咖啡葉銹病菌單管巢式PCR 檢測(cè)體系的建立與應(yīng)用

吳偉懷，劉寶慧，汪全偉，鹿鵬鵬，賀春萍，梁艷瓊，黃興，易克賢，4※

（1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571101；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，江蘇 南京 210095；3.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技信息研究所，海南 ?？?571101；4.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院三亞研究院，海南 三亞 572000）

由咖啡駝孢銹菌（Hemileia vastatrix）引起的咖啡葉銹病是小粒種咖啡生產(chǎn)中一種毀滅性病害[1-3]。該病害病原的鑒定主要依賴常規(guī)的形態(tài)學(xué)并結(jié)合傳統(tǒng)的鑒別寄主法。該方法需經(jīng)過病原菌的分離或者直接獲得病原菌的孢子，經(jīng)過形態(tài)鑒定，再由科赫氏法則驗(yàn)證，此流程大約需要1 個(gè)月時(shí)間，同時(shí)還要求具備專業(yè)的分類學(xué)知識(shí)以及豐富的經(jīng)驗(yàn)。除此之外，還需要有一個(gè)比較干凈的接種環(huán)境，否則咖啡葉銹病菌夏孢子很容易被重寄生菌侵染，干擾試驗(yàn)結(jié)果[4-6]，準(zhǔn)確性和可信度易受外界因素的影響，難以滿足快速、高通量鑒定與檢測(cè)的實(shí)際需求。由此可見，建立一種高效、準(zhǔn)確的分子檢測(cè)技術(shù)對(duì)于該病害的快速鑒定與監(jiān)測(cè)具有重要意義。

白學(xué)慧等[7]采用國(guó)際通用的19 個(gè)咖啡銹菌小種鑒別寄主，利用人工接種鑒定的方法，對(duì)2011～2015 年采自云南咖啡主產(chǎn)區(qū)的51 份咖啡銹菌進(jìn)行了致病性測(cè)定，基于其致病表型從而鑒定出9 個(gè)生理小種。汪涵等[8]利用咖啡駝孢銹菌DNA 核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1～I(xiàn)TS4 特異性區(qū)域設(shè)計(jì)的1 對(duì)特異性引物Hv-ITS-F/R，僅能從咖啡駝孢銹菌基因組DNA 中擴(kuò)增出396 bp 的特異條帶，而其他相似或相近的病原真菌則無擴(kuò)增條帶。該檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)濃度可達(dá)10 pg/μL，但是普通PCR 檢測(cè)仍不夠靈敏。隨著分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，許多分子檢測(cè)技術(shù)由于具有快速、高靈敏度而被廣泛應(yīng)用于植物病原菌的診斷與鑒定中，比較常見的是巢式PCR 檢測(cè)技術(shù)[9,10]。但是，由于巢式PCR 需要進(jìn)行2 輪獨(dú)立的PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，第二輪PCR 擴(kuò)增反應(yīng)是以第1 輪PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，在這過程中需要開管進(jìn)行模板轉(zhuǎn)移，從而增加了污染的概率[11]，而單管巢式PCR 是在巢式PCR 技術(shù)發(fā)展而來，這就使得單管巢式PCR 檢測(cè)技術(shù)不僅具有巢式PCR 檢測(cè)技術(shù)的特異性和靈敏性，還能節(jié)省時(shí)間、節(jié)約成本，同時(shí)又具有可降低潛在污染風(fēng)險(xiǎn)等優(yōu)點(diǎn)，具有較好的發(fā)展前景[12-14]。目前關(guān)于咖啡葉銹病菌單管巢式PCR的檢測(cè)體系尚未建立。針對(duì)傳統(tǒng)咖啡銹菌鑒定與監(jiān)測(cè)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，以及檢測(cè)技術(shù)靈敏度不夠高等問題，本研究擬建立咖啡葉銹病菌單管巢式PCR 檢測(cè)體系，為咖啡葉銹病的早期診斷與病害監(jiān)測(cè)提供快速、可靠的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗(yàn)所用的供試樣品DNA 包括咖啡駝孢銹菌（H.vastatix）、甘蔗黃銹病菌（Puccinia kuehnii）、甘蔗褐銹病菌（P.melanocephala）、雞蛋花鞘銹菌（Coleosporium plumierae）、葡萄層銹菌（Phakopsora ampelopsidis）、咖啡炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、咖啡褐斑病菌（Cerospora coffeicola）、咖啡腐皮鐮孢黑果病菌（Fusarium solani）、咖啡露濕擬漆斑菌（Paramyrothecium breviseta）以及咖啡擬多盤毛孢葉斑病菌（Pestalotiopsis trachicarpicola），表1。其中2份咖啡駝孢銹菌經(jīng)提取核酸后檢測(cè)與克隆測(cè)序確認(rèn)為咖啡駝孢銹菌后，作為本研究的陽(yáng)性樣品，其余甘蔗黃銹病菌、咖啡炭疽病菌、咖啡褐斑病菌、雞蛋花鞘銹菌、葡萄層銹菌、咖啡腐皮鐮孢黑果病菌、咖啡露濕擬漆斑菌和咖啡擬多盤毛孢葉斑病菌樣品均經(jīng)提取核酸與克隆測(cè)序確定含有相應(yīng)病菌后，作為特異性分析模板。所有菌株DNA 樣品均保存于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所。

表1 供試菌株Table 1 Strains used in this study

1.2 咖啡葉銹病菌病葉DNA提取

采用CTAB法（HexadecyltrimethylAmmoniumBromide，十六烷基三甲基溴化銨法）[15]，對(duì)咖啡葉銹病葉進(jìn)行DNA 提取，DNA 樣品置于 20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

將咖啡葉銹病菌ITS 序列與NCBI 公共數(shù)據(jù)庫(kù)中同源性較高的序列進(jìn)行多重比較，獲取咖啡葉銹病菌ITS 序列的特異性區(qū)段。通過primer explorer 5.0 在線軟件對(duì)多態(tài)性豐富區(qū)域設(shè)計(jì)引物，參考引物設(shè)計(jì)原理，并結(jié)合單管巢式PCR 引物設(shè)計(jì)原理：一般外引物退火溫度高于內(nèi)引物10 ℃左右，引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司廣州合成部合成。

1.4 外引物與內(nèi)引物最佳退火溫度

為了進(jìn)一步確認(rèn)咖啡葉銹病菌的單管巢式PCR最佳的退火溫度，對(duì)所設(shè)內(nèi)引物進(jìn)行52～63 ℃梯度退火溫度擴(kuò)增，篩選出最佳退火溫度；在內(nèi)引物最佳退火溫度的基礎(chǔ)上，對(duì)外引物設(shè)置梯度退火溫度60～72 ℃，從中篩選出高于內(nèi)引物最佳退火溫度大約10 ℃的外引物最佳退火溫度。

擴(kuò)增均采用20μL反應(yīng)體系：dd H2O 14.3μL，10 rTaq Buffer 2μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.6μL，rTaq DNA Polymerase（5 U/μL）0.1μL，10μL，30 ng/μL 模板DNA 1μL。

內(nèi)引物的反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，梯度退火溫度（52～63 ℃）退火10 s，72 ℃延伸25 s，35 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸4 min，12 ℃保存。外引物的反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，梯度退火溫度（60～72 ℃）退火10 s，72 ℃延伸25 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸4 min，12 ℃保存。

1.5 單管巢式PCR反應(yīng)體系優(yōu)化

為了獲得較為理想的單管巢式PCR 反應(yīng)體系，在確定外內(nèi)引物退火溫度的基礎(chǔ)上，利用SPSS 26.0對(duì)外、內(nèi)引物濃度，dNTPs 濃度，rTaq 酶量等體系關(guān)鍵因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，各設(shè)定4 個(gè)水平，見表2。選用正交表L1（644）設(shè)計(jì)試驗(yàn)，見表3。單管巢式PCR 反應(yīng)體系的各試驗(yàn)總體積為20μL，每個(gè)試驗(yàn)均加入2.5μL 10 rTaq Buffer 和咖啡葉銹病菌DNA 1μL，其他成分按照正交設(shè)計(jì)的濃度用量加入，ddH2O補(bǔ)足至20μL。

表2 咖啡葉銹病菌單管巢式PCR 反應(yīng)體系正交試驗(yàn)的各因素及水平Table 2 Factors and levels of single-tube nested-PCR reaction system for causing coffee leaf rust

表2 咖啡葉銹病菌單管巢式PCR 反應(yīng)體系正交試驗(yàn)的各因素及水平Table 2 Factors and levels of single-tube nested-PCR reaction system for causing coffee leaf rust

表3 咖啡駝孢銹菌的單管巢式PCR 不同因素和水平L1（644）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 3 L16(44)orthogonal test design on different factors and levels of single tube nested PCR for causing coffee leaf rust

表3 咖啡駝孢銹菌的單管巢式PCR 不同因素和水平L1（644）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 3 L16(44)orthogonal test design on different factors and levels of single tube nested PCR for causing coffee leaf rust

1.6 單管巢式PCR檢測(cè)體系特異性分析與酶切驗(yàn)證

以咖啡駝孢銹菌、甘蔗黃銹病菌、甘蔗褐銹病菌、雞蛋花鞘銹菌、葡萄層銹菌、咖啡炭疽病菌、咖啡褐斑病菌、咖啡腐皮鐮孢菌、咖啡露濕擬漆斑菌和咖啡擬多盤毛孢菌等共計(jì)16 份菌株DNA 為模板（表1），并以ddH2O 為陰性對(duì)照。利用1.5 篩選出的咖啡葉銹病菌單管巢式PCR 檢測(cè)體系進(jìn)行特異性分析。采用Apol I 單酶切位點(diǎn)對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行酶切驗(yàn)證。酶切體系（20μL）：10 Quick CutBuffer 2μL、PCR 產(chǎn)物8μL、Apol I 1.5μL、dd H2O 8.5μL。酶切程序：65 ℃4 h，85 ℃30 min。酶切產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.7 靈敏度分析

用超微量分光光度計(jì)（NanoDrop 2000c）將咖啡駝孢銹菌DNA 初始濃度調(diào)整為10 ng/μL，采用濃度梯度稀釋法將DNA 進(jìn)行100～10-6倍的稀釋，以100 為陽(yáng)性對(duì)照，dd H2O 為陰性對(duì)照，進(jìn)行單管巢式PCR 檢測(cè)。擴(kuò)增產(chǎn)物使用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀拍照保存。以HvF2/HvR2 進(jìn)行普通PCR靈敏度檢測(cè)。

1.8 疑似病樣準(zhǔn)備

疑似咖啡葉銹病病葉樣品采集自云南咖啡園，采用1.2 方法提取DNA，利用咖啡葉銹病菌的單管巢式PCR 進(jìn)行檢測(cè)鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 咖啡葉銹病菌單管巢式PCR引物設(shè)計(jì)

將咖啡葉銹病菌ITS 序列與下載自NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中包括銹菌目同源序列于MultAlin 網(wǎng)站上（http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin.html）進(jìn)行多重比對(duì)。結(jié)果表明，咖啡葉銹病菌ITS 序列與其他序列相比，除存有單堿基差異導(dǎo)致的多態(tài)性區(qū)域外，還存在明顯的僅存在于咖啡葉銹病菌中的特異性區(qū)域。結(jié)合上述2 類多態(tài)性區(qū)域設(shè)計(jì)了外引物對(duì)HvF1/HvR1 與內(nèi)引物對(duì)HvF2/HvR2（表4），二者預(yù)期擴(kuò)增片段大小分別為562 bp 和371 bp。

表4 咖啡葉銹病菌單管巢式PCR 引物Table 4 Single-tube nested PCR primers for

表4 咖啡葉銹病菌單管巢式PCR 引物Table 4 Single-tube nested PCR primers for

2.2 內(nèi)外引物退火溫度篩選

對(duì)內(nèi)引物HvF2/HvR2 進(jìn)行梯度退火溫度PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，在供試的8 個(gè)梯度退火溫度中，內(nèi)引物HvF2/HvR2 在退火溫度為52.0～60.8 ℃時(shí)，均能擴(kuò)增出目的條帶，內(nèi)引物在退火溫度為52.0 ℃、52.8 ℃、56.2 ℃時(shí)，擴(kuò)增出的條帶較清晰，在退火溫度為54.1℃、58.7 ℃條帶稍弱；而在退火溫度為60.8 ℃時(shí)，僅擴(kuò)增出一條微弱的條帶，而退火溫度高于此溫度時(shí)不能擴(kuò)增出任何條帶，表明內(nèi)引物的最大退火溫度為60.8 ℃，見圖1。據(jù)此，選取52 ℃為內(nèi)引物的退火溫度，開展后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 咖啡葉銹病菌單管巢式PCR 內(nèi)引物HvF2/HvR2 退火溫度優(yōu)化Fig.1 Optimization of the annealing temperature for internal single-tube nested primers HvF2/HvR2 of

對(duì)外引物HvF1/R1 進(jìn)行梯度退火溫度PCR 擴(kuò)增，結(jié)果表明，在設(shè)定的6 個(gè)外引物退火溫度中，只有退火溫度為60.0～64.5 ℃時(shí)能擴(kuò)增出清晰的條帶，而其余的4 個(gè)退火溫度均未擴(kuò)增出任何條帶，見圖2。根據(jù)圖1 結(jié)果可知，內(nèi)引物在退火溫度為60.8 ℃及其以上時(shí)，并不能有效擴(kuò)增。也即只有外引物退火溫度為60.8 ℃及其以上時(shí)，單管巢式PCR 中外引物即可有效擴(kuò)增，內(nèi)引物由于退火溫度過高而不能有效擴(kuò)增。從圖2 可看出，當(dāng)退火溫度為62.4 ℃與64.5 ℃時(shí)，均可擴(kuò)增出清晰特異性條帶，由此表明外引物的退火溫度范圍為62.4～64.5 ℃。為了后續(xù)試驗(yàn)操作方便，本研究選63 ℃作為HvF1/R1 的退火溫度。

圖2 咖啡葉銹病菌單管巢式PCR 外引物HvF1/R1 退火溫度優(yōu)化Fig.2 Optimization of the annealing temperature of single tube nested PCR outer primers HvF1/R1 for

2.3 單管巢式PCR檢測(cè)體系的優(yōu)化

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的16 種試驗(yàn)組合進(jìn)行巢式PCR 擴(kuò)增。試驗(yàn)結(jié)果表明，在16 種組合中，其中組合5、7、9、11、13 均擴(kuò)增出預(yù)期的單一條帶，但組合13 擴(kuò)增條帶最強(qiáng)；組合15 雖然擴(kuò)增條帶比組合13 的更強(qiáng)，但是該組合外引物也有少量擴(kuò)增，見圖3。由此篩選出組合13 為最優(yōu)組合。也即當(dāng)外引物濃度為50 pM，內(nèi)引物濃度為0.35μL）量為9 U時(shí)，擴(kuò)增條帶既單一又清晰。綜上所述，由此而建立的咖啡葉銹病菌單管巢式PCR最佳反應(yīng)體系（20μL）為：10 rTaq Buffer 2.5μL，2.5 mmol/L dNTPs 3.2μL，rTaq DNA Polymerase（5U/μL）1.8μL，7μL，1 nmol/L的HvF1/HvR1 引物各1μL，模板DNA1μL，ddH2O7.5μL。

圖3 單管巢式PCR 正交試驗(yàn)16 種組合擴(kuò)增效果比較Fig.3 Comparison of amplification effects of 16 combinations in single tube nested PCR orthogonal test

2.4 單管巢式PCR檢測(cè)體系特異性分析

特異性試驗(yàn)結(jié)果表明，只有DNA 來自咖啡葉銹病菌時(shí)，電泳可見清晰且特異條帶，而其它非咖啡葉銹病菌DNA，均未擴(kuò)增出任何條帶（圖4）。同時(shí)，以咖啡葉銹病菌模板DNA 為陽(yáng)性對(duì)照，ddH2O 為陰性對(duì)照，對(duì)擴(kuò)增出的咖啡葉銹病菌PCR 產(chǎn)物進(jìn)行ApoLI 單酶切驗(yàn)證，酶切產(chǎn)物電泳可見預(yù)期大?。?36 bp）的目的條帶（圖5）。由此表明，所建立的咖啡葉銹病菌單管巢式PCR 檢測(cè)體系具有較好的特異性。

圖4 咖啡葉銹病菌單管巢式PCR 檢測(cè)體系特異性分析Fig.4 Specificity analysis of single-tube nested PCR for detection of

Fig.5 Digestionofsingle-tube nestedPCRproduct of 圖5 咖啡葉銹病菌單管巢式PCR產(chǎn)物酶切

2.5 靈敏度分析

單管巢式PCR 靈敏度結(jié)果顯示，當(dāng)DNA 模板濃度為10 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL 時(shí)，擴(kuò)增條帶清晰可見；而當(dāng)模板濃度為10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL 其擴(kuò)增條帶逐漸變?nèi)?；?dāng)模板濃度為100 fg/μL 時(shí)，僅檢測(cè)出一條微弱的條帶；而當(dāng)模板濃度大于此濃度時(shí)，檢測(cè)不出任何目的條帶。由此表明，所建立的咖啡葉銹病菌單管巢式PCR 檢測(cè)體系的最低檢測(cè)模板濃度為100 fg/μL，最低檢測(cè)終濃度為5 fg/μL（圖6 A）。比較而言，普通PCR 靈敏度結(jié)果顯示，當(dāng)DNA 濃度為10 ng/μL、1 ng/μL 時(shí)，可見清晰的條帶，當(dāng)DNA 濃度為100 pg/μL、10 pg/μL 時(shí)，條帶漸弱，當(dāng)DNA 濃度大于10 pg/μL時(shí)，擴(kuò)增不出任何條帶。因此，普通PCR 的最低檢測(cè)濃度為10pg/μL，最低檢測(cè)終濃度為0.5 pg/μL（圖6B）。所以，本試驗(yàn)所開發(fā)的咖啡葉銹病菌單管巢式PCR反應(yīng)體系的最低檢測(cè)終濃度（5 fg/μL）是普通PCR 最低檢測(cè)終濃度（0.5 pg/μL）的100 倍，具有較高的靈敏性。

圖6 咖啡葉銹病菌單管巢式PCR 靈敏度檢測(cè)Fig.6 Sensitivity of single-tube nested PCR for

2.6 疑似病樣檢測(cè)鑒定

對(duì)咖啡園采取的22 份疑似咖啡葉銹菌葉片DNA進(jìn)行單管巢式PCR 檢測(cè)。結(jié)果顯示，采集的22 份樣品DNA，經(jīng)檢測(cè)均出現(xiàn)預(yù)期大?。?71 bp）條帶，見表5。由此表明，采集的22份樣本中均含有咖啡駝孢銹菌。

表5 疑似咖啡葉銹病病樣檢測(cè)鑒定Table 5 Identification of suspected coffee leaf rust by single tube nested PCR

3 討論

以PCR 為基礎(chǔ)的病原菌分子檢測(cè)技術(shù)得以廣泛應(yīng)用的前提條件就是高質(zhì)量的引物，常常利用特異性的引物實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)病原菌的擴(kuò)增，而非靶標(biāo)病原菌擴(kuò)增不出條帶，或者非靶標(biāo)病原菌雖可擴(kuò)增出條帶，但是其大小明顯與靶標(biāo)病原菌的不同，從而到達(dá)二者區(qū)分的目的?；诔彩絇CR 衍生而來的單管巢式PCR 技術(shù)同樣如此。為此，在本研究中利用所獲得的咖啡葉銹病菌ITS 序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)搜索比對(duì)，發(fā)現(xiàn)咖啡葉銹病菌ITS2 區(qū)域與其它非咖啡葉銹病菌存在特異區(qū)域?；谠撎禺愋詤^(qū)域，結(jié)合單管巢式PCR 引物設(shè)計(jì)原則中外引物對(duì)與內(nèi)引物對(duì)退火溫度的要求，最終設(shè)計(jì)了巢式PCR 嵌套式引物對(duì)HvF1/R1 與HvF2/R2，二者退火溫度預(yù)期相差15 ℃。經(jīng)NCBI database 搜索比對(duì)表明，引物對(duì)均具有較高的特異性。進(jìn)一步通過對(duì)所設(shè)計(jì)的外引物對(duì)與內(nèi)引物對(duì)的最佳退火溫度進(jìn)行了篩選與驗(yàn)證。最終篩選出咖啡葉銹病菌單管巢式PCR分子檢測(cè)技術(shù)外、內(nèi)引物的退火溫度分別為63 ℃、52 ℃，二者相差達(dá)11 ℃。這已滿足了單管巢式PCR檢測(cè)技術(shù)基本要求之一，即外引物的退火溫度必須高于內(nèi)引物的退火溫度10 ℃以上[16]。

為了獲得本研究中內(nèi)外引物組的最優(yōu)引物量之比，為此利用SPSS 軟件對(duì)外HvF1/HvR1、內(nèi)引物濃度HvF2/HvR2，dNTPs 濃度，rTaq 酶量等體系關(guān)鍵因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的16 種試驗(yàn)組合進(jìn)行巢式PCR 擴(kuò)增。結(jié)果表明，在16 種組成中，只有組合13 擴(kuò)增條帶單一且清晰。也即當(dāng)外引物濃度為50 pM，內(nèi)引物濃度為0.35μL）酶量為9 U 時(shí)，反應(yīng)條帶最特異、清晰（圖4）。這一引物濃度之比，與已報(bào)道的母羊胎兒組織勾形蟲（Toxoplasma gondii）外內(nèi)引物終濃度比例（0.01μM：0.4μM）[17]、谷物樣品鐮刀病菌（F.culmorum）外內(nèi)引物終濃度比（0.1 fM：1 pM）[18]、菠蘿凋萎病菌（Pineapple mealybug wilt）外內(nèi)引物濃度比（2 pM：0.2 nM）[16]、貓屎胎三毛滴蟲（Tritrichomonas foetus）外內(nèi)引物濃度比（12.5 fM：0.25 pM）[19]存在一定的差異，可能是由于內(nèi)外引物的不同所導(dǎo)致的。

所建立的檢測(cè)體系只能從咖啡葉銹病菌中檢測(cè)出目的條帶，其它所有非咖啡葉銹病菌的模板DNA 沒有產(chǎn)生任何條帶，這與汪涵等[8]研究結(jié)果一致。靈敏度方面可達(dá)5 fg/μL，這一結(jié)果與檢測(cè)結(jié)核性腦膜炎（Tuberculous meningitis）[20]、與霍亂弧菌（Vibrio cholerae）的靈敏度[21]要稍微弱點(diǎn)，二者的靈敏度均為1 fg/μL；但又明顯比檢測(cè)菠蘿凋萎病菌（Pineapple mealybug wilt）的靈敏度（0.95 pg/μL）[16]、以及濃毒癥（Pythiosis）的靈敏度（2.7 pg/μL）[22]要靈敏。最后利用該檢測(cè)技術(shù)對(duì)22 份田間疑似病樣進(jìn)行了檢測(cè)，最終從所有樣品中均檢測(cè)出預(yù)期大小的條帶?？傊?，鑒于本研究中所建立的咖啡葉銹病菌單管巢式PCR 檢測(cè)體系較好的特異性、靈敏性以及實(shí)用性，故本檢測(cè)技術(shù)可用于咖啡葉銹病菌的快速鑒定，亦可為咖啡銹病監(jiān)測(cè)預(yù)警提供技術(shù)支持。