基于NRG-1/ErbB信號通路探討黃芪多糖對心肌缺血再灌注損傷大鼠的影響

黃莉芳,劉超權(quán)

心血管疾病是全球死亡的首要病因,隨著我國經(jīng)濟的迅速發(fā)展、人口老齡化等進程的加快,心血管疾病發(fā)病率持續(xù)增長,目前,患病總數(shù)已達2.9億例,其中1 100萬例為冠心病病人,已成為嚴重的公共衛(wèi)生問題[1]。溶栓、冠狀動脈旁路移植術(shù)、經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)(PCI)等血運重建醫(yī)學技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展,可有效解決缺血心肌的血液灌注問題,減輕缺血相關(guān)損傷,但血液供應(yīng)重新恢復(fù)也可能導(dǎo)致心肌損傷的加重,引發(fā)心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI)[2-3]。MIRI是難以避免的病理損傷,嚴重影響治療效果,是臨床治療中亟待解決的難點。目前,臨床針對MIRI采用的治療策略主要包括缺血或藥物預(yù)適應(yīng)、抗氧自由基、抑制細胞內(nèi)鈣超載、微血管內(nèi)皮細胞保護藥物等[4]。中藥以作用靶點多、起效環(huán)節(jié)眾、副作用小等特點在MIRI的防治中彰顯優(yōu)勢,也是目前研究的熱點。黃芪多糖為中藥黃芪的活性成分之一,研究顯示,其對于MIRI大鼠損傷的心肌具有一定的逆轉(zhuǎn)作用,但具體作用機制尚未明確[5]。本研究基于神經(jīng)調(diào)節(jié)因子-1(NRG-1)/表皮生長因子受體(ErbB)信號通路探討黃芪多糖對MIRI大鼠的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

無特定病原體(SPF)級健康雄性SD大鼠70只,體質(zhì)量220～260(243.62±12.83)g,購自中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所,動物許可證號:SCXK(滇)K2019-0002。所有大鼠于動物實驗室內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實驗。

1.2 主要藥品、試劑與儀器設(shè)備

注射用黃芪多糖,規(guī)格:每瓶250 mg,批準文號:國藥準字Z20040086,生產(chǎn)批號:20200417,天津賽諾制藥有限公司生產(chǎn),采用生理鹽水稀釋,濃度為20、40mg/mL,現(xiàn)用現(xiàn)配。NRG-1重組蛋白,規(guī)格:每瓶10 μg,純度>95%～98%,貨號:ICA866Hu01,購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司。磷酸緩沖鹽溶液(PBS)(武漢益普生物科技有限公司);RIPA裂解液、含吐溫-20的Tris緩沖鹽水(TBST)(定州百克賽斯生物科技有限公司);大鼠天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、心肌鈣蛋白T(cTnT)酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)試劑盒(上海莼試生物技術(shù)有限公司);原位細胞凋亡(TUNEL)檢測試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒、免疫組化試劑盒(武漢極捷生物技有限公司);硝酸纖維(NC)膜(博奧派克生物);考馬斯亮藍法蛋白水平測試盒、一步法凝膠制備試劑盒(北京雷根生物技術(shù)有限公司);兔抗大鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、NRG-1、磷酸化表皮生長因子受體2(p-ErbB2)、B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2關(guān)聯(lián)X蛋白(Bax)抗體、肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體(武漢菲恩生物科技有限公司);辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG(青木生物技術(shù)有限公司);超敏ECL化學發(fā)光底物(北京四正柏生物科技有限公司)。TG16-WS型離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司),XSP-63X型熒光顯微鏡(上海光學儀器廠),BIOBASE2000型全自動酶免分析系統(tǒng)(意大利DAS公司),SE600型電泳儀、TE77XP型半干轉(zhuǎn)膜儀系統(tǒng)(美國Hoefer公司),Image QuantLAS4000型化學發(fā)光成像分析儀(美國GE公司)。

1.3 造模及給藥方法

參考文獻[6]方法將大鼠隨機分為對照組、模型組、黃芪多糖低濃度組、黃芪多糖高濃度組及陽性對照組,每組14只。對照組進行假手術(shù),其余各組采用左前降支結(jié)扎建立心肌缺血再灌注損傷大鼠模型。所有大鼠禁食不禁水12 h,按350 mg/kg腹腔注射10%水合氯醛麻醉完全后仰臥固定,連接呼吸機、心電圖機,沿胸骨正中線縱向打開胸腔,暴露心臟,確定左前降支走向,將6-0縫合線從左心耳根部下緣2 mm處進入到肺動脈圓錐邊緣穿出;模型組、黃芪多糖低濃度組、黃芪多糖高濃度組及陽性對照組將細小乳膠管墊在縫合線上并結(jié)扎左前降支,此時心電圖ST段應(yīng)抬高,心臟顏色逐漸青紫或蒼白,30 min后將結(jié)扎線打開,再灌注120 min,此時心電圖ST段應(yīng)逐漸下降>50%;對照組僅作套環(huán)而不結(jié)扎左前降支。

造模前30 d,模型組、對照組和陽性對照組大鼠分別按1 mL/kg尾靜脈注射生理鹽水,術(shù)后每日1次注射;黃芪多糖低濃度組、黃芪多糖高濃度組分別按1 mL/kg尾靜脈注射20、40 mg/mL黃芪多糖溶液,術(shù)后每日1次注射。造模前30min,陽性對照組給予4 μg/kg NRG-1溶液尾靜脈注射,術(shù)后每日1次注射。各組均連續(xù)干預(yù)30 d。

1.4 標本采集與處理[7]

造模后,采集腹主動脈血5 mL,不抗凝,待凝固后3 000 r/min離心20 min收集上血清,凍存于-80 ℃環(huán)境。處死大鼠取心臟,4 ℃生理鹽水洗凈,切取左前降支結(jié)扎處以下的左心室、心尖組織,其中1/2經(jīng)10%中性甲醛固定后制成厚度為4 μm的石蠟切片用于TUNEL染色、免疫組化染色;剩余心肌組織凍存于液氮內(nèi)用于蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測。

1.5 ELISA法檢測大鼠血清AST、LDH、CK-MB、cTnT水平

取出凍存血清,使其恢復(fù)為室溫,按照ELISA試劑盒說明書中的步驟測定血清AST、LDH、CK-MB、cTnT水平。

1.6 TUNEL染色法觀測大鼠心肌組織細胞凋亡情況[8]

取心肌組織石蠟切片,65 ℃烤1 h,置于二甲苯中10 min×3次去除石蠟,之后分別置于100%、95%、80%乙醇中復(fù)水,取出后自來水沖洗,然后置于20 μg/mL蛋白酶K溶液中反應(yīng)20 min(37 ℃),PBS洗滌5 min×3次,置于滲透液內(nèi)8 min再次用PBS洗滌,采用試劑盒配制TUNEL反應(yīng)液,取50 μL滴于切片上,濕盒避光反應(yīng)1 h(37 ℃),PBS洗滌后用3%過氧化氫孵育30 min,再次PBS洗滌,滴加轉(zhuǎn)化劑-過氧化物酶(POD),濕盒避光反應(yīng)20 min(37 ℃),經(jīng)DAB顯色、蘇木素復(fù)染后,常規(guī)封片。在熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果并拍照,記錄凋亡陽性細胞(綠色熒光)數(shù)及總細胞數(shù),細胞凋亡指數(shù)=凋亡陽性細胞/總細胞數(shù)×100%。

1.7 免疫組化染色法檢測大鼠心肌組織Caspase-3表達水平[8]

取心肌組織石蠟切片,脫蠟、復(fù)水同TUNEL染色,置于檸檬酸鹽緩沖液內(nèi)高壓高熱修復(fù)抗原,PBS洗滌后,采用3%過氧化氫孵育30 min去除內(nèi)源性過氧化氫酶,PBS洗滌后置于5%牛血清蛋白溶液內(nèi)封閉1.5 h,PBS洗滌后置于Caspase-3一抗工作液內(nèi)反應(yīng)2 h(室溫),再經(jīng)PBS洗滌后置于二抗工作液內(nèi)反應(yīng)1 h,最后經(jīng)DAB顯色、蘇木素復(fù)染后,常規(guī)封片。在光學顯微鏡下觀察染色結(jié)果并拍照,計數(shù)陽性細胞核(棕黃色染色)數(shù)及總細胞核數(shù),計算Caspase-3陽性表達率。

1.8 Western Blot法測定大鼠心肌組織NRG-1、p-ErbB2、Bcl-2、Bax蛋白表達水平[9]

取凍存心肌組織剪碎,滴加裂解液RIPA勻漿,置于冰上30 min裂解,轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi),12 000 r/min離心5 min(4 ℃),取上清液,用考馬斯亮藍法進行蛋白定量,-80 ℃保存?zhèn)錂z;將制好的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠灌注在電泳玻璃板之間并固定;取蛋白樣本30 μg,與上樣緩沖液混勻,煮沸10 min,冷卻后取上樣;電泳條件為:濃縮膠80 V、30 min,分離膠120 V至溴酚藍跑出;分離獲得的蛋白條帶通過300 mA恒流電轉(zhuǎn)至NC膜上,適當剪裁;NC膜置于封閉液內(nèi)1 h,然后分別置于含有NRG-1、p-ErbB2、Bcl-2、Bax(1∶1 000稀釋)及內(nèi)參β-actin(1∶2 000稀釋)一抗工作液中,于4 ℃密封反應(yīng)16 h;第2天,TBST洗膜5 min×5次,然后置于1∶3 000稀釋的HRP標記的二抗內(nèi),室溫密封反應(yīng)1 h,取出后TBST洗膜5 min×5次;置于用ECL化學發(fā)光底物內(nèi)顯色。采用化學發(fā)光儀顯影同時采集圖像,用Quantity One軟件測定各條帶灰度值,計算NRG-1、p-ErbB2、Bcl-2、Bax灰度值與β-actin的比值。

1.9 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清AST、LDH、CK-MB、cTnT水平比較

與對照組比較,模型組、黃芪多糖低濃度組、黃芪多糖高濃度組及陽性對照組大鼠血清AST、LDH、CK-MB、cTnT水平均升高(P<0.05)。與模型組比較,黃芪多糖低濃度組、黃芪多糖高濃度組及陽性對照組大鼠血清AST、LDH、CK-MB、cTnT水平均降低,且黃芪多糖低濃度組大鼠血清AST、LDH、CK-MB、cTnT水平高于黃芪多糖高濃度組和陽性對照組(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠血清AST、LDH、CK-MB、cTnT水平比較(±s)

2.2 各組大鼠心肌組織細胞凋亡指數(shù)比較

TUNEL染色結(jié)果顯示,與對照組比較,模型組、黃芪多糖低濃度組、黃芪多糖高濃度組及陽性對照組大鼠心肌組織細胞凋亡指數(shù)均明顯升高(P<0.05)。與模型組比較,黃芪多糖低濃度組、黃芪多糖高濃度組及陽性對照組大鼠心肌組織細胞凋亡指數(shù)均降低,且黃芪多糖低濃度組大鼠心肌組織細胞凋亡指數(shù)高于黃芪多糖高濃度組和陽性對照組(P<0.05)。詳見表2、圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織細胞凋亡TUNEL染色結(jié)果(×400)(A為對照組;B為模型組;C為黃芪多糖低濃度組;D為黃芪多糖高濃度組;E為陽性對照組)

表2 各組大鼠心肌組織細胞凋亡指數(shù)比較(±s) 單位:%

2.3 各組大鼠心肌組織Caspase-3陽性表達率比較

免疫組化染色結(jié)果顯示,與對照組比較,模型組、黃芪多糖低濃度組、黃芪多糖高濃度組及陽性對照組大鼠心肌組織Caspase-3陽性表達率明顯升高(P<0.05)。與模型組比較,黃芪多糖低濃度組、黃芪多糖高濃度組及陽性對照組大鼠心肌組織Caspase-3陽性表達率明顯降低,且黃芪多糖低濃度組大鼠心肌組織Caspase-3陽性表達率高于黃芪多糖高濃度組和陽性對照組(P<0.05)。詳見表3、圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織Caspase-3表達檢測結(jié)果(免疫組化染色,×200)

表3 各組大鼠心肌組織Caspase-3陽性表達率比較(±s)

2.4 各組大鼠心肌組織NRG-1、p-ErbB2、Bcl-2、Bax蛋白表達水平比較

與對照組比較,模型組、黃芪多糖低濃度組、黃芪多糖高濃度組及陽性對照組大鼠心肌組織NRG-1、p-ErbB2、Bcl-2表達水平明顯降低,Bax表達水平明顯升高(P<0.05)。與模型組比較,黃芪多糖低濃度組、黃芪多糖高濃度組及陽性對照組大鼠心肌組織NRG-1、p-ErbB2、Bcl-2表達水平明顯升高,Bax表達水平明顯降低,且黃芪多糖低濃度組大鼠心肌組織NRG-1、p-ErbB2、Bcl-2表達水平低于黃芪多糖高濃度組和陽性對照組,Bax表達水平高于黃芪多糖高濃度組和陽性對照組(P<0.05)。詳見表4、圖3。

圖3 各組大鼠心肌組織NRG-1、p-ErbB2、Bcl-2、Bax蛋白表達條帶圖(A為對照組;B為模型組;C為黃芪多糖低濃度組;D為黃芪多糖高濃度組;E為陽性對照組)

表4 各組大鼠心肌組織NRG-1、p-ErbB2、Bcl-2、Bax蛋白表達水平比較(±s)

3 討 論

MIRI多繼發(fā)于缺血性心臟病缺血區(qū)血流灌注恢復(fù)后,是一個復(fù)雜的病理生理變化過程,可表現(xiàn)為血液無復(fù)流、心律失常、心肌頓抑、微循環(huán)障礙等,不僅影響治療效果,還會加重病人病情[10]。MIRI的發(fā)病機制主要涉及過量氧自由基的產(chǎn)生、心肌細胞內(nèi)鈣離子蓄積超載、能量代謝障礙、細胞凋亡以及炎癥反應(yīng)等,這些病理機制既相互關(guān)聯(lián)又相互作用,通常作為切入點來探討心肌防護的新策略[11]。研究顯示,NRG-1/ErbB信號通路具有心肌保護作用,其抗炎、抗凋亡、抗氧化等多方面作用與MIRI的發(fā)病機制相對應(yīng),有望成為MIRI治療的新靶點[12]。

MIRI在中醫(yī)學可歸于“胸痹”“真心痛”“心痛”等范疇,屬于本虛標實之證,且尤以氣虛為主,氣虛無力推動,津血運行不暢,久致瘀血、痰飲,妨礙氣機,不通則痛,發(fā)為本病,故在治療上應(yīng)注重補氣。黃芪為補氣要藥,有補中益氣、升陽固本之效,是臨床治療MIRI的常用中藥之一[13]。黃芪多糖是提取自黃芪的多糖類成分,具有多種藥理作用,在MIRI的治療方面,研究顯示,黃芪多糖可通過多個途徑發(fā)揮其保護作用,如部分抑制p38絲裂原活化蛋白激酶信號通路,阻斷其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),減輕相關(guān)心肌損傷[14];抑制鈣釋放,緩解細胞鈣超載情況,保護線粒體呼吸功能,同時抑制氧自由基過量產(chǎn)生以及線粒體膜電位、膜通透性轉(zhuǎn)換孔異常開放,保護線粒體結(jié)構(gòu),糾正心肌能量代謝紊亂[15-17];激活NRG-1/ErbB及其下游磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號通路,從而抑制心肌細胞凋亡,防治糖尿病心肌病[18]。

本研究采用左前降支結(jié)扎再復(fù)通的方法成功建立了MIRI大鼠模型,使得模型組大鼠血清心肌酶水平較對照組明顯升高,心肌細胞凋亡指數(shù)也明顯增加,證實了MIRI存在心肌受損;而在造模前已經(jīng)接受相應(yīng)藥物干預(yù)的黃芪多糖低濃度組、黃芪多糖高濃度組及陽性對照組,血清AST、LDH、CK-MB、cTnT水平及心肌細胞凋亡指數(shù)均低于模型組,并且黃芪多糖干預(yù)組呈現(xiàn)一定量效關(guān)系,表明黃芪多糖可有效減輕MIRI引起的心肌細胞損傷,抑制心肌細胞凋亡,減輕MIRI病情程度,治療效果與黃芪多糖濃度有一定關(guān)系[19-22]。

NRG-1為跨膜蛋白,屬于表皮生長因子家族的一員,在心臟中一般由微血管內(nèi)皮細胞合成分泌,具有調(diào)節(jié)心肌細胞發(fā)育和成熟,保護維持心肌細胞的功能[23]。ErbB為NRG-1的酪氨酸激酶受體,其中,ErbB2、ErbB4主要表達于成年心臟,NRG-1的心肌保護作用主要通過激活ErbB傳遞信號而實現(xiàn),NRG-1/ErbB與MIRI密切相關(guān),下游的兩條重要信號通路為細胞外信號調(diào)節(jié)激酶通路以及PI3K/AKT[24]。研究顯示,NRG-1可以通過激活PI3K/AKT來調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑Bcl-2、Bax表達,進而抑制心肌細胞凋亡[25-28]。Bcl-2屬于抗凋亡蛋白,對各種原因誘發(fā)的細胞凋亡均有抑制作用;Bax則與之作用相反,Bcl-2減少或Bax增加可開放線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔,促進前凋亡因子合成釋放,激活終末剪切酶Caspase-3,啟動細胞凋亡[29]。研究顯示,抑制線粒體細胞凋亡是NRG-1/ErbB抗MIRI的一種途徑[30]。本研究結(jié)果顯示,與模型組比較,黃芪多糖低濃度組、黃芪多糖高濃度組及陽性對照組大鼠心肌組織Caspase-3陽性表達率降低,心肌組織NRG-1、p-ErbB2、Bcl-2表達水平升高,Bax表達水平降低,表明黃芪多糖可激活NRG-1/ErbB信號通路,上調(diào)心肌組織Bcl-2表達,下調(diào)Bax及Caspase-3表達,對線粒體凋亡途徑發(fā)揮抑制作用,這可能是黃芪多糖保護MIRI心肌的機制之一。

綜上所述,黃芪多糖可減輕心肌缺血再灌注損傷大鼠的心肌損傷,抑制心肌細胞凋亡,其作用可能與激活NRG-1/ErbB信號通路,調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達有關(guān)。