甲榮康對甲減合并性腺功能減退大鼠卵巢組織InhBP免疫組化表達的影響

馮曉 蔡欣蕊 朱保霖 錢秋海 錢衛(wèi)斌

摘要：目的觀察以健脾補腎、調(diào)肝活血、溫通瀉濁為治法組方的中藥復(fù)方甲榮康對甲狀腺功能減退模型大鼠卵巢組織InhBP表達的影響并探討其機制。方法用他巴唑復(fù)制甲狀腺功能減退大鼠模型，并分為5組（n=10）：模型對照組、西藥對照組、甲榮康小、中、大劑量組，另加空白對照組，分別灌胃。藥物干預(yù)6周后，采用免疫組化方法檢測各組大鼠卵巢組織InhBP的表達。結(jié)果甲減模型大鼠卵巢組織InhBP表達水平明顯升高，甲榮康可顯著的降低模型大鼠卵巢組織InhBP表達水平，而且隨著劑量的加大，療效更加顯著，明顯優(yōu)于對照組。結(jié)論InhBP的異常表達是甲減合并性腺功能減退的發(fā)病機制之一，通過健脾補腎、調(diào)肝活血、溫通瀉濁法對甲減合并性腺功能減退進行早期干預(yù)效果明顯，甲榮康可能通過降低InhBP在模型大鼠卵巢組織中的異常表達對甲狀腺及性腺功能起到保護作用，值得進一步深入研究。

關(guān)鍵詞：甲榮康;甲狀腺功能減退;性腺功能減退;InhBP;免疫組化

中圖分類號：R2855? ? ?文獻標志碼：A? ? 文章編號：1007-2349（2018）06-0062-03

Effect of Jiarongkang on InhBP Expression in Ovarian Tissue from Hypothyroidism and Hypogonadism Rats by Immunohistochemistry

FENG Xiao1，CAI Xin-rui2，ZHU Bao-lin3，QIAN Qiu-hai4，QIAN Wei-bin4

（1 .Traditional Chinese Hospital of Dezhou City，Dezhou 253000，China;

2 .Shandong Institute of Occupational Health and Occupational Diseases Prevention and Control，Jinan 250062，China;

3 .Peoples Hospital of Shizhong District of Jinan City，Jinan 250002，China;

4. The Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250011，China）

【Abstract】Objective：To observe the effect of TCM compound Jiarongkang on InhBP expression in ovarian tissue from hypothyroidism and hypogonadism rats and discuss its mechanisms，which is originally aimed to nourish spleen，kidney，liver and bone marrow with alleviating diarrhea Methods：The rat model of hypothyroidism was established by orally administering tapazole and these hypothyroidism rats were divided into 5 groups（n=10 each）：the model control group，the western medicine control group，the Jiarongkang group with low，medium and high doses，additionally the blank control group included All of medications were given orally After 6 weeks of intervention，the expression of InhBP in ovarian tissues was detected by immunohistochemistry Results：The InhBP expression in ovarian tissues from hypothyroidism rats was significantly increased Jiarongkang significantly reduced the expression of InhBP in ovarian tissues in the hypothyroidism rats In addition，the therapeutic effect was more significant with the increase of dose，significantly better than that of the other control groups with tapazole administration Conclusion：Abnormal InhBP expression is one of the mechanisms in hypothyroidism combined with hypogonadism Early intervention of hypothyroidism plus hypogonadism can be effective by nourishing spleen，kidney，liver and bone marrow with attenuating diarrhea Jiarongkang possibly reduces the abnormal expression of InhBP in ovary tissues from the model rats，which plays a protective role in thyroid gland and gonadal function，and remains to be studied

【Key words】Jiarongkang，hypothyroidism，hypogonadism，InhBP，immunohistochemistry

甲狀腺功能減退癥（hypothyroidism），是指由于甲狀腺合成甲狀腺激素減少或組織對甲狀腺激素抵抗，引起血清甲狀腺激素缺乏或作用發(fā)生障礙而表現(xiàn)出的一組臨床綜合征[1]。近年來，甲狀腺疾病的發(fā)生率呈逐年上升趨勢，且隨年齡的增長而增加[2]。本病女性顯著高發(fā)，男女發(fā)病比例為1：4-5。臨床甲減的患者中，男性占01%，女性占19%;亞臨床甲減患病率增高，男為27%，女為71%[3]。本文通過建立甲減合并性腺功能減退大鼠實驗?zāi)Ｐ?，觀察甲榮康對大鼠卵巢組織InhBP免疫組化表達水平的影響。

1 實驗材料

1.1.實驗動物健康雌性wistar大鼠，體重（200±20）g，由山東中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（魯）20110003。普通飼料由山東中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。總熱量為15355J/g（蛋白質(zhì)20%、碳水化合物53%、脂肪9%）。

1.2.藥品及試劑甲榮康，由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科加工而成，由炙黃芪、仙靈脾、巴戟天、仙茅、鹿角膠、肉桂、熟大黃、香附、郁金、當歸、荷葉、干姜、白術(shù)等藥物組成，實驗時制成甲榮康水煎劑。優(yōu)甲樂（左旋甲狀腺素鈉片），50 ug/片，Merck Gmbh公司生產(chǎn)，進口藥品注冊證號：H20100523，產(chǎn)品批號：146548。用研缽把藥品研碎，與生理鹽水配成懸濁液。他巴唑（甲巰咪唑），片劑，50 mg/片，北京市燕京藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號：H11020440，生產(chǎn)批號：120108。用研缽把藥品研碎，與生理鹽水溶液。一抗Rabbit Anti-inhBP，由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供（bs-9194R）;羊抗鼠/兔二抗檢測試劑盒，由上海太陽生物提供，產(chǎn)品批號：DD13E001;濃縮型DAB試劑盒，由上海太陽生物提供，產(chǎn)品批號：100E005。

1.3.實驗儀器電子天平，上海天平儀器廠;日本OLYMPUS CKX41-32PH型顯微鏡;德國Leica ASP全自動生物脫水機;德國Leica ASP2135型超薄切片機;Galanz微波爐;同濟醫(yī)科大學(xué)HPLAS100型醫(yī)學(xué)影像分析系統(tǒng)。

2 實驗方法

2.1.造模方法將Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。采用抗甲狀腺藥物的造模方法，藥物劑量按實驗動物與人體表面積比換算而成，即200 g大鼠所需劑量相當于成人量×0018，具體給藥：造模大鼠每日灌服004%他巴唑混懸液135 mL（054mg/200 g），共給藥7周。

2.2.分組及給藥將50只造模成功的大鼠隨機分為以下5組（n=10）：①模型動物+生理鹽水組 ②模型動物+優(yōu)甲樂組 ③模型動物+甲榮康小劑量組 ④模型動物+甲榮康中劑量組 ⑤模型動物+甲榮康大劑量組。其中，模型動物+生理鹽水組和正常動物+生理鹽水組給予等容積生理鹽水灌胃。模型動物+甲榮康小劑量組給予甲榮康水煎劑125 g/kg;模型動物+甲榮康中劑量組給予甲榮康水煎劑25 g/kg;模型動物+甲榮康大劑量組給予甲榮康水煎劑50 g/kg，模型動物+優(yōu)甲樂組按照36ug/kg給藥。每組均每日灌胃1次，給予普通飼料喂養(yǎng)，連續(xù)給藥觀察6周。

2.3.組織標本的采集解剖全部大鼠，迅速分別摘取每只大鼠卵巢，去除其周圍的脂肪組織，用生理鹽水沖洗后置4%甲醛中固定，待測InhBP免疫組化表達。

2.4.免疫組化方法檢測卵巢組織InhBP的表達按照Rabbit SP Kit免疫組化染色試劑盒要求操作。顯微鏡下取10×10視野下觀察標本，照相。每張切片鏡下隨機選取5個視野觀察陽性產(chǎn)物的分布、染色情況。對每例切片，按Ferrier所采取半定量積分法[4]判斷結(jié)果。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)以（x±s）表示，采用SPSS 170統(tǒng)計軟件，應(yīng)用Students t檢驗，單因素方差分析，以P<005為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 實驗結(jié)果

免疫組化結(jié)果顯示：InhBP主要分布于大鼠卵巢組織，陽性反應(yīng)產(chǎn)物分布于顆粒細胞中。InhBP在各組大鼠卵巢組織細胞中均有不同程度的表達，在模型動物+生理鹽水組中InhBP陽性顆粒較少，著色較淺，表達不明顯;而在模型動物+甲榮康小、中、大三個劑量組中，隨著甲榮康應(yīng)用劑量的增高，InhBP陽性顆粒增多，著色變深，且呈現(xiàn)一定的劑量相關(guān)性。模型動物+優(yōu)甲樂組與模型動物+生理鹽水組相比InhBP陽性表達較強，但明顯少于模型動物+甲榮康大劑量組。見圖1。

InhBP免疫組化表達的影響（×100）InhBP免疫組化陽性評分結(jié)果顯示：模型動物+生理鹽水組卵巢組織InhBP免疫組化陽性積分明顯低于正常動物+生理鹽水組（P<005）;模型動物+甲榮康小、中、大劑量組與模型動物+生理鹽水組相比，InhBP陽性積分明顯升高（P<005），并呈現(xiàn)出一定的劑量相關(guān)性，模型動物+甲榮康大劑量組與模型動物+優(yōu)甲樂組相比也有明顯差異（P<005）。模型動物+優(yōu)甲樂組InhBP免疫組化陽性積分較模型動物+生理鹽水組較高（P<005），但低于模型動物+甲榮康大劑量組（P<005）。見表1。

5 討論

甲狀腺功能減退癥（甲減）是多種原因引起的甲狀腺激素合成、分泌或生物效應(yīng)不足所致的一組內(nèi)分泌疾病，在我國臨床甲減的患病率約為1%，各年齡段均可發(fā)病，女性居多，亞臨床甲減的患病率為091%-605%，超過60歲的婦女中患病率可達20%[5]。甲減正日益成為威脅國人健康的隱形殺手。中醫(yī)上甲狀腺功能減退癥可歸屬于虛勞、水腫的范疇。近年來運用中醫(yī)藥治療本病報道日益增多，中醫(yī)治療甲狀腺功能減退癥在臨床研究、實驗研究也取得一定進展。隨著甲減患病率的不斷增長，選用甲榮方治療甲減，因此，及早的發(fā)現(xiàn)甲減并做到有效的防治，即通過對甲減的早期干預(yù)，從而提高甲減患者的生活質(zhì)量具有重大的意義。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，INHB（抑制素B）是排卵前抑制素的主要形式，主要由卵巢顆粒細胞、卵泡膜細胞合成分泌，對垂體合成和釋放FSH（卵泡刺激素）起負反饋調(diào)節(jié)作用，并且能直接刺激卵泡膜細胞合成雄激素[6]。INHB可以作為反映發(fā)育中的卵泡功能的指標，且可反映卵巢的儲備功能。研究發(fā)現(xiàn)，卵巢儲備功能處于衰退中的婦女，其月經(jīng)周期第3天血清INHB降低，血INH的下降是圍絕經(jīng)期出現(xiàn)最早的生化指標，可以直接反映卵巢的儲備功能[7]。有兩種蛋白被認為是具有代表性的INHR（抑制素受體），即inhBP（抑制素結(jié)合蛋白）和β-多糖，inhBP最初由Chong等[8]從牛垂體中提取，目前在人垂體促性腺激素細胞和卵巢、睪丸中也已證實其存在，其發(fā)揮作用的分子機制是：INH與inhBP結(jié)合后，其跨膜蛋白多糖與ACTRI（激活素受體I）交聯(lián)，阻止ACTRI、ACTRⅡ之間聯(lián)系，使ACTRI不能磷酸化，從而阻斷激活素信號向細胞核內(nèi)傳導(dǎo)。另有觀點認為，inhBP不能以受體常規(guī)的形式結(jié)合抑制素，因此認為[9]，這種蛋白只能促進抑制素與激活素競爭結(jié)合Ⅱ型受體，而不是產(chǎn)生特異的細胞內(nèi)抑制素傳導(dǎo)信號，即如果抑制素與激活素通過競爭形式結(jié)合受體，那么inhBP可提高其親和力。從而發(fā)揮INHB拮抗ACTA的作用，降低對FSH的反應(yīng)性，繼而調(diào)節(jié)卵泡生長、優(yōu)勢選擇。甲減女性患者往往伴隨卵巢功能的減退，根據(jù)INHB及inhBP發(fā)揮作用的機制，我們推測，甲減時inhBP的異常表達降低了卵巢功能。

研究結(jié)果顯示，甲減時卵巢組織InhBP數(shù)目明顯增多，陽性表達增高，模型動物+生理鹽水組與正常動物+生理鹽水組相比有明顯差異（P<001）。經(jīng)灌服甲榮康6周后，模型動物+甲榮康小、中、大劑量組的InhBP陽性表達顯著減弱，與模型動物+生理鹽水組相比有顯著性差異（P<001）。且模型動物+甲榮康大劑量組與模型動物+優(yōu)甲樂組相比，也有明顯差異（P<005）。實驗表明InhBP表達水平增高可能是甲減導(dǎo)致性腺功能減退的原因之一。

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