人工膝關節(jié)不同體外磨損周期的UHMWPE磨屑特征及細胞毒性研究

付松卿 ,王 松 ,陳 凱 ,張 述 ,秦 穎 ,彭業(yè)萍 ,劉偉強,2

(1.清華大學 機械工程系,北京 100084;2.深圳清華大學研究院 生物醫(yī)用材料及植入器械實驗室,廣東 深圳 518057;3.中國礦業(yè)大學 材料與物理學院,江蘇 徐州 221116;4.天津醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心,天津 300384;5.天津科技大學 生物工程學院,天津 300457;6.深圳大學 機電與控制工程學院 廣東省電磁控制與智能機器人重點實驗室,廣東 深圳 518060)

隨著全球人口老齡化加劇，骨關節(jié)炎逐漸成為最主要的致殘性疾病之一[1].人工關節(jié)置換術則是1種專門針對終末期骨關節(jié)炎的成熟治療方法.膝關節(jié)作為骨關節(jié)炎最常見的發(fā)病部位之一，每年都有大量患者接受人工膝關節(jié)置換[2].用于置換術的人工關節(jié)材料需要滿足輕量化和生物相容性好等要求.自Charnley型人工髖關節(jié)誕生以來，人工關節(jié)材料從不銹鋼發(fā)展到鈷合金、高分子聚合物和生物陶瓷等，而目前廣泛應用的人工膝關節(jié)假體則由鈷合金和超高分子量聚乙烯(UHMWPE)制成[3].UHMWPE憑借其優(yōu)異的機械性能和生物相容性，在人工膝關節(jié)領域得到大量研究，并常制成脛骨襯墊與鈷合金股骨髁配合[4].人工膝關節(jié)的長期可靠性對于患者極為重要，研究表明大部分的膝關節(jié)翻修是由人工關節(jié)無菌性松動引起的，而磨屑誘導的假體周圍骨溶解是導致無菌性松動的首要原因[5].由于UHMWPE的耐磨性比鈷合金更差，人工膝關節(jié)假體磨損產(chǎn)生的磨屑也主要源于UHMWPE[6].因此，當前人工膝關節(jié)磨屑的研究主要聚焦于UHMWPE磨屑的定量表征.

采用人工膝關節(jié)摩擦磨損試驗機開展體外磨損試驗已成為研究磨屑生成和特征分析的主要方法，但對不同磨損周期下UHMWPE磨屑的數(shù)量、尺寸、形狀和分布等特征的定量研究仍較少.一方面是由于體外磨損試驗一般采用小牛血清溶液作為潤滑液，其中的血清蛋白等生物大分子會對磨屑提取產(chǎn)生嚴重干擾，需要通過使其中的生物大分子水解或變性降解的方式將其與磨屑分離，試驗流程較為復雜[7].另一方面，磨屑數(shù)量眾多，對其形態(tài)和尺寸等特征的定量提取較為繁瑣.鑒于此，本研究中通過酸處理法分離生物潤滑液中的人工膝關節(jié)UHMWPE磨屑，并結合自主開發(fā)的磨屑特征識別算法對磨屑的掃描電子顯微鏡(SEM)照片進行分析，揭示人工膝關節(jié)不同體外磨損周期下UHMWPE磨屑特征.

此外，考慮到UHMWPE磨屑會誘導成纖維細胞吞噬異物并引起其凋亡，這一生物作用機制也是導致骨溶解現(xiàn)象出現(xiàn)的重要原因之一[8].因此，本研究中系統(tǒng)開展不同尺寸和濃度的UHMWPE磨屑對小鼠成纖維細胞的細胞毒性的影響，以期為未來人工膝關節(jié)設計和使用提供理論支持.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

人工膝關節(jié)體外模擬磨損試驗選擇CoCrMo合金為股骨髁和高交聯(lián)超高分子量聚乙烯(UHMWPE)脛骨襯墊配副的人工關節(jié)來開展，CoCrMo股骨髁為鑄造鈷鉻鉬合金，購買自施樂輝醫(yī)用產(chǎn)品國際貿(mào)易(上海)有限公司，UHMWPE脛骨襯墊由江蘇德鍵醫(yī)療科技發(fā)展有限公司提供.CoCrMo股骨髁表面粗糙度不大于0.05 μm，UHMWPE脛骨襯墊表面糙度不大于0.3 μm.人工膝關節(jié)摩擦磨損試驗機(Simulation Solution Ltd，UK)具有6個自由度和5個軸，能同時實現(xiàn)軸向力(A/F)、外展和內(nèi)收(A/A)、上彎屈伸展擺動(F/E)、下試樣扭轉和下試樣前后方向位移(A/P)的加載功能，試驗加載參考 ISO 14243 標準中規(guī)定的膝關節(jié)運動標準曲線，磨損周期為500萬次.潤滑液為去離子水與新生牛血清(杭州四季青)按體積比為1:1的混合溶液，其蛋白質(zhì)濃度約為20 g/L，添加適量慶大霉素-兩性霉素混合溶液以防潤滑液在試驗過程中變質(zhì)(1 L上述潤滑液加入100 mg慶大霉素和25 mg兩性霉素).試驗過程中每隔50萬次磨損周期取1次含有磨屑的潤滑液，并注入新的潤滑液.試驗中分別選取磨損周期為100萬次、200萬次、300萬次、400萬次和500萬次的潤滑液這5組試樣作為磨屑樣本來源.

由于難以控制試驗中分離所得到磨屑的尺寸和濃度，因此選擇了尺寸分別為5、10和 25 μm和納米級的UHMWPE顆粒代替UHMWPE磨屑，并利用完全培養(yǎng)基將其濃度分別配置為0.1、0.5和2.5 mg/mL，因此得到12組用于細胞毒性試驗的試樣.細胞毒性試驗的試驗對象為小鼠成纖維細胞L929.

1.2 試驗方法

1.2.1 磨屑分離

試驗中采用酸處理法將人工膝關節(jié)UHMWPE磨屑從潤滑液中分離出來，具體步驟如圖1所示.首先取2 mL含有人工膝關節(jié)磨屑的潤滑液，超聲振蕩1 h使其分散均勻，將震蕩后的潤滑液加入8 mL體積分數(shù)為37%的濃鹽酸中，并在60 ℃水浴條件下處理1 h.待處理后的溶液冷卻至室溫，再將其以10 000 r/min的轉速離心處理2 h.由于UHMWPE密度較小且略低于水，離心后大部分的UHMWPE磨屑分布在離心管上層[9]，取1 mL上層懸浮液，并用50倍體積的甲醇稀釋懸浮液[10].超聲振蕩1 h稀釋后的懸浮液，使磨屑重新分散均勻，用孔徑為0.05 μm的聚碳酸酯膜對液體進行真空抽濾，再將聚碳酸酯膜轉移進通風櫥干燥12 h，便可得到分離提純的UHMWPE磨屑.在分離過程中，應當注意避免各步驟中溶液和儀器與外界發(fā)生接觸，以免引入雜質(zhì)影響后續(xù)觀測效果.對前文中所述5組試樣分別重復3次此操作后，得到15張附著UHMWPE磨屑的聚碳酸酯膜，并進行電鏡形貌分析.

Fig.1 Separation steps of UHMWPE wear debris:(a) ultrasonic oscillation;(b) heating in water bath;(c) high-speed centrifugation;(d) dilution with methanol;(e) vacuum filtration;(f) drying圖1 UHMWPE磨屑分離步驟：(a)超聲振蕩；(b)鹽酸水浴；(c)高速離心；(d)甲醇稀釋；(e)真空抽濾；(f)通風干燥

1.2.2 磨屑的SEM照片處理

本研究中用掃描電子顯微鏡(SEM)進行UHMWPE磨屑形貌觀測.首先，用碳膠帶將干燥后附有磨屑的聚碳酸酯膜粘貼在顯微鏡樣品臺上，再進行鍍層厚度5 nm左右的噴金處理，使聚合物表面具備導電性.之后將其移入掃描電子顯微鏡樣品室進行觀察，加速電壓為5 keV，放大50 000倍左右.為了保證觀測結果的隨機性，采用一定規(guī)律在每個樣品的36個特定位置進行觀察，并獲得磨屑的SEM照片.

對于UHMWPE磨屑形貌觀測后獲得的SEM照片，需要對其中的所有磨屑進行目標檢測和輪廓提取，從而獲得其各項特征尺寸數(shù)據(jù).由于磨屑照片和背景差異較為顯著，利用機器學習的方法，可以獲得快速且優(yōu)異的處理效果.在本研究中使用YOLOv4[11]和U-Net[12]網(wǎng)絡來處理UHMWPE磨屑照片，其中前者用于進一步確定單個磨屑在照片上的位置和區(qū)域，后者用于提取磨屑的輪廓，算法處理效果如圖2所示.獲得磨屑照片輪廓坐標數(shù)據(jù)后，結合照片比例尺等信息，可以計算得出磨屑的各項尺寸數(shù)據(jù)，如面積(A)、長徑(dmax)、短徑(dmin)、長寬比(r)、圓度(R)、矩形度(Re)和形狀因子(F)等.

醫(yī)學模擬教學（simulation based medical education，SBME）是通過模擬技術對患者、臨床進行模擬操作，仿真的進行治療，創(chuàng)造出高真模擬場景，進行臨床教學和試驗的教學方式[1]。該種教學方式的重復性較好，訓練的內(nèi)容比較真實，規(guī)范性高，成本較低，因此能夠有較高的應用價值，能夠讓醫(yī)學生對基本的操作規(guī)范進行掌握，具有很大的優(yōu)勢，可以彌補教學病種的缺失，診療病例不足等問題，提升學生的綜合操作能力和處理能力[2-3]，現(xiàn)在臨床教學中已經(jīng)有比較多的應用。模擬人為主的教學模式得到了醫(yī)學教育界的廣泛認可[4]。此次主要是對模擬教學應用于全科醫(yī)學專業(yè)研究生教學的效果進行探討分析。

Fig.2 Effect of contour extraction:(a) SEM micrograph of wear debris;(b) contour of wear debris圖2 輪廓提取效果：(a)磨屑電鏡圖像；(b)磨屑輪廓

1.2.3 磨屑細胞毒性

將培養(yǎng)好的小鼠成纖維細胞制備成濃度為5×105mL-1的細胞懸液，再將細胞懸液接種至96孔板.向64個孔中加入90 μL細胞懸液，其中48個作為試驗組(Mimic)，16個作為對照組(Control)；向另外16個孔中加入90 μL完全培養(yǎng)基，作為空白組(Blank).向48個試驗組孔內(nèi)加入10 μL試樣，12組試樣每組重復4次，并向剩下32個孔內(nèi)加入10 μL完全培養(yǎng)基.培養(yǎng)細胞24 h后，向各孔加入10 μL CCK-8(Cell counting Kit-8)試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h使培養(yǎng)液充分發(fā)生顯色反應，如圖3所示.使用熒光顯微鏡觀測和記錄細胞生長形態(tài)，并利用酶標儀測定培養(yǎng)液光密度(Optical density,OD)，將光密度數(shù)據(jù)平均值代入如下公式，即可計算出小鼠成纖維細胞增殖率(P).

Fig.3 Cytotoxicity analysis according to the color development of 96-well plate culture medium圖3 根據(jù)96孔板培養(yǎng)液顯色進行細胞毒性分析

2 結果與討論

2.1 不同體外磨損周期的UHMWPE磨屑特征

針對5組潤滑液樣本，共收集到540張SEM照片，從中提取了1 217粒磨屑輪廓，基于后驗知識和能譜分析，除去259個在形態(tài)、尺寸和元素構成上異常的顆粒數(shù)據(jù)，獲得了958個有效磨屑輪廓數(shù)據(jù).在958個有效磨屑中，來自100萬、200萬、300萬、400萬和500萬磨損周期潤滑液的分別是137個、189個、245個、261個和126個，可見隨著磨損循環(huán)次數(shù)增加，磨屑生成數(shù)量呈現(xiàn)先增多后減少的趨勢.

在磨屑尺寸數(shù)據(jù)方面，本研究中重點關注磨屑長徑這一最為關鍵的特征，即磨屑輪廓上任意連線經(jīng)過質(zhì)心的兩點間最大歐式距離，后文如未特別指定，尺寸均指磨屑長徑.不同體外磨損周期的UHMWPE磨屑尺寸分布如圖4所示，圖中Mc為數(shù)量單位“百萬次”.從圖4中可以看出45.6%的磨屑長徑小于1 μm，14.1%的磨屑長徑為1～5 μm，11.0%的磨屑長徑為5～10 μm，11.6%的磨屑長徑為10～25 μm，17.7%的磨屑長徑大于25 μm.此外，無論磨屑來自哪個磨損周期，都以長徑小于1 μm的占比最多，且到磨損后期時(400萬次和500萬次)，納米級磨屑占比急劇增加，甚至達到80%以上，而尺寸大于10 μm的磨屑大多來自磨損早期.因此，可以得出結論，磨損過程中納米級磨屑占比始終在30%以上，且隨著磨損周期增加，納米級磨屑占比逐漸增加.

Fig.4 Size distribution of UHMWPE wear debris in different million cycles in vitro圖4 不同體外磨損周期的UHMWPE磨屑尺寸分布

在磨屑形狀方面，ASTM F1877-16標準中定性地給出了顆粒物的形狀類別，但并未具體說明如何根據(jù)磨屑的特征參數(shù)來進行定量的分類，標準中磨屑的形狀分類仍然較為主觀.McMullin等[13]結合ASTM F1877標準和受試者判斷，開發(fā)了基于統(tǒng)計的方法，將超高分子量聚乙烯磨屑的形狀與尺寸數(shù)據(jù)定量地聯(lián)系了起來.本研究中根據(jù)實際的觀測情況和歸納推理，對磨屑的外形進行了分類，由整理得到的長寬比、圓度和矩形度等磨屑幾何參數(shù)得出的分類邏輯，即圓度大于0.9的歸為球狀，其余磨屑中矩形度大于0.8的歸為片狀，其中長寬比大于2.5的歸為桿狀，矩形度小于0.4的歸為纖維狀，其余磨屑中圓度大于0.3且矩形度大于0.5的歸為顆粒狀，剩下不便分類的作為其他.

不同形狀磨屑的典型SEM照片如圖5所示.從圖5中可以發(fā)現(xiàn)：球狀磨屑表面非常光滑，且尺寸基本小于1 μm，形狀較為規(guī)則；片狀磨屑表面紋理光滑，厚度較小，邊緣也較為平整，尺寸也以1 μm以下為主；纖維狀磨屑表面紋理平整且光滑，邊緣有卷曲現(xiàn)象，尺寸在1～5 μm；桿狀磨屑體態(tài)較大，表面粗糙但邊緣比較平整，尺寸多大于10 μm且可達數(shù)十微米；顆粒狀磨屑厚度較大，邊緣較平齊但表面粗糙，切削感嚴重，且尺寸分布較廣，從納米級到數(shù)十微米；其他磨屑表面較為粗糙，厚度適中，邊緣存在一定的折疊和卷曲，部分呈現(xiàn)出撕裂感.

Fig.5 Different shapes of UHMWPE wear debris:(a) spherical;(b) flakes;(c) fibrillar;(d) rods;(e) granular;(f) others圖5 不同形狀的UHMWPE磨屑：(a)球狀；(b)片狀；(c)纖維狀；(d)桿狀；(e)顆粒狀；(f)其他

根據(jù)試驗結果繪制不同磨損周期下的人工膝關節(jié)UHMWPE磨屑形狀數(shù)量分布如圖6所示.不同周期產(chǎn)生的磨屑形狀都以顆粒狀占比最高.從整體上來看，顆粒狀磨屑數(shù)量占比達62%，其次為占比12%的球狀磨屑，片狀、纖維狀和桿狀等類型磨屑則較少.對比不同周期下產(chǎn)生磨屑的形狀，可以看出隨著磨損周期數(shù)的增加，球狀磨屑占比不斷增加而纖維狀磨屑占比不斷減少；在100萬次磨損周期下產(chǎn)生的桿狀磨屑略多而片狀磨屑較少，隨著磨損周期增加，這2種形狀的磨屑占比變化不大，且均較少.

Fig.6 Shape distribution of UHMWPE wear debris圖6 UHMWPE磨屑形狀分布

2.2 不同尺寸和濃度的UHMWPE磨屑細胞毒性

Fig.7 Average cell proliferation rate of mouse fibroblasts cultured with UHMWPE wear debris at different particle sizes and concentrations圖7 不同尺寸和濃度下UHMWPE磨屑培養(yǎng)小鼠成纖維細胞的細胞增殖率

圖8所示為熒光顯微鏡下觀察到的不同尺寸和濃度的UHMWPE磨屑培養(yǎng)小鼠成纖維細胞的細胞形態(tài)照片.可以看出，圖8(c)中死亡的細胞最多，視野中已出現(xiàn)大量細胞凋亡后的深色殘余物，且?guī)缀鯖]有正常增殖的細胞，圖8(b)中大部分細胞形態(tài)呈現(xiàn)為圓形，證明較多的細胞瀕臨死亡，圖8(b)和圖8(c)中對應的均是納米級磨屑，且濃度分別是0.5和2.5 mg/mL.而同樣采用納米級磨屑的圖8(a)中對應磨屑濃度為0.1 mg/mL，其細胞增殖狀態(tài)更好，這同時也驗證了前文中所述納米級顆粒毒性最強且濃度越大細胞毒性越強的結果.圖8(f)中展示了UHMWPE磨屑尺寸較小(5 μm)但濃度較大(2.5 mg/mL)時細胞的培養(yǎng)情況，其中的細胞相對圖8(d)和圖8(e)也出現(xiàn)了更多的圓形形態(tài)，這也證明了圖7的結論，即對5 μm的磨屑而言，同樣是磨屑濃度越大，細胞毒性越強.其他試樣的細胞形態(tài)大部分呈現(xiàn)梭形，證明細胞增殖情況良好.

Fig.8 Fluorescent micrographs of cell morphology of mouse fibroblasts cultured with UHMWPE debris at different sizes and concentrations圖8 不同尺寸和濃度下UHMWPE磨屑培養(yǎng)小鼠成纖維細胞的細胞形態(tài)的熒光顯微鏡照片

2.3 討論

本研究中得到了不同體外磨損周期的UHMWPE磨屑，從磨屑形狀上看，絕大部分為不規(guī)則的顆粒狀，也有小部分球狀和片狀磨屑，以及極少數(shù)的桿狀和纖維狀磨屑.此外，不同體外磨損周期產(chǎn)生的磨屑在數(shù)量、尺寸和形狀等特征上也存在顯著差異：從數(shù)量上看，在400萬次體外磨損周期之前，由于UHMWPE襯墊表面仍存在粗糙峰，由于疲勞和熱效應，材料磨損情況會隨著周期數(shù)增加而趨于嚴重，產(chǎn)生的磨屑數(shù)量也逐漸增多，而后材料表面的粗糙峰去除，變得更加光滑，產(chǎn)生的磨屑數(shù)量又開始減少；從尺寸上看，產(chǎn)生的大多數(shù)磨屑長徑在5 μm以下，且隨著磨損周期增加，磨損形式由磨粒磨損向疲勞和黏著磨損過渡，UHMWPE主要由切削去除變?yōu)轲ぶ撀?，小尺寸磨屑的比例迅速增大；從形狀上看，結合不同形狀的典型SEM照片，可以推知顆粒狀磨屑在磨損的各個時期都會大量產(chǎn)生，尺寸較大的纖維狀和桿狀磨屑則主要產(chǎn)生于磨粒磨損階段，而球狀磨屑主要產(chǎn)生于疲勞和黏著磨損階段，因此隨著周期數(shù)的增加，纖維狀和桿狀磨屑占比減少而球狀磨屑占比增加.Chen等[14]的研究指出，人工膝關節(jié)UHMWPE假體的主要磨損機制是磨粒磨損和疲勞磨損.此外，還有大量體外研究[15-17]表明人工膝關節(jié)磨屑形狀和尺寸分布范圍與本文中得到的結果吻合.除了膝關節(jié)以外，人工髖關節(jié)也是最常被置換的關節(jié).在Wu等[18]和Zohdi等[19]針對髖關節(jié)UHMWPE磨屑的研究中同樣指出磨屑的尺寸為微納米級，但髖關節(jié)磨屑整體尺寸略小于本文中提取得到的膝關節(jié)磨屑尺寸，后者的研究中也提出隨著周期增加，髖關節(jié)UHMWPE磨屑的平均粒徑減小.

在細胞毒性方面，UHMWPE磨屑尺寸和濃度均對小鼠成纖維細胞有顯著影響，劉鵬等[20]指出磨屑可以通過影響成纖維細胞來引起骨代謝失衡.從尺寸上看，納米級磨屑的細胞毒性最大，且比尺寸為5、10和25 μm的磨屑毒性要顯著得多.Musib等[21]認為磨屑的細胞毒性與細胞自身尺寸有關：小鼠成纖維細胞本身尺寸為20～30 μm，能夠容易吞噬1 μm以下磨屑，進而刺激凋亡進程表達，但更大的磨屑很難被吞噬且無直接的生理毒性.有學者認為，納米級顆粒更具有生物毒性，其激活的炎癥反應會帶來更高的骨溶解發(fā)生率[22].濃度方面，在試驗設計的濃度范圍內(nèi)，UHMWPE磨屑的細胞毒性隨著磨屑濃度的增大而加劇，但與納米級別尺寸的磨屑相比，微米級別尺寸的磨屑細胞毒性隨濃度加劇的程度不如前者.

盡管本研究中為人工膝關節(jié)UHMWPE磨屑的分離和分析提供了可行的思路和解決方案，并且揭示了不同體外磨損周期的UHMWPE磨屑特征和尺寸以及濃度等對細胞毒性的影響規(guī)律，但未來仍有如下問題需要進一步開展：(1)增加磨屑樣本量；(2)減少磨損循環(huán)取樣周期；(3)構建不同磨損周期下的UHMWPE磨屑圖譜.

3 結論

通過提取不同體外磨損周期下的人工膝關節(jié)UHMWPE磨屑，對其形狀、尺寸和數(shù)量等特征進行分析，并針對UHMWPE磨屑探究對小鼠成纖維細胞的細胞毒性，得出以下結論：

a.人工膝關節(jié)體外磨損的UHMWPE磨屑形狀特征為顆粒狀磨屑占比可達62%，其次為占比12%的球狀磨屑，片狀、纖維狀和桿狀等類型磨屑則較少.

b.不同磨損周期下的UHMWPE磨屑尺寸特征為磨損過程中納米級磨屑占比始終在30%以上，且隨著磨損周期增加，納米級磨屑占比逐漸增加，最高可以達到80%.

c.不同磨損周期下的UHMWPE磨屑數(shù)量特征為隨著磨損周期增加，磨屑數(shù)量呈現(xiàn)先增多后減少趨勢.

d.磨屑細胞毒性方面，納米級磨屑細胞毒性最強，隨著磨屑尺寸從5到25 μm增加，細胞毒性逐漸減小；在0.1～2.5 mg/mL濃度范圍內(nèi)，細胞毒性基本遵循磨屑濃度越大毒性越強的規(guī)律.