其酸堿穩(wěn)定性 30 ℃下，將純化后的酶液置于不同pH 反應(yīng)體系中，分別測定酶活。pH 為7～8 時相對酶活達到了80%以上，最適反應(yīng)pH 為7（圖7C）。將酶液在不同pH 的緩沖液中處理3 h，每隔30 min 測定酶活，結(jié)果顯示該脂肪酶在pH 為7 和8 時的穩(wěn)定性最好，過酸或者過堿對酶的穩(wěn)定性影響很大，pH 為3 時處理240 min 酶活幾乎完全喪失（圖7D）。

2.6.3 金屬離子對酶活的影響 配制濃度為10 mmol/L的含有Mg2+、Ca2+、Cu2+、Fe2+、Zn2+、Mn2+的磷酸鹽緩沖液，在緩沖液中加入純化后的酶液，以不添加金屬離子為對照。結(jié)果如圖8A，不同的金屬離子均對酶活有促進作用，其中Mg2+對酶活的促進作用最為顯著，相對酶活性達到了224%。

圖8 不同添加物質(zhì)對酶活的影響Fig.8 Effect of different added substances on enzyme activity

2.6.4 有機溶劑對酶活的影響 不同的有機溶劑也會對酶活產(chǎn)生影響。由圖8B 可見，異丙醇，乙酸乙酯，三氯乙烷對酶活影響并不顯著，但正己烷對酶活有明顯的促進作用，經(jīng)正己烷處理后相對酶活達到了142%，甲醇與乙醇對該酶有一定的抑制作用。

3 討論

脂肪酶在生產(chǎn)生活等多個領(lǐng)域中均起到重要的作用，近年來對脂肪酶的需求日益增加，微生物因其速生，種類繁多，易工業(yè)化等優(yōu)點，已成為工業(yè)生產(chǎn)脂肪酶的重要來源。目前，細菌脂肪酶主要源自沙雷氏菌屬，假單胞菌屬（Pseudomonas），芽胞桿菌屬（Bacillus），耶爾森菌屬（Yersinia），紅酵母屬（Rhodotorula）等[23-29]，而本文篩選的普城沙雷氏菌為沙雷氏菌屬，與劉元利[15]，李長春等[25]的研究有一定相似之處。

本研究利用Plackett-Burman 實驗，爬坡試驗及響應(yīng)曲面設(shè)計對普城沙雷氏菌產(chǎn)脂肪酶進行發(fā)酵條件優(yōu)化，最終得到的酶活為98.05 U/mL。相比于程爽等[30]從油污污染土壤中篩選出的產(chǎn)脂肪酶粗酶活為2.39 U/mL 的沙雷氏菌屬，劉延波等[31]從酒曲篩選出產(chǎn)脂肪酶活為15.09 U/mL 的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），本實驗篩選的菌株有一定的產(chǎn)酶優(yōu)勢。但對比劉元利[15]從青海污染原油篩選出產(chǎn)低溫脂肪酶酶活1326 U/mL 的沙雷氏菌LHY-1，吳子君[32]從發(fā)酵芝麻餅中篩選得到產(chǎn)脂肪酶活262.81 U/mL 的銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和Neihaya 等[33]從土壤分離的產(chǎn)脂肪酶活122 U/mL 的粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）有一定不足。

酶學性質(zhì)研究表示，該脂肪酶在0 ℃時仍有活性，且最適反應(yīng)溫度為30 ℃，屬于低溫脂肪酶，該最適溫度與史程風[34]的研究結(jié)果一致。在pH 穩(wěn)定性方面，該酶在較寬的pH 范圍內(nèi)（7～9）均比較穩(wěn)定。同樣，腐生鏈霉菌（S.saprophyticus）的脂肪酶在pH 6～9 范圍內(nèi)表現(xiàn)出穩(wěn)定性，低于或高于這一范圍均嚴重失活[35]。本研究表明Mg2+可顯著提高脂肪酶活性，因其可參與底物活化和酶的靜電穩(wěn)定，對脂肪酶有較強的刺激作用[36]。該酶在正己烷處理下活性顯著提高，同樣溶酪鏈霉菌EX-17 的胞外脂肪酶在正己烷存在下活性提高了1.5 倍[37]，與本實驗結(jié)果有良好的一致性。

4 結(jié)論

經(jīng)過形態(tài)學、生理生化實驗及分子生物學鑒定，確定本實驗篩選菌株為普城沙雷氏菌。該菌株產(chǎn)脂肪酶的最優(yōu)發(fā)酵條件為20 ℃、pH7.5、裝液量42 mL、接種量0.5%、20 g/L 麥芽糖，14 g/L 蛋白胨、0.5 g/L的MgSO4·7H2O 及46 mL/L 橄欖油。在此優(yōu)化條件下，脂肪酶活為98.05 U/mL，是優(yōu)化前的5.85倍。酶學性質(zhì)顯示該脂肪酶最適溫度為30 ℃，屬于低溫脂肪酶，最適反應(yīng)pH 為7，Mg2+明顯可以促進酶活，甲醇和乙醇明顯抑制酶活性，而正己烷明顯促進酶活性。本研究篩選菌株酶活雖高于部分報道，但是其工業(yè)生產(chǎn)有待擴大研究，本實驗后續(xù)可從鹽度、搖床轉(zhuǎn)速、高產(chǎn)脂肪酶基因等方面進一步優(yōu)化脂肪酶活性及產(chǎn)量。該研究結(jié)果可以為微生物資源開發(fā)利用，工業(yè)生產(chǎn)低溫脂肪酶提供一定的理論依據(jù)及方法指導(dǎo)。