中藥延緩非小細(xì)胞肺癌表皮生長(zhǎng)因子受體-酪氨酸激酶抑制劑耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展△

穆泓宇，何丹丹，王雅梅

首都醫(yī)科大學(xué)1中醫(yī)藥學(xué)院2019級(jí)五年制中醫(yī)專業(yè)，2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生化與分子生物學(xué)系，北京 100069

表皮生長(zhǎng)因子受體-酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）是表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）敏感突變的非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者的一線用藥，可以通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合EGFR 的ATP 位點(diǎn)來阻斷EGFR 末端磷酸化，阻止腫瘤細(xì)胞惡性增殖[1]。但絕大多數(shù)患者在治療6～12 個(gè)月后會(huì)不可避免地出現(xiàn)獲得性耐藥，使得疾病再次進(jìn)展[2]。中藥既可以延緩EGFR-TKI 耐藥的發(fā)生，又可以在耐藥后增強(qiáng)EGFR-TKI 的抗腫瘤效果，起到協(xié)同增效的作用，是NSCLC 綜合治療的重要手段。近年來，相關(guān)綜述大多集中在臨床療效的觀察與中醫(yī)理論的探討，少有針對(duì)中藥作用機(jī)制的系統(tǒng)總結(jié)。基于此，本文對(duì)中藥延緩NSCLC EGFR-TKI 耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為NSCLC 的中西醫(yī)結(jié)合治療提供作用機(jī)制方面的參考。

1 抑制EGFR 下游通路異常激活

EGFR 下游信號(hào)通路的持續(xù)活化是EGFR-TKI耐藥的原因之一。當(dāng)EGFR 被酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）抑制后，其他受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）可形成異源二聚體，代償性地激活下游信號(hào)通路，使得作用于單一靶點(diǎn)的EGFR-TKI 失效。中藥可以作用于EGFR 的下游通路，抑制其異常激活，進(jìn)而延緩耐藥。目前研究較為清楚的主要途徑有以下3 條。

1.1 抑制磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）通路

PI3K 是細(xì)胞外信號(hào)與細(xì)胞內(nèi)應(yīng)答的中轉(zhuǎn)站，可以刺激細(xì)胞產(chǎn)生3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol 3, 4, 5-trisphosphate，PIP3），并誘導(dǎo)下游AKT活化，從而啟動(dòng)凋亡、自噬相關(guān)蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與分化。研究發(fā)現(xiàn)，抑制PI3K/AKT 及其下游通路的激活，可抑制腫瘤細(xì)胞耐藥。

研究發(fā)現(xiàn)，中藥可以有效抑制PI3K/AKT 通路，并延緩EGFR-TKI 耐藥的出現(xiàn)。中藥單體葫蘆素E 和楊梅黃酮的組合物可以抑制NSCLC PI3K/AKT/雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞自噬與活化[3]。重樓的單體成分重樓皂苷Ⅵ可以抑制PI3K/AKT 和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MEK）/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）對(duì)MTOR 的正向調(diào)節(jié)，同時(shí)激活A(yù)MP 依賴的蛋白激酶（AMPactivated protein kinase，AMPK）對(duì)MTOR 的負(fù)向調(diào)節(jié)，通過多種途徑誘導(dǎo)NSCLC 細(xì)胞凋亡和自噬[4]。上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院徐振曄教授研制的肺巖寧方[5]、浙江省中醫(yī)院舒琦瑾教授研制的養(yǎng)陰解毒湯[6]以及臨床常用中成藥復(fù)方苦參注射液[7]均可顯著下調(diào)H1975 耐藥細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT 的水平，通過阻止PI3K/AKT 活化促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制耐藥細(xì)胞體外增殖。藤黃的活性成分藤黃酸在與埃克替尼聯(lián)合應(yīng)用時(shí)也被觀察到了同樣的磷酸化抑制效應(yīng)[8]。

此外，另有研究發(fā)現(xiàn)第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）和程序性死亡受體4（programmed cell death 4，PDCD4）作為負(fù)向調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路的主要蛋白，與EGFR-TKI 耐藥性的產(chǎn)生密切相關(guān)[9]。金復(fù)康口服液與吉非替尼聯(lián)合應(yīng)用可以有效提高接種過PC9/R 耐藥細(xì)胞的裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)抑制率，推測(cè)其機(jī)制可能與下調(diào)腫瘤組織中p-AKT 水平，上調(diào)PTEN、PDCD4等抑癌基因的表達(dá)有關(guān)[10]。進(jìn)一步檢測(cè)其上游微小RNA（microRNA，miRNA）發(fā)現(xiàn)，金復(fù)康口服液增強(qiáng)PTEN 的效應(yīng)極有可能是通過降低miRNA-21 的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的[11]。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明EGFR 下游的PI3K/AKT 信號(hào)通路是中藥發(fā)揮延緩耐藥效應(yīng)的重要靶點(diǎn)，中藥可以抑制其過度激活，日后應(yīng)更加深入地探索該通路被抑制的具體機(jī)制。

1.2 抑制促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路

MAPK 是絲-蘇氨酸蛋白激酶家族的一員，主要有4 個(gè)亞群，分別是ERK、c-Jun 氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、p38 激酶和ERK5。研究發(fā)現(xiàn)，MAPK 通路的異常激活是EGFR-TKI 獲得性耐藥產(chǎn)生的重要原因[12]。

姜黃提取物β-欖香烯具有較好的抗耐藥效應(yīng)，聯(lián)合厄洛替尼可以顯著抑制H1975 耐藥細(xì)胞生長(zhǎng)，推測(cè)機(jī)制可能與下調(diào)p-ERK、p-EGFR、p-MTOR 表達(dá)，促進(jìn)耐藥細(xì)胞凋亡有關(guān)[13]。參芪扶正注射液可以通過降低p-EGFR、p-MEK 和p-ERK 水平，抑制MAPK/甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子1（sterol regulatory element binding transcription factor 1，SREBP1）通路的激活，促進(jìn)PC-9/GR 細(xì)胞凋亡，從而增強(qiáng)NSCLC 對(duì)吉非替尼的敏感性[14]。金花茶提取物可以通過抑制MAPK 和PI3K/AKT 通路發(fā)揮抗NSCLC 的作用，提示其可能具有延緩EGFR-TKI耐藥的潛力[15]。上述結(jié)果表明，中藥可以顯著下調(diào)MAPK 的表達(dá)，與EGFR-TKI 聯(lián)合應(yīng)用起到增效的作用，進(jìn)而延緩耐藥。其中，姜黃、金花茶等藥食同源類中藥的使用將為NSCLC 的防治提供更加安全而多樣的選擇。

1.3 抑制Janus 激酶（Janus kinase，JAK）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）通路

STAT3 是STAT 家族中的一員，可以通過調(diào)控B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化，其異常激活往往與獲得性耐藥關(guān)系密切[16]。

Zhou 等[17]發(fā)現(xiàn)，黃連解毒湯可以通過降低耐藥肺癌細(xì)胞中p-STAT3 的水平發(fā)揮類似siSTAT3 的效應(yīng)，進(jìn)而激活胱天蛋白酶（caspase）3 等凋亡相關(guān)蛋白，抑制Bcl-2、Ki-67 等抗凋亡蛋白的表達(dá)，由此誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)NSCLC 對(duì)厄洛替尼的敏感性。沈存思等[18]將適宜濃度的高良姜素與吉非替尼聯(lián)合應(yīng)用于A549 細(xì)胞時(shí)亦觀察到上述STAT3 磷酸化被抑制的現(xiàn)象，表明JAK-STAT3 可能是中藥延緩一代、二代EGFR-TKI 耐藥的共同靶點(diǎn)。Yu等[19]發(fā)現(xiàn)，葫蘆素B 可通過上調(diào)miRNA-175p 抑制PC9/GR 細(xì)胞中STAT3 活化，降低吉非替尼耐藥細(xì)胞的存活率。Wang 等[20]發(fā)現(xiàn)，扶正抗癌方可以通過抑制STAT3 表達(dá)，激活凋亡通路，增強(qiáng)吉非替尼的療效。蔡雪婷等[21]發(fā)現(xiàn)，雙氫青蒿素可在不影響TKI 活性的前提下，通過抑制STAT3 提高肺癌細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性。綜上所述，中藥通過抑制JAK/STAT3 通路，可以進(jìn)一步增強(qiáng)EGFR-TKI 的敏感性，有效緩解耐藥。

2 抑制EGFR 旁路代償性激活

除了下游通路外，旁路的代償性激活也是EGFR-TKI 產(chǎn)生耐藥性的重要原因。當(dāng)EGFR 的信號(hào)被TKI 阻斷時(shí)，其他RTK 通路可因反饋機(jī)制而代償性激活或擴(kuò)增。此時(shí)TKI雖然保持著對(duì)EGFR的抑制能力，但異常激活的旁路信號(hào)仍可促進(jìn)下游癌基因的表達(dá)，使得EGFR-TKI 失去抑制腫瘤的藥理效果。目前研究較為清楚的主要有以下3條途徑。

2.1 抑制細(xì)胞間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)換因子（cellular-mesenchymal to epithelial transition factor，c-MET）旁路

c-MET 是由原癌基因MET編碼的具有酪氨酸激酶活性的自主磷酸化跨膜受體，參與細(xì)胞的增殖、分化、遷移、侵襲等多種生理過程，其大量擴(kuò)增是EGFR-TKI 獲得性耐藥的最常見機(jī)制。陳琦等[22]發(fā)現(xiàn)，β-欖香烯與吉非替尼聯(lián)合應(yīng)用可顯著降低PC-9 耐藥細(xì)胞的存活率，推測(cè)機(jī)制可能與p-MET 和p-AKT 蛋白表達(dá)受抑制有關(guān)。Kim 等[23]發(fā)現(xiàn)，中藥峨?yún)⒌幕钚猿煞秩パ豕砭识舅兀╠eoxypodophyllotoxin，DPT）可以顯著抑制MET 激酶活性，降低p-MET 及其下游蛋白磷酸化erb-b2 受體酪氨酸激酶3（erb-b2 receptor tyrosine kinase 3，ERBB3）的表達(dá)水平，從而誘導(dǎo)NSCLC 吉非替尼耐藥株HCC827GR 細(xì)胞凋亡。Oh 等[24]發(fā)現(xiàn)，峨?yún)⒌牧硪环N活性成分鬼臼毒素（podophyllotoxin，PPT）也可以通過抑制c-MET 激酶活性誘導(dǎo)吉非替尼耐藥細(xì)胞凋亡。Zheng 等[25]發(fā)現(xiàn)，扶正抗癌方通過下調(diào)c-MET的mRNA 水平和啟動(dòng)子活性，降低c-MET 蛋白的表達(dá)量，進(jìn)而增強(qiáng)厄洛替尼對(duì)耐藥NSCLC 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。以上文獻(xiàn)說明中藥可以通過抑制c-MET基因表達(dá)、降低c-MET 激酶活性來改善EGFR-TKI 耐藥。

2.2 抑制AXL 受體酪氨酸激酶（AXL receptor tyrosine kinase，AXL）旁路

AXL 是受體酪氨酸激酶TAM 家族中的一員，介導(dǎo)與腫瘤相關(guān)的多種轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)通路的激活。研究表明，EGFR-TKI 耐藥的NSCLC 中存在AXL 的異常激活[26]。Lee 等[27]發(fā)現(xiàn)，雷公藤紅素可以通過抑制AXL的表達(dá)恢復(fù)耐藥的NSCLC細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性。Kim 等[28]發(fā)現(xiàn)，槲寄生提取物可以在順鉑耐藥細(xì)胞和厄洛替尼耐藥細(xì)胞中阻斷生長(zhǎng)抑制特異性蛋白6（growth arrest specific 6，GAS6）與配體AXL結(jié)合，同時(shí)通過抑制AXL表達(dá)來治療耐藥的NSCLC。這些研究以AXL通路為靶點(diǎn)，為克服NSCLC EGFR-TKI的耐藥提供了天然候選藥物。

2.3 抑制其他旁路

Wang 等[29]發(fā)現(xiàn)，丹參酮可以通過顯著降低耐藥細(xì)胞株內(nèi)p-血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）和p-AKT 的表達(dá)來增加其對(duì)吉非替尼的敏感性，提示丹參酮逆轉(zhuǎn)耐藥可能與抑制VEGFR2/AKT 途徑有關(guān)。蔣立峰等[30]發(fā)現(xiàn)，將清肺化瘀解毒方和吉非替尼聯(lián)合應(yīng)用于吉非替尼獲得性耐藥細(xì)胞株A549/R 后可以抑制其增殖并誘導(dǎo)凋亡，同時(shí)伴有胰島素樣生長(zhǎng)因子1 受體（insulin like growth factor 1 receptor，IGF1R）蛋白及mRNA 表達(dá)的下調(diào)，表明清肺化瘀解毒方逆轉(zhuǎn)耐藥的機(jī)制與下調(diào)IGF1R 及其下游通路有關(guān)。

綜上所述，中藥復(fù)方或活性成分可通過直接靶向PI3K/AKT、MAPK、JAK/STAT3 等EGFR 下游通路，或抑制c-MET、AXL、VEGFR、IGF1R 等旁路，抑制耐藥腫瘤細(xì)胞增殖，增強(qiáng)NSCLC 細(xì)胞對(duì)EGFR-TKI 的敏感性，從而延緩、改善獲得性耐藥，為NSCLC 的中醫(yī)治療提供了依據(jù)與方向。中藥通過抑制EGFR 下游通路及旁路延緩耐藥的具體機(jī)制詳見圖1。

圖1 中藥通過抑制EGFR下游通路及旁路延緩耐藥的作用機(jī)制

3 抑制上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）

EMT 是上皮細(xì)胞通過去分化逐漸獲得間質(zhì)細(xì)胞表型的生物學(xué)過程，與EGFR-TKI 獲得性耐藥密切相關(guān)。Yuan 等[31]將葫蘆素B 作用于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）誘導(dǎo)的吉非替尼耐藥細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-鈣黏蛋白和波形蛋白等表達(dá)降低，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣黏蛋白等表達(dá)升高，說明葫蘆素B 具有抑制耐藥細(xì)胞EMT 的功效，機(jī)制可能與抑制活性氧（reactive oxygen species，ROS）和PI3K/AKT/MTOR 通路有關(guān)。Peng 等[32]通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蘆薈大黃素可以阻斷PI3K/AKT/扭曲家族bHLH 轉(zhuǎn)錄因子1（twist family bHLH transcription factor 1，TWIST1）通路，逆轉(zhuǎn)EMT，增加耐藥細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性。類似地，昆布提取物巖藻黃質(zhì)可以抑制EMT并阻斷PI3K/AKT/核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，阻止腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，與吉非替尼聯(lián)合應(yīng)用可以更顯著地抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[33]。黃芪多糖可以通過降低程序性死亡受體配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也稱PD-L1）和SREBP1 的表達(dá)，抑制PD-L1/SREBP1/EMT 信號(hào)通路，進(jìn)而抑制EMT 過程，改善肺腺癌細(xì)胞對(duì)吉非替尼的抵抗[34]。綜上所述，中藥可以通過抑制EMT，抑制腫瘤細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變，從而延緩EGFR-TKI 耐藥。

4 表觀遺傳調(diào)控

表觀遺傳調(diào)控是當(dāng)前NSCLC EGFR-TKI 耐藥性研究的熱點(diǎn)。它指的是在不改變EGFR基因序列的前提下，通過基因表達(dá)模式的演變，即DNA 甲基化、非編碼RNA 調(diào)控、組蛋白乙酰化等過程，誘導(dǎo)NSCLC 產(chǎn)生耐藥性。研究表明，表觀遺傳改變是NSCLC 靶向治療獲得性耐藥的重要機(jī)制之一，針對(duì)表觀遺傳的藥物可以在一定程度上延緩或逆轉(zhuǎn)EGFR-TKI 相關(guān)的獲得性耐藥。

Liu 等[35]研究發(fā)現(xiàn)，β-欖香烯與吉非替尼聯(lián)合應(yīng)用可以通過降低甲基轉(zhuǎn)移酶3，N6-腺苷-甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體催化亞基（methyltransferase 3, N6-adenosine-methyltransferase complex catalytic subunit，METTL3）的表達(dá)來抑制N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）甲基化，從而抑制自噬相關(guān)蛋白5（autophagy related protein 5，ATG5）和自噬相關(guān)蛋白7（autophagy related protein 7，ATG7）的表達(dá)，阻止耐藥腫瘤細(xì)胞自噬。此外，Cheng 等[36]發(fā)現(xiàn)，β-欖香烯還可以通過下調(diào)H3K27 的甲基轉(zhuǎn)移酶zeste2多梳抑制復(fù)合體2 亞基增強(qiáng)子（enhancer of zeste 2 polycomb repressive complex 2 subunit，EZH2）的表達(dá)來抑制NSCLC 的干細(xì)胞樣特征，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。除了通過抑制甲基化改善耐藥，Dai等[37]發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷Ⅳ可以上調(diào)NSCLC細(xì)胞中一種NAD+依賴性Ⅲ類脫乙酰酶沉默調(diào)節(jié)蛋白6（sirtuin 6，SIRT6）的mRNA表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)NSCLC對(duì)吉非替尼的增敏效應(yīng)。Wu等[38]發(fā)現(xiàn)，治癌名方消積湯可能通過抑制HOX 轉(zhuǎn)錄反義RNA（HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）的表達(dá)，從而抑制核轉(zhuǎn)錄因子Sp1 轉(zhuǎn)錄因子（Sp1 transcription factor，SP1）的表達(dá)來增強(qiáng)吉非替尼對(duì)肺癌耐藥細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，從長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）的角度揭示了中藥改善耐藥的全新分子機(jī)制。以上研究說明，中藥可以通過調(diào)節(jié)DNA甲基化、組蛋白乙酰化、lncRNA表達(dá)等方式，調(diào)控表觀遺傳信息，發(fā)揮延緩耐藥的效應(yīng)。

5 小結(jié)與展望

綜上所述，中藥可以廣泛作用于EGFR 通路上的不同環(huán)節(jié)，從多種途徑緩解EGFR-TKI 獲得性耐藥，提高靶向藥物的普遍療效。然而，目前對(duì)于中藥延緩EGFR-TKI 耐藥的實(shí)驗(yàn)研究尚存不足：①在作用機(jī)制的研究上，現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)對(duì)常見的耐藥機(jī)制研究較為深入，但缺乏對(duì)罕見耐藥靶點(diǎn)的關(guān)注。②在信號(hào)通路的研究上，部分實(shí)驗(yàn)僅觀察到中藥抑制某條信號(hào)通路的現(xiàn)象，卻沒有進(jìn)一步探索中藥抑制該信號(hào)通路的原因。這使得同一中藥的不同作用機(jī)制間很難建立聯(lián)系，不利于系統(tǒng)化研究。未來的研究應(yīng)創(chuàng)新思路，在確保中醫(yī)藥臨床療效的前提下，以多靶點(diǎn)、多通路的模式更加全面、深入地探討中藥改善耐藥的作用機(jī)制，為中醫(yī)藥與EGFR-TKI 的聯(lián)合治療方案開拓更加廣闊的應(yīng)用前景。