麻黃細(xì)辛附子湯對(duì)塵螨變應(yīng)原Der p1誘導(dǎo)的鼻黏膜上皮細(xì)胞屏障損傷的影響

倪鈺瑩，范淑月，崔穎，高婧，羅再奕，劉敏

北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029

變應(yīng)性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是由IgE介導(dǎo)、Th2細(xì)胞驅(qū)動(dòng)、針對(duì)吸入性變應(yīng)原反應(yīng)引起的鼻黏膜炎癥性疾病[1]。誘發(fā)AR的因素主要有塵螨、花粉、霉菌等[2]。鼻黏膜上皮細(xì)胞是抵御病原體入侵和過(guò)敏原滲透的第一道生理屏障。緊密連接位于上皮細(xì)胞頂端，參與細(xì)胞旁運(yùn)輸?shù)恼{(diào)節(jié)，對(duì)維持上皮屏障功能具有關(guān)鍵作用[3]。上皮屏障受損可以促進(jìn)上皮細(xì)胞的旁轉(zhuǎn)運(yùn)，增加變應(yīng)原滲入，誘導(dǎo)IgE產(chǎn)生，觸發(fā)肥大細(xì)胞脫顆粒，從而導(dǎo)致AR發(fā)生發(fā)展[4]。RhoA/ROCK信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能，如細(xì)胞收縮、黏附、遷移等[5]。RhoA/ROCK通路激活可以誘導(dǎo)細(xì)胞周圍F-肌動(dòng)蛋白（F-actin）細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)重組和收縮，改變緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能，增加細(xì)胞旁通透性[6]。因此，保護(hù)上皮細(xì)胞屏障功能以減少變應(yīng)原滲入可能是防治AR的重要策略。

AR屬中醫(yī)學(xué)“鼻鼽”“鼽嚏”等范疇，病機(jī)多為肺經(jīng)感寒、腎陽(yáng)虛衰。麻黃細(xì)辛附子湯出自《傷寒論》，由麻黃、細(xì)辛、附子組成，有散寒通竅、溫陽(yáng)固表之效，對(duì)防治AR效果顯著[7-8]。麻黃輕揚(yáng)發(fā)散，善宣肺氣、開(kāi)腠理、透毛竅，是治療AR常用藥。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，麻黃細(xì)辛附子湯在AR適應(yīng)性免疫方面，可以調(diào)控T細(xì)胞細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，逆轉(zhuǎn)Th2偏移，恢復(fù)Th1/Th2動(dòng)態(tài)平衡[9-10]；在固有免疫方面，可以下調(diào)樹(shù)突狀細(xì)胞抗原提呈能力[11-12]，抑制2型固有淋巴細(xì)胞功能發(fā)揮[13]。此外，在麻黃細(xì)辛附子湯及其拆方干預(yù)T細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)，麻黃單用也具有顯著免疫調(diào)節(jié)作用[9]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)塵螨變應(yīng)原Der p1誘導(dǎo)鼻黏膜上皮細(xì)胞屏障損傷，進(jìn)一步探討麻黃細(xì)辛附子湯及麻黃的屏障保護(hù)作用及其潛在機(jī)制，為臨床治療AR提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞

人鼻黏膜上皮細(xì)胞（HNEpC）由北納生物提供，貨號(hào)356247。

1.2 藥物及制備

麻黃細(xì)辛附子湯由麻黃、細(xì)辛、附子按6∶3∶9比例組成，飲片購(gòu)于北京仟草中藥飲片有限公司。常規(guī)方法煎煮，濃縮，制成1 g/mL水煎液，4 ℃、12 000×g離心30 min，收集上清液，0.22 μm濾器過(guò)濾后置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩７Q取適量麻黃，同法制成1 g/mL麻黃水煎液，離心，過(guò)濾后于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑與儀器

MEM培養(yǎng)基（上海逍鵬生物公司，貨號(hào)C3050），胎牛血清（美國(guó)HyClone公司，貨號(hào)SH30406.05），不含酚紅MEM培養(yǎng)基（武漢普諾賽公司，貨號(hào)PM150418），塵螨變應(yīng)原Der p1（美國(guó)Greer Lab，貨號(hào)XPB91D3A2.5），ROCK抑制劑Y-27632（美國(guó)Selleck公司，貨號(hào)S1049），F(xiàn)ITC-Dextran（上海源葉生物，貨號(hào)S28503），CCK-8試劑盒（北京蘭博利德公司，貨號(hào)CK001），BCA蛋白定量試劑盒（江蘇凱基生物，貨號(hào)KGP902），咬合蛋白（Occludin）、閉合蛋白1（Claudin-1）抗體（北京博奧森生物公司，貨號(hào)bs-10011R、bsm-52037M），RhoA、ROCK1抗體（武漢三鷹生物，貨號(hào)10749-1-AP、21850-1-AP），抗熒光衰減封片劑（北京索萊寶，貨號(hào)S2110）。二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司，型號(hào)3111），Millicell電阻測(cè)量?jī)x（美國(guó)Millipore公司，型號(hào)ESR-2），酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司，型號(hào)Varioskan LUX），熒光顯微鏡（美國(guó)Echo公司，型號(hào)Revolve），化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海天能公司，型號(hào)5200）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模濃度及時(shí)間篩選

HNEpC以MEM完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%雙抗），置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于Transwell板，將細(xì)胞分為對(duì)照組和Der p1組，待細(xì)胞融合至單層后，PBS清洗2遍，換不含血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)12 h，對(duì)照組正常培養(yǎng)，Der p1組加入終濃度為1、5、10 μg/mL Der p1（基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制）培養(yǎng)1、6、12、24 h，檢測(cè)細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)化跨膜電阻（TER）及FITCDextran通透性，確定造模濃度及造模時(shí)間。

2.2 CCK-8法篩選最佳干預(yù)濃度

將HNEpC以5×104個(gè)/孔接種于96孔板中，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h?？瞻捉M只加培養(yǎng)基不含細(xì)胞，對(duì)照組加入培養(yǎng)基正常培養(yǎng)，麻黃細(xì)辛附子湯組和麻黃組分別加入0.5、1、2、5、10 mg/mL麻黃細(xì)辛附子湯或麻黃水煎液（基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制）培養(yǎng)24 h。每孔加入CCK-8溶液10 μL，培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育30 min，酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定各孔吸光度（A），計(jì)算細(xì)胞存活率。存活率（%）=（A給藥組-A空白組）÷（A對(duì)照組-A空白組）×100%。

2.3 細(xì)胞分組及處理

將細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組、麻黃組、抑制劑組和麻黃細(xì)辛附子湯低、中、高劑量組，每組3個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組正常培養(yǎng)，其余各組加入10 μg/mL Der p1造模，麻黃組同時(shí)加入0.5 mg/mL麻黃水煎液，抑制劑組造模前加入10 μmol/L Y-27632預(yù)處理4 h，麻黃細(xì)辛附子湯低、中、高劑量組造模同時(shí)加入0.5、1、2 mg/mL麻黃細(xì)辛附子湯水煎液，分別置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

2.4 細(xì)胞跨膜電阻測(cè)定

HNEpC以1.5×105個(gè)/孔接種于12孔Transwell上室，每孔500 μL，下室加入1 mL完全培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合成單層后，饑餓培養(yǎng)12 h，再按“2.3”項(xiàng)下方法處理，另設(shè)2個(gè)空白孔（只含培養(yǎng)基、不含細(xì)胞）。干預(yù)結(jié)束后，細(xì)胞電阻儀檢測(cè)電阻值，計(jì)算TER。TER=（測(cè)定電阻值-空白電阻值）×有效濾膜面積（1.12 cm2）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以標(biāo)準(zhǔn)化TER（實(shí)驗(yàn)組TER÷對(duì)照組TER×100%）表示。

2.5 FITC-Dextran通透性測(cè)定

HNEpC以5×104個(gè)/孔接種于24孔Transwell上室，每孔200 μL，下室加入500 μL完全培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合成單層后，饑餓培養(yǎng)12 h，再按“2.3”項(xiàng)下方法處理，上室加入200 μL 0.5 mg/mL FITC-Dextran（不含酚紅MEM培養(yǎng)基配制），下室加入500 μL不含酚紅MEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h。分別從每孔上、下室取100 μL液體加入黑色96孔板內(nèi)，酶標(biāo)儀激發(fā)波長(zhǎng)495 nm、發(fā)射波長(zhǎng)520 nm檢測(cè)熒光值，計(jì)算FITCDextran通透性[14]（實(shí)驗(yàn)組熒光值÷對(duì)照組熒光值×100%）。

2.6 Western blot檢測(cè)

HNEpC以1×106個(gè)/孔接種于6孔板，待細(xì)胞融合成單層后，饑餓培養(yǎng)12 h，再按“2.3”項(xiàng)下方法處理。PBS清洗2次，每孔加入150 μL裂解液，冰上裂解5 min，14 000×g離心10 min，收集上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度。上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加Occludin（1∶2 000）、Claudin-1（1∶1 000）、RhoA（1∶1 000）、ROCK1（1∶2 000）、β-actin（1∶5 000）一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，加二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h，洗膜，ECL顯影液顯影，Image J軟件分析目的蛋白灰度值。

2.7 免疫熒光檢測(cè)F-actin表達(dá)

HNEpC以2×105個(gè)/孔接種于24孔板，待細(xì)胞融合成單層后，饑餓培養(yǎng)12 h，再按“2.3”項(xiàng)下方法處理。PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定10 min，0.5%Triton X-100通透10 min，每孔加入300 μL羅丹明標(biāo)記鬼筆環(huán)肽，室溫避光孵育30 min，滴加抗熒光衰減封片劑，熒光顯微鏡下觀察并拍照，Image J軟件分析F-actin熒光強(qiáng)度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 造模條件確定

與對(duì)照組比較，5、10 μg/mL Der p1處理HNEpC 6、12、24 h后標(biāo)準(zhǔn)化TER顯著降低，以10 μg/mL Der p1處理24 h標(biāo)準(zhǔn)化TER降低最顯著（P＜0.01）。見(jiàn)表1。與對(duì)照組比較，5、10 μg/mL Der p1處理HNEpC 24 h后FITC-Dextran通透性顯著增加，以10 μg/mL Der p1增加最顯著（P＜0.01），見(jiàn)表2。綜合TER及FITC-Dextran通透性結(jié)果，后續(xù)選用10 μg/mL Der p1處理24 h作為造模條件。

表1 不同濃度Der p1處理不同時(shí)點(diǎn)的HNEpC標(biāo)準(zhǔn)化TER比較（，%，n=3）

表1 不同濃度Der p1處理不同時(shí)點(diǎn)的HNEpC標(biāo)準(zhǔn)化TER比較（，%，n=3）

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01

組別對(duì)照組Der p1組24 h 100.00±12.00 90.67±10.07 70.67± 6.11**48.00± 4.00**濃度/（μg/mL）1 5 1 0 1 h 100.00±9.44 97.50±7.81 97.50±5.73 98.75±3.75 6 h 100.00±3.85 93.59±8.01 78.21±5.88**62.82±9.68**12 h 100.00±5.95 93.51±9.80 75.32±3.90**58.44±8.11**

表2 不同濃度Der p1對(duì)HNEpC FITC-Dextran通透性的影響（，%）

表2 不同濃度Der p1對(duì)HNEpC FITC-Dextran通透性的影響（，%）

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01

FITC-Dextran通透性100.00±2.19 106.82±5.43 123.18±7.75**136.04±5.43**組別對(duì)照組Der p1組濃度/（μg/mL）1 5 1 0 n3 3 3 3

4.2 麻黃細(xì)辛附子湯及麻黃最佳干預(yù)濃度篩選

CCK-8結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，麻黃細(xì)辛附子湯濃度在0～2 mg/mL時(shí)對(duì)細(xì)胞存活率無(wú)影響，濃度為5、10 mg/mL時(shí)細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。因此后續(xù)采用0.5、1、2 mg/mL作為麻黃細(xì)辛附子湯低、中、高劑量進(jìn)行干預(yù)。與對(duì)照組比較，1 mg/mL麻黃組細(xì)胞存活率有降低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），2 mg/mL麻黃組細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.01），因此后續(xù)采用0.5 mg/mL麻黃進(jìn)行干預(yù)。見(jiàn)表3。

表3 不同濃度麻黃細(xì)辛附子湯及麻黃對(duì)HNEpC存活率的影響（，%）

表3 不同濃度麻黃細(xì)辛附子湯及麻黃對(duì)HNEpC存活率的影響（，%）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

細(xì)胞存活率100.00±2.65 103.47±6.43 106.18±2.61 101.39±3.41 91.90±4.38*83.15±8.78**100.00±3.87 100.45±4.66 93.95±4.72 87.37±4.76**80.31±2.39**64.06±4.37**組別對(duì)照組麻黃細(xì)辛附子湯組濃度/（mg/mL）0.5 1 2 5 1 0對(duì)照組麻黃組0.5 1 2 5 1 0 n4 4 4 4 4 44 4 4 4 4 4

4.3 麻黃細(xì)辛附子湯對(duì)人鼻黏膜上皮細(xì)胞形態(tài)的影響

對(duì)照組HNEpC排列緊密，模型組HNEpC排列疏松，間隙增大，上皮完整性破壞，出現(xiàn)環(huán)形損傷；麻黃組、抑制劑組和麻黃細(xì)辛附子湯低、中、高劑量組HNEpC排列較緊密，上皮損傷明顯修復(fù)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組HNEpC形態(tài)（標(biāo)尺=100 μm）

4.4 麻黃細(xì)辛附子湯對(duì)人鼻黏膜上皮細(xì)胞跨膜電阻的影響

與對(duì)照組比較，模型組HNEpC標(biāo)準(zhǔn)化TER顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，麻黃組、抑制劑組和麻黃細(xì)辛附子湯低、中、高劑量組HNEpC標(biāo)準(zhǔn)化TER顯著升高（P＜0.01）。見(jiàn)表4。

表4 各組HNEpC標(biāo)準(zhǔn)化TER比較（，%）

表4 各組HNEpC標(biāo)準(zhǔn)化TER比較（，%）

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01

標(biāo)準(zhǔn)化TER組別n 100.00± 9.45 50.00± 7.14**79.76± 8.99△△86.90± 7.43△△91.67±10.91△△83.33± 5.46△△88.10± 5.46△△對(duì)照組模型組麻黃細(xì)辛附子湯低劑量組麻黃細(xì)辛附子湯中劑量組麻黃細(xì)辛附子湯高劑量組麻黃組抑制劑組3 3 3 3 3 3 3

4.5 麻黃細(xì)辛附子湯對(duì)人鼻黏膜上皮細(xì)胞通透性的影響

與對(duì)照組比較，模型組HNEpC FITC-Dextran通透性顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，麻黃組、抑制劑組和麻黃細(xì)辛附子湯低、中、高劑量組HNEpC FITCDextran通透性顯著降低（P＜0.01），以麻黃細(xì)辛附子湯高劑量組效果最顯著（P＜0.05，P＜0.01）。見(jiàn)表5。

表5 各組HNEpC FITC-Dextran通透性比較（，%）

表5 各組HNEpC FITC-Dextran通透性比較（，%）

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01；與麻黃細(xì)辛附子湯高劑量組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

FITC-Dextran通透性100.00±5.19 138.28±6.07**120.23±9.56△△##118.92±9.79△△##101.50±3.86△△110.21±7.15△△115.04±6.59△△#組別對(duì)照組模型組麻黃細(xì)辛附子湯低劑量組麻黃細(xì)辛附子湯中劑量組麻黃細(xì)辛附子湯高劑量組麻黃組抑制劑組n3 3 3 3 3 3 3

4.6 麻黃細(xì)辛附子湯對(duì)人鼻黏膜上皮細(xì)胞咬合蛋白、閉合蛋白-1、RhoA、ROCK1蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞Occludin、Claudin-1蛋白表達(dá)顯著降低，RhoA、ROCK1蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，麻黃組、抑制劑組和麻黃細(xì)辛附子湯低、中、高劑量組細(xì)胞Occludin、Claudin-1蛋白表達(dá)顯著升高，RhoA、ROCK1蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01），以麻黃細(xì)辛附子湯高劑量組效果最顯著（P＜0.05，P＜0.01）。見(jiàn)圖2、表6。

圖2 各組HNEpC Occludin、Claudin-1、RhoA、ROCK1蛋白免疫印跡

表6 各組HNEpC Occludin、Claudin-1、RhoA、ROCK1蛋白表達(dá)比較（）

表6 各組HNEpC Occludin、Claudin-1、RhoA、ROCK1蛋白表達(dá)比較（）

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01；與麻黃細(xì)辛附子湯高劑量組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

ROCK1 1.00±0.01 1.28±0.06**1.13±0.03△△##0.96±0.03△△##0.76±0.02△△0.80±0.02△△0.82±0.03△△#組別對(duì)照組模型組麻黃細(xì)辛附子湯低劑量組麻黃細(xì)辛附子湯中劑量組麻黃細(xì)辛附子湯高劑量組麻黃組抑制劑組n3 3 3 3 3 3 3 Occludin 1.00±0.09 0.38±0.03**0.98±0.03△△##0.98±0.09△△##1.39±0.04△△1.21±0.06△△##0.69±0.08△△##Claudin-1 1.00±0.10 0.31±0.02**0.80±0.08△△##0.90±0.04△△##1.95±0.11△△1.66±0.05△△##0.95±0.12△△##RhoA 1.00±0.02 1.95±0.04**1.68±0.09△△##1.14±0.07△△1.05±0.06△△0.98±0.08△△1.05±0.12△△

4.7 麻黃細(xì)辛附子湯對(duì)人鼻黏膜上皮細(xì)胞F-肌動(dòng)蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞F-actin表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，麻黃細(xì)辛附子湯低、中、高劑量組和抑制劑組細(xì)胞F-actin表達(dá)顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。見(jiàn)圖3、表7。

圖3 各組HNEpC F-actin陽(yáng)性表達(dá)（免疫熒光染色，標(biāo)尺=130 μm）

表7 各組HNEpC F-actin表達(dá)比較（）

表7 各組HNEpC F-actin表達(dá)比較（）

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與麻黃細(xì)辛附子湯高劑量組比較，##P＜0.01

平均熒光強(qiáng)度15.56±0.75 19.64±0.52**17.78±0.68△17.44±0.99△17.25±1.52△△19.68±0.18##17.29±1.22△△組別對(duì)照組模型組麻黃細(xì)辛附子湯低劑量組麻黃細(xì)辛附子湯中劑量組麻黃細(xì)辛附子湯高劑量組麻黃組抑制劑組n3 3 3 3 3 3 3

5 討論

AR是發(fā)生在鼻黏膜的2型炎癥反應(yīng)。鼻黏膜上皮細(xì)胞作為鼻腔的免疫屏障，參與先天免疫及適應(yīng)性免疫，發(fā)揮重要的防御作用[15]。接觸變應(yīng)原后，上皮屏障損傷，通透性增加，促進(jìn)上皮源性細(xì)胞因子及趨化因子釋放，啟動(dòng)適應(yīng)性免疫，激活多種效應(yīng)細(xì)胞，釋放炎癥介質(zhì)，進(jìn)一步造成屏障損傷[16]。屏障損傷與2型炎癥反應(yīng)相互促進(jìn)，在AR過(guò)程中形成惡性循環(huán)[17-18]。麻黃細(xì)辛附子湯中麻黃散寒邪而發(fā)表，附子溫腎陽(yáng)而補(bǔ)虛，細(xì)辛通徹表里，為麻附之臂助。三藥合用，補(bǔ)散兼施，對(duì)于AR標(biāo)本兼治，療效持久。鼻黏膜上皮細(xì)胞處于機(jī)體淺表位置，是整個(gè)變態(tài)反應(yīng)的始動(dòng)環(huán)節(jié)，麻黃氣味俱薄，輕清而浮，能行周身肌表，是否對(duì)屏障功能有干預(yù)作用需通過(guò)實(shí)驗(yàn)確證。

細(xì)胞間連接完整性是維持黏膜屏障的關(guān)鍵因素，緊密連接位于細(xì)胞間連接頂部，介導(dǎo)細(xì)胞黏附，封閉細(xì)胞間隙，嚴(yán)格調(diào)控離子、水和各種分子的細(xì)胞旁運(yùn)輸[3]。Occludin、Claudin-1是緊密連接的關(guān)鍵蛋白。Occludin調(diào)節(jié)緊密連接滲漏途徑，允許較大分子通過(guò)，Claudin-1調(diào)節(jié)緊密連接孔道途徑，負(fù)責(zé)小分子和離子的通透性[19]。研究表明，AR患者鼻黏膜上皮部分緊密連接蛋白表達(dá)水平降低，黏膜通透性增加[20]。TER可反映跨上皮細(xì)胞離子流量大小，TER增加表明離子滲透性降低[21]。不同右旋糖酐（Dextran）可用于檢測(cè)溶質(zhì)和大分子的通透性[22]。TER及FITC-Dextran通透性常用于評(píng)價(jià)上皮屏障功能。F-actin是細(xì)胞骨架的關(guān)鍵組分，參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的高通透性[23-24]。F-actin細(xì)胞骨架與Occludin、Claudin-1等蛋白相連，共同維持屏障穩(wěn)定性[25]。RhoA/ROCK信號(hào)通路在調(diào)控肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)及其他生物過(guò)程中發(fā)揮核心作用[26]。RhoA-GTP能激活ROCK，促進(jìn)F-actin表達(dá)及重新排布，增加細(xì)胞張力，導(dǎo)致細(xì)胞收縮及細(xì)胞旁間隙的形成[27-28]。此外，F(xiàn)-actin重排可使緊密連接復(fù)合物穩(wěn)定性破壞，細(xì)胞間連接受損，屏障結(jié)構(gòu)及功能異常[29]。RhoA/ROCK除調(diào)控F-actin引起屏障損傷外，還可直接磷酸化緊密連接蛋白，并在連接結(jié)構(gòu)基本保持不變的情況下增加溶質(zhì)滲透性[30]。Y-27632是一種選擇性Rho激酶抑制劑，通過(guò)與ATP競(jìng)爭(zhēng)Rho激酶催化結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合位點(diǎn)抑制Rho激酶活化[31]。

本實(shí)驗(yàn)選用常見(jiàn)過(guò)敏原Der p1構(gòu)建HNEpC屏障損傷模型，經(jīng)麻黃細(xì)辛附子湯、麻黃、抑制劑干預(yù)后，TER升高，F(xiàn)ITC-Dextran通透性降低，細(xì)胞排列緊密，環(huán)形損傷修復(fù)，緊密連接蛋白Occludin、Claudin-1表達(dá)升高，表明麻黃細(xì)辛附子湯、麻黃、抑制劑對(duì)Der p1引起的屏障損傷均具有修復(fù)作用，以高劑量麻黃細(xì)辛附子湯效果最為顯著。為探索麻黃細(xì)辛附子湯及麻黃發(fā)揮屏障保護(hù)作用的機(jī)制，進(jìn)一步以RhoA/ROCK信號(hào)通路為切入點(diǎn)，檢測(cè)通路關(guān)鍵蛋白R(shí)hoA、ROCK1及下游蛋白F-actin表達(dá)。結(jié)果顯示，麻黃細(xì)辛附子湯能降低RhoA、ROCK1、F-actin表達(dá)，而麻黃可降低RhoA、ROCK1表達(dá)，結(jié)合全方對(duì)緊密連接蛋白的優(yōu)勢(shì)調(diào)節(jié)作用，一定程度上可以反映方藥配伍的科學(xué)性。但該結(jié)果也可能與實(shí)驗(yàn)中所設(shè)麻黃藥物濃度有關(guān)，今后可設(shè)置不同濃度的麻黃組，進(jìn)一步對(duì)比全方與麻黃單味藥的作用差異。

綜上所述，麻黃細(xì)辛附子湯及麻黃能有效修復(fù)Der p1誘導(dǎo)的鼻黏膜上皮細(xì)胞屏障損傷，其作用可能是通過(guò)抑制RhoA/ROCK信號(hào)通路，減少F-actin聚集、收縮、重排，上調(diào)緊密連接蛋白表達(dá)，降低上皮通透性實(shí)現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)中麻黃細(xì)辛附子湯及麻黃屏障保護(hù)作用顯著，可深入探索其配伍機(jī)制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。此外，鼻黏膜上皮細(xì)胞與其他免疫細(xì)胞的關(guān)系也具有潛在研究?jī)r(jià)值。