維生素E 穩(wěn)定型高交聯(lián)聚乙烯人工膝關(guān)節(jié)磨屑的分離提取

鄭 曄, 黃秀玲, 馮 景, 朱俊俊, 華子愷

(上海大學(xué)機電工程與自動化學(xué)院, 上海 200444)

近年來, 隨著老齡人口增多、骨關(guān)節(jié)疾病發(fā)病率逐年上升, 人工關(guān)節(jié)置換術(shù)需求也隨之?dāng)U大. 人工膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的10 a 存活率為90% 以上[1], 盡管如此, 仍有患者需要術(shù)后翻修. 隨著人工關(guān)節(jié)置換術(shù)數(shù)量的不斷增加, 失效的絕對數(shù)量仍然較大. 有文獻報道, 70%的翻修手術(shù)是由無菌性松動引起的[2]. 磨損產(chǎn)生的磨屑在假體松動的發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵性作用[3].尤其是聚乙烯(polyethylene, PE) 磨屑, 數(shù)量多(70%～90%), 分布廣, 可以引起假體周圍骨界面附近的生物學(xué)反應(yīng), 繼發(fā)骨溶解并最終導(dǎo)致假體無菌性松動, 進而制約人工假體的使用壽命[4-8]. 因此, 研究人工關(guān)節(jié)假體材料及其磨屑尤為重要.

超高分子量聚乙烯(ultra high molecular weight polyethylene, UHMWPE) 磨屑已被大量研究, 并形成了標(biāo)準(zhǔn)分離提取方法——ISO 17853:2011. 隨著人工關(guān)節(jié)材料的更新?lián)Q代, 一種抗氧化、低磨損的維生素E 穩(wěn)定型高交聯(lián)聚乙烯(vitamin E stabilized highly cross-linked polyethylene, VE/HXLPE) 出現(xiàn). VE/HXLPE 人工關(guān)節(jié)的磨損率明顯低于UHMWPE[9], 但VE/HXLPE 磨屑同樣存在無菌性松動和骨溶解風(fēng)險. 此外, VE/HXLPE 磨屑是否可以用現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)提取還未知, 且潤滑介質(zhì)降解后的取樣量對磨屑表征影響尚無全面、系統(tǒng)的研究. 針對以上問題, 本工作將通過實驗探究現(xiàn)有的磨屑提取方法是否適用于低磨損VE/HXLPE 膝關(guān)節(jié)磨屑, 并分析潤滑介質(zhì)降解后的消化液取樣量對其磨屑數(shù)量、體積和形貌特征等的影響.

1 實驗材料與方法

1.1 方案設(shè)計

基于ISO 17853:2011 標(biāo)準(zhǔn), UHMWPE 磨屑的分離提取一般包括2 個步驟: 血清的消化和磨屑的收集. 消化血清的方法有鹽酸消化法和NaOH 消化法, 其中酸消化法對血清蛋白清除效率較高、成本低、易操作, 是聚乙烯磨屑分離提取的首選方法.

采用酸消化法對潤滑介質(zhì)中的VE/HXLPE 膝關(guān)節(jié)磨屑進行提取, 標(biāo)準(zhǔn)方法的步驟如下:①將冷凍的固態(tài)小牛血清(內(nèi)含磨屑) 從冰柜中取出, 刮掉表面沉積物后在常溫下解凍10 h;②將血清均勻攪拌5 min 并量取10 mL, 使取樣具有代表性; ③取40 mL 鹽酸溶液(體積分數(shù)為37%) 與10 mL 血清混合, 50?C 水浴恒溫攪拌1 h, 得到淺紫色消化液; ④取0.5 mL 消化液加至100 mL 無水甲醇溶液中攪拌均勻, 通過0.05 μm 聚碳酸酯濾膜真空抽濾, 濾膜上的顆粒即為提取的磨屑.

圖1 為不同取樣量VE/HXLPE 磨屑的掃描電鏡(scanning electron microscope, SEM)圖. 可以看出:取樣量0.5 mL 時提取的VE/HXLPE 膝關(guān)節(jié)磨屑在低倍和高倍SEM 圖中均難以達到表征數(shù)量(見圖1(a)). VE/HXLPE 人工膝關(guān)節(jié)磨損量低, 直接導(dǎo)致磨屑數(shù)量減少. 分析標(biāo)準(zhǔn)方法中與磨屑數(shù)量有關(guān)的參數(shù)可知, 消化液取樣量直接影響呈現(xiàn)在濾膜上的磨屑數(shù)量.

圖1 VE/HXLPE 磨屑SEM 圖像Fig.1 SEM images of VE/HXLPE debris

研究磨屑群體可以克服磨屑研究的隨機性, 能夠更客觀、全面反映人工關(guān)節(jié)磨損過程的演變規(guī)律. 我們推測消化液取樣量的變化會影響磨屑的數(shù)量, 從而最終影響磨屑的表征. 因此, 將標(biāo)準(zhǔn)方法步驟④中的取樣量新增4 組(1.0、2.0、4.0 和6.0 mL), 探究取樣量對低磨損VE/HXLPE 人工膝關(guān)節(jié)磨屑數(shù)量、體積、形貌特征等的影響. 由圖1(b) 可知, 若僅改變?nèi)恿繛?.0 mL, SEM 圖像中的磨屑數(shù)量明顯增加.

1.2 實驗方法

1.2.1 磨屑的制備、分離與提取

采用Orthotek 實驗室的人工膝關(guān)節(jié)磨損試驗機(型號JointWear-K4301), 以小牛血清為潤滑介質(zhì), 根據(jù)ISO 14243-3 進行總循環(huán)次數(shù)為500 萬次的金屬股骨髁和VE/HXLPE 脛骨襯墊配副的人工膝關(guān)節(jié)步態(tài)體外磨損試驗, 每50 萬次循環(huán)使用450 mL 小牛血清, 在每50 萬次結(jié)束后暫停設(shè)備回收小牛血清潤滑介質(zhì)(內(nèi)含磨屑) 并及時放入冰箱冷凍保存, 直至達到總循環(huán)次數(shù). 表1 為試驗參數(shù). 選取第450 萬次～第500 萬次循環(huán)(此階段處于穩(wěn)定磨損狀態(tài))產(chǎn)生的磨屑進行分析. 試驗結(jié)束后, 采用標(biāo)準(zhǔn)方法以不同取樣量提取磨屑進行研究.

表1 試驗參數(shù)Table 1 Test parameters

1.2.2 磨屑的觀測與表征

裁剪帶有磨屑的濾膜, 并用碳膠粘貼在鋁塊上. 為使磨屑具有導(dǎo)電性, 需要對濾膜進行噴金處理. 使用日本JEOL 公司的JSM-7500F 冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡對磨屑進行觀測, 放大倍數(shù)為5 000～10 000 倍, 加速電壓為5 keV, 每個樣品均在視野范圍內(nèi)隨機獲取20 張清晰圖像.

利用圖像分析軟件Image-Pro Plus 將磨屑從圖像中分離, 得到磨屑的數(shù)量、最大直徑dmax、最小直徑dmin、周長P、長度L、寬度W、面積A (見圖2), 并計算等效圓直徑DEC、縱橫比RA、延伸率E、圓度R 和形狀因子FF等參數(shù), 對磨屑尺寸、形狀進行描述.

圖2 磨屑參數(shù)Fig.2 Wear debris parameters

根據(jù)圖像區(qū)域內(nèi)的平均磨屑數(shù)量nm, 計算不同取樣量下濾膜上的磨屑總數(shù)nT:

式中: SL為每張濾膜的有效過濾面積; SP有每張圖像面積.

根據(jù)圖像區(qū)域內(nèi)的平均磨屑體積Vm, 計算不同取樣量下濾膜上的磨屑總體積VT. 原子力顯微鏡觀測到磨屑厚度h 可通過線性回歸法確定為約等于磨屑等效圓直徑DEC的1/3[10], 據(jù)此估算獲得的磨屑體積:

式中: nP為圖像數(shù).

等效圓直徑DEC是與磨屑投影面積相等的圓的直徑, 是衡量磨屑尺寸的一個重要參數(shù):

縱橫比RA是描述磨屑形狀的常用參數(shù):

式中: dmax是磨屑輪廓上任意兩點之間所能畫出的最長直線距離; dmin是垂直于大直徑的最長直線距離.

延伸率E 與RA類似, 更適用于描述長形磨屑, 尤其是纖維狀磨屑:

圓度R 用來衡量磨屑與圓的相似程度,

形狀因子FF與R 類似, 對磨屑輪廓的粗糙度變化更為敏感:

將統(tǒng)計到的VE/HXLPE 磨屑進行分析, 得出磨屑參數(shù)的頻率分布圖及箱型圖, 再使用IBM SPSS Statistics 26 軟件分析統(tǒng)計數(shù)據(jù)的顯著差異性. 描述數(shù)據(jù)統(tǒng)計描述的表示形式為m±s (平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差), 數(shù)據(jù)若符合正態(tài)分布且方差齊次, 則采用單因素方差分析(analysis of variance, ANOVA); 若不符合正態(tài)分布則采用曼-惠特尼-U 非參數(shù)檢驗. 檢驗水準(zhǔn)設(shè)定α=0.05.

2 結(jié)果與分析

2.1 磨屑觀測

圖3 為不同取樣量下提取的VE/HXLPE 人工膝關(guān)節(jié)磨屑的SEM 圖像. 由圖3 可以看出: 磨屑均呈白色不透明狀; 放大5 000 倍時, 磨屑密度隨著取樣量的增加而增大, 并呈不規(guī)則的類球形、片狀、棒狀或絲狀, 形狀復(fù)雜且表面粗糙. 在0.5、1.0、2.0 mL 取樣量下, 磨屑輪廓清晰且形狀完整, 但在4.0、6.0 mL 取樣量下, 磨屑出現(xiàn)團聚狀態(tài), 顆粒重疊、輪廓模糊, 干擾后續(xù)的計數(shù)與表征. 這可能是由于磨屑經(jīng)抽濾方式沉降時, 過量磨屑重疊分布于濾膜. 圖4 為團聚磨屑的SEM 圖像. 可以看出: 4.0、6.0 mL 組的濾膜孔徑模糊不清, 磨屑輪廓模糊且呈團聚態(tài); 對于相互纏繞的纖維狀磨屑, 其數(shù)量統(tǒng)計和形貌表征均受到嚴重影響.

圖4 團聚磨屑的SEM 圖像Fig.4 SEM image of agglomerated debris

SEM 圖像模糊也可能是小牛血清中未消化的蛋白質(zhì)所致. 蛋白質(zhì)降解是磨屑提取的首要環(huán)節(jié), 本實驗采用酸消化法降解蛋白質(zhì). 強酸降解蛋白質(zhì)操作簡單、時間短、效率高, 但降解蛋白質(zhì)的效率并非100%. 張濤[11]用50 mL 濃鹽酸在60?C 水浴中攪拌降解10 mL 的小牛血清溶液1 h, 結(jié)果顯示溶液中蛋白質(zhì)的消化率最高時為71.87%, 表明仍有部分蛋白質(zhì)包覆于磨屑上. 圖5 為未降解網(wǎng)狀蛋白質(zhì)包覆磨屑的SEM 圖像. 可以看出, 磨屑邊緣和濾膜的分界模糊, 導(dǎo)致SEM 圖像上可統(tǒng)計的磨屑少. 因此, 本工作僅對取樣量為0.5、1.0、2.0 mL 組別進行分析討論.

2.2 磨屑鑒定

圖6 為隨機域中顆粒在濾波器上的X 射線能譜分析. 可以看出, 各組譜圖均顯示C 元素峰最明顯, O 元素峰次之, 無明顯的Co、Cr、Ti、Mo 元素峰. 表2 給出了隨機域中顆粒不同元素的質(zhì)量分數(shù). 由表2 可知, C、O 元素的質(zhì)量分數(shù)合計高達99%, Co、Cr、Ti、Mo 元素的質(zhì)量分數(shù)合計不足1%. 本實驗中關(guān)節(jié)配副材料為金屬與聚乙烯, 能譜顯示磨屑主要由非金屬元素組成, 由此可判斷分離提取的顆粒為聚乙烯磨屑(含C、H 元素). 質(zhì)量分數(shù)最高的C 元素來自磨屑和濾膜(含C、H、O 元素), 而質(zhì)量分數(shù)較高的O 元素可能來自濾膜.

表2 隨機域中顆粒不同元素的質(zhì)量分數(shù)Table 2_The mass fraction of different elements of the particle in the random domain%

圖6 隨機域中顆粒在濾波器上的能譜分析Fig.6 Energy spectrum analysis of particles on filters in the random domain

2.3 提取方法對磨屑數(shù)量的影響

VE/HXLPE 膝關(guān)節(jié)磨屑以不同取樣量分離提取后, 對其SEM 圖像進行磨屑計數(shù)統(tǒng)計,得到單位圖像區(qū)域內(nèi)磨屑數(shù)量的平均值與標(biāo)準(zhǔn)差(見表3).

表3 每張圖像內(nèi)VE/HXLPE 磨屑數(shù)量Table 3 The quantity of VE/HXLPE debris in each image

掃描電鏡放大5 000 倍時, SP約為420.85 μm2(23.37 μm×17.78 μm), SL約為6 361.73 mm2(45 mm×45 mm×π). 將上述數(shù)據(jù)代入式(1), 計算不同取樣量下提取到的磨屑總數(shù), 并做組間差異性分析以確定磨屑數(shù)量分布是否存在顯著性差異, 結(jié)果如圖7 所示.

圖7 過濾面積內(nèi)的VE/HXLPE 磨屑數(shù)量Fig.7 The quantity of VE/HXLPE debris in the filtration area

由圖7 可知, 磨屑數(shù)量隨取樣量的增加而增加, 但非嚴格按照取樣量的倍增而倍增. 取樣量0.5 mL 代表現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)下VE/HXLPE 磨屑的提取數(shù)量, 與取樣量1.0、2.0 mL 組之間均存在顯著性差異(P < 0.05). 以圖像中磨屑數(shù)量估計體外測試中小牛血清所含的全部磨屑數(shù)量,結(jié)果如圖8 所示. 對比標(biāo)準(zhǔn)取樣量0.5 mL 下的VE/HXLPE 磨屑提取數(shù)量, 取樣量1.0 mL組的提取效率為115%, 2.0 mL 組的提取效率為117.5%.

圖8 體外測試小牛血清中的VE/HXLPE 磨屑總數(shù)Fig.8 Total numbers of VE/HXLPE debris in calf serum was tested by vitro test

2.4 提取方法對磨屑體積的影響

VE/HXLPE 膝關(guān)節(jié)磨屑以不同取樣量分離提取后, 對各取樣量下的磨屑體積進行計算,得到每張圖像區(qū)域內(nèi)統(tǒng)計到的平均磨屑體積結(jié)果(見表4).

表4 圖像內(nèi)VE/HXLPE 磨屑平均體積Table 4 Average volume of VE/HXLPE debris in images

通過表4 中的數(shù)據(jù)計算小牛血清中的磨屑總體積,并與體外測試的人工膝關(guān)節(jié)磨損量對比.實驗中VE/HXLPE 人工膝關(guān)節(jié)磨損量為(11.68±3.16)mg/Mc,材料密度為0.940 mg/mm3,可得磨損體積為(12.43±3.36) mm3/Mc. 根據(jù)式(2), 可計算每百萬次循環(huán)后提取磨屑的總體積, 結(jié)果如圖9 所示. 通過計算可知, 當(dāng)取樣量為0.5、1.0、2.0 mL 時, VE/HXLPE 磨屑的提取效率分別為66%、82%、93%.

圖9 不同取樣量下VE/HXLPE 磨屑的總體積Fig.9 Total volumes of VE/HXLPE debris

2.5 提取方法對磨屑形貌的影響

2.5.1 磨屑尺寸

圖10 為本實驗提取磨屑的等效圓直徑DEC分布情況. 可以看出, VE/HXLPE 磨屑的尺寸分布范圍廣泛, DEC為0.1～10.0 μm, 其中90% 以上為0.1～1.0 μm, 小于1.0 μm 或大于10.0 μm 的磨屑較少, 這與文獻[12] 中給出的磨屑尺寸范圍一致. 由于小尺寸磨屑數(shù)量多, 大尺寸磨屑數(shù)量少, 磨屑尺寸與磨屑數(shù)量之間呈右偏峰態(tài)分布. 另外, 各取樣量下的磨屑大多為0.1～0.5 μm.

圖10 VE/HXLPE 磨屑的DEC 分布Fig.10 DEC distribution of VE/HXLPE debris

磨屑尺寸是決定細胞活性的關(guān)鍵因素, 分布大多為微米級(>1.0 μm)、亞微米級(0.1～1.0μm) 和納米級(<100 nm). 0.1～10 μm 的磨屑可刺激巨噬細胞吞噬, 引起炎癥/細胞因子的產(chǎn)生, 從而導(dǎo)致骨溶解, 其中亞微米級磨屑(0.1～1.0 μm) 的生物活性更高[13-15]. 臨床上已發(fā)現(xiàn)較小的磨屑更易從植入部位移動擴散, 且臨界尺寸為0.2～0.8 μm 的磨屑更是引起生物反應(yīng)的關(guān)鍵[16]. 表5 為不同取樣量下VE/HXLPE 磨屑尺寸. 通過以上分析可知, 磨屑尺寸均在活性范圍內(nèi), 故取樣量對尺寸所決定的磨屑生物活性無明顯影響.

表5 VE/HXLPE 磨屑尺寸Table 5 VE/HXLPE debris sizes

2.5.2 磨屑形狀

磨屑的形狀對細胞活性的影響不可忽視. 較多研究表明, 細長形磨屑比球形磨屑生物活性更活躍, 可刺激細胞分泌更高水平的炎癥因子[17]. RA與E 均為表征磨屑形狀是否為細長形的參數(shù), 值從1 開始, 值越大代表磨屑形狀越偏細長, 生物活性也越高. 圖11 為各取樣量下磨屑形狀參數(shù)RA、E、R、FF的箱型圖. 表6 為磨屑各形狀參數(shù)的平均值. 由圖11 和表6 可知,0.5 mL 下VE/HXLPE 磨屑的RA和E 平均值最大, 2.0 mL 組磨屑的RA和E 平均值較大.根據(jù)RA將磨屑分為類球狀和纖維狀, 若RA>2, 則磨屑為纖維條狀(包含條狀、棒狀及部分片塊狀顆粒); 若RA≤2, 則磨屑為類球狀[18]. 根據(jù)上述分類, 本工作中, 0.5 mL 組纖維條狀磨屑占比10.71%, 而2.0 mL 組纖維條狀磨屑占比11.60%.

表6 VE/HXLPE 磨屑形狀參數(shù)的平均值Table 6 Average values of shape parameters of VE/HXLPE debris

圖11 VE/HXLPE 磨屑形狀參數(shù)Fig.11 Shape parameters of VE/HXLPE debris

R 與FF是衡量磨屑形狀與圓的相似程度, 值為0～1. R 與FF的值越接近1 表示磨屑形狀越偏向圓形, 其生物活性也越低; 而值越接近0, 磨屑的生物活性越高. 由圖11 和表6可知, VE/HXLPE 磨屑在取樣量2.0 mL 的R 和FF平均值分布與0.5 mL 組無顯著性差異(P >0.05), 而與1.0 mL 組存在顯著性差異(P <0.05).

3 結(jié) 論

本工作通過實驗探究了現(xiàn)行磨屑提取方法是否適用于低磨損VE/HXLPE 膝關(guān)節(jié)磨屑,同時分析了消化液取樣量對提取磨屑各表征參數(shù)的重要影響. 結(jié)果表明: 改變磨屑提取方法中的取樣量會影響提取的磨屑數(shù)量、體積及形貌分布. 采用現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)可提取到的VE/HXLPE 磨屑數(shù)量較少, 難以達到表征數(shù)量, 增大消化液取樣量能夠提取到更多的低磨損VE/HXLPE 膝關(guān)節(jié)磨屑, 更全面地表征磨屑群體, 為VE/HXLPE 人工膝關(guān)節(jié)產(chǎn)品應(yīng)用提供更全面有價值的參考.