血清lncRNA TGFB2-AS1水平與冠狀動(dòng)脈鈣化及其嚴(yán)重程度的關(guān)系

回振宇,張文娟,李 陽(yáng)

冠狀動(dòng)脈鈣化(coronary artery calcification,CAC)是動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)的一種病理現(xiàn)象,其可降低血管壁的順應(yīng)性、彈性,可引發(fā)心血管事件[1-2]。CAC不僅與糖尿病、年齡等相關(guān),還與長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)異常表達(dá)、血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)表型轉(zhuǎn)化等有關(guān)[3-4]。研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)是TGF-β家族的一員,其在血管鈣化中水平較高,TGF-β1可能參與并影響血管鈣化過(guò)程[5];而lncRNA TGFB2-反義RNA 1(lncRNA TGFB2-antisense RNA 1, lncRNA TGFB2-AS1)可負(fù)性調(diào)節(jié)TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)[6]。但lncRNA TGFB2-AS1在CAC中的表達(dá)水平及其與CAC嚴(yán)重程度的關(guān)系尚不明確?；诖?本研究探討lncRNA TGFB2-AS1在CAC病人中的表達(dá)情況,分析lncRNA TGFB2-AS1與CAC嚴(yán)重程度的關(guān)系,以期為診斷CAC并評(píng)估CAC病人病情程度提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年5月—2021年7月于丹東市第一醫(yī)院行CT、冠狀動(dòng)脈造影檢查的病人185例為研究對(duì)象,男115例,女70例;年齡40～72(57.14±12.78)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):1)受試者對(duì)本研究知情同意;2)臨床檢查資料齊全;3)受試者行CT、冠狀動(dòng)脈造影檢查。排除標(biāo)準(zhǔn):1)既往接受過(guò)冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)者;2)合并甲狀腺功能亢進(jìn)、急慢性感染者;3)合并結(jié)締組織病、骨代謝疾病及肝、腎功能不全者;4)合并心律失常、腫瘤者;5)合并貧血性疾病或嚴(yán)重血液病者;6)伴有嚴(yán)重心力衰竭,左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)<35%者。本研究獲得了本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集

收集病人入院24 h內(nèi)、健康者體檢當(dāng)日4～5 mL外周血,靜置28～31 min,分離血清(4 500 r/min離心6 min),分裝,置于-70 ℃冰箱待用。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)法檢測(cè)血清lncRNA TGFB2-AS1表達(dá)水平

解凍適量血清,以TRIzol LS Reagent(美國(guó)Invitrogen公司,10296010)抽提總RNA;之后,以First Strand cDNA Synthesis Kit(上?？道噬锟萍加邢薰?KL411A)制備cDNA;最終,以QuantiNova SYBR Green RT-PCR Kit(德國(guó)Qiagen公司,208152)配制擴(kuò)增體系,并以qRT-PCR儀(美國(guó)ABI公司,StepOne TM)擴(kuò)增cDNA,獲取循環(huán)閾值CT。qRT-PCR儀參數(shù):97.2 ℃ 7 min;95 ℃ 30 s,64 ℃ 25 s,62.5 ℃ 15 s,40個(gè)循環(huán)。lncRNA TGFB2-AS1引物序列:正向5′-AGGGAGTGTGGAAATGAGG-3′,反向5′-GGGTTTGGGAGTACATTCAAC-3′;GAPDH引物序列:正向5′- ACGGATTTGGTCGTATTGGGCG -3′,反向5′- GCTCCTGGAAGATGGTGATGGG -3′。血清lncRNA TGFB2-AS1相對(duì)表達(dá)量以2-△△CT法計(jì)算。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定血清TGF-β1水平

采用人TGF-β1ELISA試劑盒(武漢益普生物科技有限公司,YX-E10113)配制TGF-β1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,解凍血清樣本,酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司,Infinite 200 Pro)測(cè)定TGF-β1血清樣本、標(biāo)準(zhǔn)品溶液在波長(zhǎng)450 nm處的吸光度,繪制TGF-β1回歸曲線,依據(jù)TGF-β1標(biāo)準(zhǔn)回歸方程,計(jì)算血清TGF-β1水平。

1.2.4 CAC積分

利用CT機(jī)(美國(guó)通用電氣公司,GE Lightspeed)進(jìn)行冠狀動(dòng)脈CT檢查掃描。掃描參數(shù):螺距為0.516∶1,轉(zhuǎn)速為0.35 s/r,電流為400～500 mA,層厚為0.65 mm,電壓為120 kV。掃描范圍:從氣管隆突處到心臟膈面向下2 cm處。由2位專(zhuān)業(yè)醫(yī)師對(duì)右冠狀動(dòng)脈、左前降支、左主干、左回旋支及其分支進(jìn)行鈣化程度評(píng)估。以Agaston積分方法計(jì)算鈣化積分[7-8],鈣化積分=鈣化面積×鈣化灶最大CT值(要求:鈣化面積>1 mm2,CT值>130 Hu),且若鈣化灶最大CT值為130～199 Hu、>199～299 Hu、>299～399 Hu、>399 Hu則分別定義為1分、2分、3分、4分。

按病人是否發(fā)生CAC分為非CAC組(47例)與CAC組(138例),收集兩組高血壓、體質(zhì)指數(shù)(body mass index, BMI)、總膽固醇(total cholesterin, TC)、糖尿病、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)、冠心病、三酰甘油(triacylglycerol, TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)、吸煙、空腹血糖等資料。依據(jù)鈣化積分將CAC組病人分為輕度CAC組(鈣化積分<100分,47例)、中度CAC組(100分≤鈣化積分<400分,48例)、重度CAC組(鈣化積分≥400分,43例)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 CAC組、非CAC組臨床資料比較

與非CAC組比較,CAC組病人高血壓、LDL-C水平、糖尿病、冠心病差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),性別、TC、吸煙、BMI、TG、年齡、HDL-C、空腹血糖比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 CAC組、非CAC組臨床資料比較

2.2 兩組血清lncRNA TGFB2-AS1、TGF-β1水平比較

與非CAC組比較,CAC組血清lncRNA TGFB2-AS1表達(dá)水平降低(P<0.05),TGF-β1水平升高(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 兩組血清lncRNA TGFB2-AS1、TGF-β1水平比較(±s)

2.3 不同CAC嚴(yán)重程度病人血清lncRNA TGFB2-AS1、TGF-β1水平比較

與輕度CAC組比較,中度、重度CAC組病人血清lncRNA TGFB2-AS1表達(dá)水平降低(P<0.05),TGF-β1水平升高(P<0.05);與中度CAC組比較,重度CAC組病人血清lncRNA TGFB2-AS1表達(dá)水平降低(P<0.05),TGF-β1水平升高(P<0.05)。詳見(jiàn)表3。

表3 不同CAC嚴(yán)重程度病人血清lncRNA TGFB2-AS1、mRNA及TGF-β1水平比較(±s)

2.4 CAC病人血清lncRNA TGFB2-AS1表達(dá)水平與TGF-β1的相關(guān)性

Pearson法分析顯示,CAC病人血清lncRNA TGFB2-AS1表達(dá)水平與TGF-β1呈負(fù)相關(guān)(r=-0.589,P<0.001)。詳見(jiàn)圖1。

圖1 CAC病人血清lncRNA TGFB2-AS1水平與TGF-β1的相關(guān)性

2.5 血清lncRNA TGFB2-AS1表達(dá)水平對(duì)CAC的診斷價(jià)值

ROC曲線分析顯示,血清lncRNA TGFB2-AS1表達(dá)水平診斷CAC的曲線下面積(area under curve,AUC)為0.905[95%CI(0.844,0.966)],截?cái)嘀禐?.78,約登指數(shù)為0.707,其敏感度為83.0%,特異度為87.7%。詳見(jiàn)圖2。

圖2 血清lncRNA TGFB2-AS1表達(dá)水平診斷CAC的ROC曲線

3 討 論

CAC是鈣鹽在冠狀動(dòng)脈壁上沉積的一種病理變化,是動(dòng)脈粥樣硬化的重要特征,與心血管事件發(fā)生率相關(guān)[9]。此外,卿平等[7]研究顯示,高血壓、糖尿病等是CAC發(fā)生的危險(xiǎn)因素。本研究顯示CAC組病人高血壓、LDL-C、糖尿病、冠心病高于非CAC組,與卿平等[7]研究結(jié)果部分一致,表明了解病人基礎(chǔ)病并監(jiān)控LDL-C水平有利于臨床及時(shí)防治CAC。因此,積極尋找與CAC發(fā)生相關(guān)的機(jī)制,對(duì)防治CAC、降低心血管事件發(fā)生率甚為重要。

TGF-β1是一種細(xì)胞因子,其可調(diào)節(jié)VSMC增殖、遷移,影響細(xì)胞外基質(zhì)降解、合成,參與免疫炎癥反應(yīng),與動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、CAC等關(guān)系密切[10-11]。研究發(fā)現(xiàn),TGF-β1不僅可促使VSMC向成骨樣細(xì)胞分化,還可促進(jìn)VSMC鈣化[12]。另外,TGF-β1在慢性腎臟病中呈高水平,而血管舒縮素可通過(guò)抑制TGF-β1表達(dá)進(jìn)而抑制VSMC鈣化,TGF-β1可能是治療慢性腎臟病病人血管鈣化的潛在靶標(biāo)[13]。本研究中CAC組病人血清TGF-β1水平較高,與Zhao等[5]研究結(jié)果相似,且CAC越嚴(yán)重,病人血清TGF-β1水平越高,提示TGF-β1可能與CAC進(jìn)程密切相關(guān),TGF-β1具有評(píng)估CAC嚴(yán)重程度的潛在價(jià)值,推測(cè)高水平TGF-β1可能通過(guò)影響VSMC增殖、遷移及其向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)型,進(jìn)而影響CAC病變過(guò)程。

lncRNA是一類(lèi)可調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)、影響VSMC表型轉(zhuǎn)換的非編碼RNA分子,與冠心病、CAC、腦梗死等有關(guān)[14-15]。lncRNA TGFB2-AS1是lncRNA家族的一員,其在肺腺癌中表達(dá)失調(diào),可能是治療肺腺癌的潛在靶標(biāo)[16];另外,Liu等[17]研究發(fā)現(xiàn),lncRNA TGFB2-AS1可通過(guò)調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖、凋亡,進(jìn)而影響肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展,其為治療肝細(xì)胞癌提供新思路。Papoutsoglou等[6]認(rèn)為lncRNA TGFB2-AS1與TGF-β有關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程有關(guān),而lncRNA TGFB2-AS1與CAC的關(guān)系尚不清楚,故本研究探討了lncRNA TGFB2-AS1與CAC的相關(guān)性,結(jié)果顯示,lncRNA TGFB2-AS1在CAC病人血清中呈低表達(dá),且血清lncRNA TGFB2-AS1表達(dá)水平隨CAC嚴(yán)重程度加重而降低,提示lncRNA TGFB2-AS1可能與CAC病變進(jìn)程有關(guān),lncRNA TGFB2-AS1有望成為評(píng)估CAC嚴(yán)重程度的標(biāo)志物。分析可能原因,lncRNA TGFB2-AS1作為lncRNA家族的成員,其可能通過(guò)調(diào)控VSMC表型轉(zhuǎn)換、影響相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程,進(jìn)而影響CAC的病理過(guò)程。多層螺旋CT是診斷血管鈣化的重要手段,但其價(jià)格昂貴,臨床應(yīng)用受限。故本研究分析了血清lncRNA TGFB2-AS1診斷CAC的價(jià)值,結(jié)果顯示,血清lncRNA TGFB2-AS1診斷CAC的AUC為0.905,當(dāng)lncRNA TGFB2-AS1相對(duì)表達(dá)量<0.78時(shí),CAC發(fā)生概率較高,提示lncRNA TGFB2-AS1對(duì)CAC有一定診斷價(jià)值,測(cè)定血清lncRNA TGFB2-AS1表達(dá)水平有助于臨床診斷CAC,lncRNA TGFB2-AS1有望成為診斷CAC的輔助指標(biāo)。

本研究分析CAC病人血清lncRNA TGFB2-AS1表達(dá)水平與TGF-β1的相關(guān)性,結(jié)果顯示,血清lncRNA TGFB2-AS1表達(dá)水平與TGF-β1呈負(fù)相關(guān),提示lncRNA TGFB2-AS1可能與TGF-β1共同參與CAC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程,推測(cè)lncRNA TGFB2-AS1通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β1相關(guān)信號(hào)通路,進(jìn)而影響CAC過(guò)程,其機(jī)制有待深入探究。

CAC病人血清lncRNA TGFB2-AS1表達(dá)水平較低,與TGF-β1呈負(fù)相關(guān),且血清lncRNA TGFB2-AS1、TGF-β1水平與CAC嚴(yán)重程度相關(guān),lncRNA TGFB2-AS1可作為臨床診斷CAC并評(píng)估其嚴(yán)重程度的參考指標(biāo)。但由于本項(xiàng)研究經(jīng)費(fèi)和時(shí)間限制,未深入探討lncRNA TGFB2-AS1在CAC中的機(jī)制,且樣本較少,有待后續(xù)擴(kuò)大樣本量進(jìn)行深入探究。