基于HSP27-TLR4/NF-κB通路的芪參顆粒對(duì)大鼠心肌梗死后炎癥反應(yīng)的影響

于藜爽 ，郭淑貞 ，黃夢(mèng)瑩 ，王曉平 ，張亞雯 ，洪藝勤 ，王勇 ，盧令慧

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 102488； 2.北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 102488

心肌梗死是一種嚴(yán)重的心血管疾病，是心源性死亡的主要原因[1]。及時(shí)的血運(yùn)重建和隨后的治療策略可顯著降低急性心肌梗死的病死率，但缺血性心臟病仍是心力衰竭的主要病因，遠(yuǎn)期預(yù)后堪憂[2]。心肌梗死后心力衰竭的發(fā)生發(fā)展與炎癥反應(yīng)等因素密切相關(guān)[2]。心肌梗死早期的炎癥反應(yīng)是必要的、有益的，但炎癥反應(yīng)失控則會(huì)加重心室不良重塑，導(dǎo)致重大不良臨床事件發(fā)生[3]。近年來(lái)，針對(duì)炎癥途徑和介質(zhì)的抗炎治療策略在多項(xiàng)臨床試驗(yàn)中取得了一定進(jìn)展，同時(shí)指出，研究工作應(yīng)著眼于多途徑抑制，以及靶向引發(fā)炎癥過(guò)程的上游介質(zhì)[4]。

熱休克蛋白27（HSP27）是小型的HSP家族成員，在心臟中高表達(dá)，參與心臟相關(guān)的大量生理病理過(guò)程。多種刺激如氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子、炎癥因子等都可誘導(dǎo)HSP27表達(dá)從而增強(qiáng)耐受性[5]。臨床數(shù)據(jù)顯示，血液中HSP27表達(dá)在心力衰竭患者中顯著升高，是患者死亡或非計(jì)劃再入院的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[6]。細(xì)胞外HSP27可激活Toll樣受體（TLR）依賴的機(jī)制，進(jìn)一步激活核因子-κB（NF-κB）通路，從而引發(fā)冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)，加速心肌缺血再灌注后心功能不全[7]。其中TLR4介導(dǎo)TLR4/NF-κB炎癥反應(yīng)信號(hào)通路，通過(guò)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡[8]、心肌纖維化[9]等參與心肌梗死后心力衰竭相關(guān)病理進(jìn)程。芪參顆粒是北京中醫(yī)藥大學(xué)王偉教授針對(duì)心力衰竭“虛”“毒”“瘀”的病機(jī)要點(diǎn)，以真武湯和四妙勇安湯為基礎(chǔ)化裁，全方具有益氣溫陽(yáng)、活血解毒之功。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，芪參顆粒可以改善缺血心肌的氧化應(yīng)激水平，減少促炎因子生成，抑制心室重構(gòu)，改善心臟功能等[10-12]。本研究進(jìn)一步探討其作用是否與調(diào)控血液HSP27含量、促進(jìn)TLR4/NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量（200±10）g，斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2019-0010。飼養(yǎng)于（22±2）℃、濕度40%～60%環(huán)境，12 h明暗交替，自由進(jìn)食飲水。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)（BUCM-4-2021110901-4044）。

1.2 藥物及制備

芪參顆粒（炙黃芪30 g，丹參15 g，玄參10 g，金銀花10 g，黑順片9 g，炙甘草6 g），飲片購(gòu)自北京同仁堂股份有限公司。由中日友好醫(yī)院經(jīng)水提、醇沉、干燥等工藝加工成凍干粉，出膏率為25.2%，低溫冷藏室密封保存。

1.3 主要試劑與儀器

HSP27檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)SEA693Ra，武漢云克?。?，NF-κB p65抗體（貨號(hào)ab16502，英國(guó)Abcam），TLR4抗體（貨號(hào)bs-20594R，北京博奧森），β-actin單克隆抗體（貨號(hào)HRP-66009，美國(guó)Proteintech），HRP標(biāo)記二抗（貨號(hào)sc-2357，美國(guó)Santa Cruz），ECL PLUS超敏發(fā)光液（貨號(hào)P1050-100，北京普利萊）。ALC-V8S小動(dòng)物呼吸機(jī)、Vevo2100小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)，加拿大Visual Sonics；BSA224S電子分析天平，德國(guó)Sartorious；Pannoramic Scan掃描儀，匈牙利3DHISTECH；A009超分辨顯微組織成像系統(tǒng)，德國(guó)Leica；SpectraMax Paradigm多功能微孔讀板機(jī)，美國(guó)Molecular Devices；小型垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad；C600多功能激光熒光分子成像系統(tǒng)，美國(guó)Azure Biosystems。

1.4 分組、造模及給藥

48只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，進(jìn)行左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎術(shù)或假手術(shù)。手術(shù)方法參照前期操作[13]，1%戊巴比妥鈉麻醉，用16G靜脈留置針經(jīng)口行氣管插管，連接呼吸機(jī)，潮氣量4.5～6 mL，心率80次/min，呼吸比1∶2。左前胸備皮，消毒，從3～4肋間隙逐層開胸，暴露心臟，于左心耳下1 mm處結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，結(jié)扎表面滴利多卡因預(yù)防室顫。逐層關(guān)胸，脫機(jī)，腹腔注射0.2 mL呋塞米，置保溫毯上蘇醒。假手術(shù)行相同開胸術(shù)，僅套線不結(jié)扎。術(shù)后24 h將存活假手術(shù)大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和芪參顆粒對(duì)照組，造模大鼠分為模型組和芪參顆粒組，芪參顆粒對(duì)照組和芪參顆粒組灌胃相當(dāng)于人臨床等效劑量的芪參顆粒水溶液（2.352 g/kg），對(duì)照組和模型組予等體積蒸餾水，每日1次，連續(xù)1周。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 超聲心動(dòng)圖

給藥結(jié)束后，1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，備皮，行超聲心動(dòng)分析。使用MS250探頭探查大鼠心臟短軸乳頭肌層面，分別采集大鼠B型及M型超聲心動(dòng)圖動(dòng)態(tài)影像。用Vevo2100軟件測(cè)量左室舒張末期前壁厚度（LVAWd）、左室收縮末期前壁厚度（LVAWs）、左室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVIDs）、左室舒張末期后壁厚度（LVPWd）、左室收縮末期后壁厚度（LVPWs），每只大鼠測(cè)量3個(gè)心動(dòng)周期，結(jié)果取平均值。系統(tǒng)自動(dòng)計(jì)算射血分?jǐn)?shù)（EF）、短軸縮短率（FS）、左室舒張末期容積（LVEDV）、左室收縮末期容積（LVESV）。超聲操作與數(shù)據(jù)分析均以盲法進(jìn)行。

1.5.2 心、肺臟器系數(shù)檢測(cè)

取材前稱量大鼠體質(zhì)量（BM），麻醉后經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，迅速摘取完整的心臟和肺臟，預(yù)冷PBS漂洗，排出心腔內(nèi)殘留血液。心臟、肺臟置于冰盤上剔除多余組織，濾紙吸干表面水分，電子分析天平分別稱量心臟質(zhì)量（HM）、肺臟質(zhì)量（LM）。分離大鼠右下肢脛骨，剝離皮毛后用游標(biāo)卡尺測(cè)量脛骨長(zhǎng)度（TL），計(jì)算HM/BM、HM/TL、LM/BM、LM/TL，用于輔助評(píng)估心力衰竭和肺水腫程度。

1.5.3 心肌組織病理學(xué)檢測(cè)

心臟于結(jié)扎線下5 mm處橫向切開，取心底部置于4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，5 μm切片，進(jìn)行麥胚凝集素（WGA）熒光染色、HE和Masson染色。用超分辨顯微組織成像系統(tǒng)掃描切片，用Caseviewer軟件觀察心肌結(jié)構(gòu)、炎癥及纖維化改變。

1.5.4 ELISA檢測(cè)

使用EDTA抗凝管采集腹主動(dòng)脈血，常溫靜置2 h，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上清液，按試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)HSP27含量。

1.5.5 Western blot檢測(cè)

取30 mg心肌組織，加RIPA裂解液（100 mg/mL）和研磨珠充分裂解，離心，取上清液，BCA法進(jìn)行蛋白定量，加入loading buffer制備樣品，經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（恒壓80 V），300 mA轉(zhuǎn)膜60 min；用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，將膜分別放入TLR4一抗（1∶1 000）、NF-κB p65一抗（1∶1 000）、β-actin一抗（1∶10 000），4 ℃過(guò)夜，TBST洗3次，每次5 min；加二抗（1∶7 500），室溫?fù)u床孵育60 min，TBST洗3次，每次10 min，ECL發(fā)光液曝光顯影，Image J 6.0軟件測(cè)量灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 芪參顆粒對(duì)模型大鼠心功能的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠LVAWd、LVAWs、LVPWd、LVPWs、EF和FS顯著降低（P＜0.01），LVIDd、LVIDs、LVEDV、LVESV顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，芪參顆粒組大鼠LVAWs、LVPWd、EF和FS顯著升高，LVIDs、LVESV顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。芪參顆粒對(duì)照組與對(duì)照組比較，各指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 心功能指標(biāo)各組大鼠比較（，每組7～10只）

表1 心功能指標(biāo)各組大鼠比較（，每組7～10只）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

指標(biāo)LVAWd/mm LVAWs/mm LVIDd/mm LVIDs/mm LVPWd/mm LVPWs/mm LVEDV/μL LVESV/μL EF/%FS/%芪參顆粒組1.78±0.62 2.50±0.91#6.86±1.09 4.42±1.22#2.28±0.32##2.97±0.39 251.26±93.48 97.13±53.59#62.15±17.11#35.99±13.68#對(duì)照組2.21±0.31 3.71±0.60 5.79±0.38 2.04±0.99 2.21±0.24 3.67±0.48 166.60±24.10 18.12±13.11 89.78±7.03 65.44±15.98芪參顆粒對(duì)照組2.01±0.37 3.87±0.40 6.17±0.92 1.97±0.93 2.03±0.23 3.41±0.25 196.83±65.24 16.64±14.94 92.81±5.36 69.31±11.61模型組1.39±0.53**1.57±0.63**7.68±1.06*5.89±1.05**1.80±0.16**2.87±0.43**320.97±102.05**178.81±77.21**45.59±5.64**23.61±3.25**

2.2 芪參顆粒對(duì)模型大鼠心、肺臟器系數(shù)的影響

各組大鼠HM/BM、HM/TL、LM/BM、LM/TL差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠臟器系數(shù)比較（）

表2 各組大鼠臟器系數(shù)比較（）

組別對(duì)照組芪參顆粒對(duì)照組模型組芪參顆粒組只數(shù)8 10 7 8 HM/BM（mg/g）3.38±0.35 3.21±0.28 3.33±0.27 3.43±0.24 HM/TL（mg/mm）17.84±1.04 18.03±2.81 17.71±1.97 17.79±0.68 LM/BM（mg/g）4.28±0.34 4.22±0.29 4.24±0.44 3.15±2.16 LM/TL（mg/mm）22.69±2.58 23.42±3.67 22.55±2.82 22.59±1.75

2.3 芪參顆粒對(duì)模型大鼠心肌組織病理變化的影響

WGA免疫熒光染色可標(biāo)記細(xì)胞輪廓。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌梗死邊緣區(qū)細(xì)胞橫截面積顯著增加，可能存在代償性肥大，芪參顆粒組梗死邊緣區(qū)細(xì)胞橫截面積較模型組顯著減少，見(jiàn)圖1。

HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組和芪參顆粒對(duì)照組大鼠心肌組織小動(dòng)脈周圍心肌纖維排列整齊，形態(tài)正常；模型組大鼠心肌組織小動(dòng)脈周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌細(xì)胞死亡后被結(jié)締組織填充，殘存心肌細(xì)胞代償性肥大；與模型組比較，芪參顆粒組大鼠心肌組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和心肌細(xì)胞存活情況顯著改善。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織形態(tài)（HE染色，標(biāo)尺=40 μm）

Masson染色結(jié)果顯示，對(duì)照組和芪參顆粒對(duì)照組大鼠心肌間質(zhì)僅有極少量藍(lán)染的膠原纖維，而模型組大鼠心肌梗死邊緣區(qū)心肌間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大量藍(lán)色膠原纖維；與模型組比較，芪參顆粒組大鼠心肌梗死邊緣區(qū)心肌間質(zhì)纖維化情況顯著改善。見(jiàn)圖3。

圖3 各組大鼠心肌組織形態(tài)（Masson染色，標(biāo)尺=200 μm）

2.4 芪參顆粒對(duì)模型大鼠血漿熱休克蛋白27含量的影響

與對(duì)照組比較，芪參顆粒對(duì)照組大鼠血漿HSP27含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），模型組大鼠血漿HSP27含量顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，芪參顆粒組大鼠血漿HSP27含量顯著減少（P＜0.01）。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血漿HSP27含量比較（，ng/mL）

表3 各組大鼠血漿HSP27含量比較（，ng/mL）

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

HSP27 45.57±1.37 44.53±1.21 48.20±1.26**45.27±0.78##組別對(duì)照組芪參顆粒對(duì)照組模型組芪參顆粒組只數(shù)6 6 6 6

2.5 芪參顆粒對(duì)模型大鼠心肌組織Toll樣受體4、核因子-κB p65蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，芪參顆粒組大鼠心肌組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖4、表4。

圖4 各組大鼠心肌組織TLR4、NF-κB p65蛋白免疫印跡

表4 各組大鼠心肌組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)比較（）

表4 各組大鼠心肌組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)比較（）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

NF-κB p65 1.00±0.19 0.87±0.32*1.47±0.15#0.93±0.27*組別對(duì)照組芪參顆粒對(duì)照組模型組芪參顆粒組只數(shù)3 3 3 3 TLR4 1.00±0.29 0.76±0.07*1.84±0.54#0.99±0.25*

3 討論

心肌梗死屬中醫(yī)學(xué)“胸痹”“真心痛”范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，在心肌梗死發(fā)展至心力衰竭的過(guò)程中，氣虛血瘀是基本病機(jī)，陰陽(yáng)失調(diào)是疾病發(fā)展的基礎(chǔ)，痰飲水停是疾病發(fā)展的病理產(chǎn)物[14]。芪參顆粒由炙黃芪、黑附片、丹參、玄參、金銀花、炙甘草組成，具有益氣溫陽(yáng)、活血解毒功效。臨床研究顯示，芪參顆粒治療慢性心力衰竭安全有效，可降低N-末端腦鈉肽前體，改善患者心功能分級(jí)，減輕心力衰竭癥狀等[15]。基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，芪參顆粒可降低炎癥因子水平，從而改善心臟功能[16]。本研究通過(guò)超聲評(píng)價(jià)大鼠心功能、病理染色觀察心臟結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)芪參顆粒可以改善心肌梗死大鼠早期收縮功能下降和梗死邊緣區(qū)心肌細(xì)胞代償性肥大，減輕小動(dòng)脈及肌纖維間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維化程度。

HSP27在心肌細(xì)胞中高表達(dá)，盡管細(xì)胞內(nèi)的HSP27被認(rèn)為是增強(qiáng)應(yīng)激耐受從而發(fā)揮保護(hù)作用的重要分子，但心肌損傷時(shí)HSP27會(huì)從心肌細(xì)胞釋放入血，目前尚不明確其釋放機(jī)制是主動(dòng)分泌還是被動(dòng)滲漏。血液HSP27水平升高與心肌梗死后心力衰竭關(guān)系密切，研究發(fā)現(xiàn)，HSP27水平與左心室收縮、舒張功能呈負(fù)相關(guān)，與LVIDd、紐約心臟病協(xié)會(huì)分級(jí)、N-末端腦鈉肽前體水平呈正相關(guān)[17-18]。除與心肌損傷程度相關(guān)外，血漿HSP27水平還與心血管疾病預(yù)后密切相關(guān)，且已經(jīng)成為慢性心力衰竭患者預(yù)后、死亡或非計(jì)劃再入院的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[6]。

有研究表明，人和小鼠心肌細(xì)胞響應(yīng)缺血應(yīng)激后釋放HSP27，而細(xì)胞外HSP27作為一種炎癥介質(zhì)主要通過(guò)激活TLR4/NF-κB通路誘導(dǎo)心臟和血管炎癥反應(yīng)，從而加速心肌損傷[7]。TLR4/NF-κB信號(hào)通路是一種與炎癥免疫密切相關(guān)的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在組織炎癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。TLR4是模式識(shí)別受體家族的成員，可識(shí)別病原體相關(guān)分子，激活NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子，啟動(dòng)多種促炎細(xì)胞因子表達(dá)，如白細(xì)胞介素-1、白細(xì)胞介素-6和腫瘤壞死因子-α等，持續(xù)加重心肌炎癥反應(yīng)[19]。靶向TLR4抗炎成為延緩心力衰竭進(jìn)展的新策略，如臨床常用抗心力衰竭藥物卡維地洛可抑制TLR4介導(dǎo)的心肌炎癥[20]。TLR4/NF-κB通路還可調(diào)節(jié)上游炎癥，從而成為炎癥調(diào)節(jié)的樞紐和關(guān)鍵因素。炎癥持續(xù)增強(qiáng)會(huì)擴(kuò)大梗死面積、降低心肌收縮力、減少心輸出量，加速心室重構(gòu)及心力衰竭進(jìn)展[21]。本研究通過(guò)ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血漿HSP27含量增加，心肌組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)升高，提示該炎癥通路被激活，可能介導(dǎo)持續(xù)的炎癥反應(yīng)，加重心肌損傷；芪參顆粒可明顯降低模型大鼠血漿HSP27水平，下調(diào)心肌組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)，提示芪參顆?？捎行p少心肌HSP27釋放，阻斷由其介導(dǎo)的TLR4/NF-κB炎性信號(hào)通路的激活，這可能是芪參顆粒發(fā)揮心肌保護(hù)作用的機(jī)制之一。另外芪參顆粒對(duì)照組結(jié)果顯示，芪參顆粒亦可顯著降低正常大鼠心肌組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)，不排除芪參顆粒直接下調(diào)該通路發(fā)揮抗炎作用，顯示了中藥復(fù)方多靶點(diǎn)協(xié)同增效的特性。

綜上，芪參顆?？上抡{(diào)心肌梗死大鼠血漿HSP27含量，進(jìn)而抑制TLR4/NF-κB通路介導(dǎo)的心肌梗死早期炎癥反應(yīng)，減輕梗死邊緣炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、心肌細(xì)胞代償性肥大和心肌間質(zhì)纖維化等病理改變，進(jìn)而改善心臟結(jié)構(gòu)和收縮功能。