單基因隱性遺傳疾病擴(kuò)展性攜帶者篩查的臨床應(yīng)用研究

彭 偉 段超群 李 清 劉 珍 韓 艷 袁照清

江西省宜春市婦幼保健院生殖科 336000

單基因隱性遺傳病通常發(fā)生于無(wú)家族史及且無(wú)癥狀的致病變異基因攜帶者家庭,2%～4%的育齡夫婦有生育可能懷上常染色體或X連鎖隱性遺傳疾病患兒的風(fēng)險(xiǎn)[1]。夫妻雙方攜帶同一常染色體隱性遺傳致病基因致病變異的夫婦或女方性伴侶攜帶X性染色體隱性遺傳致病基因致病變異的夫婦均可被定義為“高危”夫婦。雖然單一的單基因遺傳性疾病發(fā)病率很低,但是對(duì)眾多單基因遺傳病進(jìn)行綜合考慮,其發(fā)生率卻并不低。近年來(lái),隨著新一代測(cè)序技術(shù)(Next-generation sequencing,NGS)的快速發(fā)展,ECS依托高通量測(cè)序技術(shù),可以在單一檢測(cè)中同時(shí)篩查數(shù)十或數(shù)百種疾病,對(duì)育齡夫婦實(shí)現(xiàn)一次性篩查多種疾病,幫助育齡夫婦了解自身致病突變攜帶情況,通過(guò)胚胎植入前遺傳學(xué)診斷、產(chǎn)前診斷等生育決策來(lái)阻斷患有生育嚴(yán)重遺傳疾病的子代的出生,是降低出生缺陷一級(jí)防控中不可缺少的環(huán)節(jié)[2]。本研究的ECS可以檢測(cè)155種單基因遺傳病基因的隱性遺傳疾病攜帶者篩查,旨在評(píng)估我院不孕不育夫婦的ESC結(jié)果,更好地了解本地區(qū)隱性遺傳病基因的攜帶率,同時(shí)為攜帶陽(yáng)性夫婦提供遺傳咨詢和生育指導(dǎo),防止遺傳疾病的發(fā)生。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象 回顧性分析2021年1月—2022年4月于我院接受輔助生殖技術(shù)助孕的不孕不育患者資料。607對(duì)夫婦接受ECS檢測(cè)前咨詢,324對(duì)夫婦同意采用序貫檢測(cè)方式進(jìn)行ECS檢測(cè),先對(duì)324名女性患者進(jìn)行檢測(cè),其中141名女性為陽(yáng)性攜帶者,對(duì)女方攜帶者陽(yáng)性的夫婦進(jìn)行遺傳咨詢,建議其伴侶進(jìn)行檢測(cè),最終64名男性患者接受ECS檢測(cè)。

1.2 方法

1.2.1 充分告知患者篩查方法、檢測(cè)內(nèi)容、檢測(cè)局限性及可能存在的風(fēng)險(xiǎn),通過(guò)倫理審查,患者自愿接受ECS,采血前均已簽署知情同意書(shū)。

1.2.2 擴(kuò)展性攜帶者篩查檢測(cè)疾病及基因:選擇華大基因的DX1605單基因遺傳病擴(kuò)展性攜帶者篩查,該ECS根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳基因組學(xué)會(huì)(ACMG)[3]和美國(guó)婦產(chǎn)科協(xié)會(huì)(American College of Obstetricians and Gynecologists,ACOG)[4]發(fā)布的指南,并結(jié)合中國(guó)人群的全基因組數(shù)據(jù),綜合評(píng)估,根據(jù)疾病嚴(yán)重性、發(fā)病時(shí)期、基因解釋度、外顯率等特點(diǎn),具有發(fā)病率高、致病明確、影響嚴(yán)重、早期發(fā)病、可預(yù)防阻斷的疾病特點(diǎn),篩選出包含155種單基因隱性遺傳疾病和147個(gè)單基因。

1.2.3 檢測(cè)方法:使用 EDTA 抗凝管采集自愿參加篩查患者外周靜脈血2ml,經(jīng)質(zhì)控檢測(cè)合格后,采用目標(biāo)序列捕獲和高通量測(cè)序技術(shù),對(duì)其全部基因外顯子區(qū)域和剪接區(qū)域進(jìn)行測(cè)序和生物信息分析,獲取檢測(cè)區(qū)域的基因突變信息,分析得出患者致病突變攜帶情況。

1.2.4 檢測(cè)結(jié)果咨詢:對(duì)所有參與檢測(cè)的患者進(jìn)行檢測(cè)前、檢測(cè)后遺傳咨詢。被檢出的高風(fēng)險(xiǎn)夫婦建議使用產(chǎn)前診斷和(或)胚胎植入前單基因病遺傳檢測(cè)(PGT-M)以避免疾病遺傳。

1.3 觀察指標(biāo) 對(duì)比分析ECS單基因病相關(guān)變異的總體檢出情況,陽(yáng)性攜帶率差異。

2 結(jié)果

2.1 患者一般資料 607對(duì)選擇輔助生殖技術(shù)助夫婦接受ECS檢測(cè)前咨詢,324對(duì)夫婦同意采用女方先進(jìn)行檢測(cè)的序貫檢測(cè)方式進(jìn)行ECS檢測(cè),受檢人群年齡20～46歲,平均年齡(32.3±5.7)歲,283對(duì)夫婦拒絕進(jìn)行ECS檢測(cè),拒絕檢測(cè)的原因如下(見(jiàn)表1)。

表1 患者拒絕ECS檢測(cè)原因(n=283)

2.2 總體檢出情況 324名女性先進(jìn)行ECS檢測(cè),141名ECS檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性,陽(yáng)性率為43.5%,共檢測(cè)出致病及疑似致病變異總頻次183次,人均攜帶頻次0.56個(gè)(183/324)。在141例攜帶者中,31.2%(101/324)的個(gè)體攜帶一種隱性遺傳疾病,而9.3%(30/324)的個(gè)體攜帶兩種不同的隱性疾病,1.9%(6/324)個(gè)體攜帶三種不同的隱性遺傳疾病,0.3%(1/324)個(gè)體攜帶四種不同的隱性遺傳疾病。

2.3 攜帶基因檢出情況 141名女性陽(yáng)性攜帶者,檢測(cè)結(jié)果顯示在155種單基因隱性遺傳疾病中共檢測(cè)出72種單基因隱性遺傳疾病,最常見(jiàn)α-地中海貧血,其次是眼皮膚白化病 2 型(OCA2基因)、 β-地中海貧血、隱性耳聾 1A 型(GJB2基因)、谷固醇血癥(ABCG5基因),前9種陽(yáng)性攜帶基因如下,見(jiàn)表2,所有檢出基因攜帶情況見(jiàn)圖1。

圖1 各基因攜帶頻次情況

表2 攜帶基因檢出情況(n=324)

2.4 對(duì)男性伴侶的序貫篩查 女性攜帶者陽(yáng)性患者141名,對(duì)攜帶者夫婦提供了遺傳咨詢,并建議對(duì)其丈夫進(jìn)行序貫檢測(cè),64位男性知情選擇進(jìn)行ECS檢測(cè),因此序貫檢測(cè)的依從率為45.4%。77名男性伴侶(54.6%)拒絕了序貫ECS序貫檢測(cè),由于針對(duì)地中海貧血、脊髓肌萎縮癥、遺傳性耳聾具有單獨(dú)的特定的基因檢測(cè)項(xiàng)目,28名男性伴侶在進(jìn)行遺傳咨詢后選擇了僅進(jìn)行單獨(dú)目標(biāo)基因檢測(cè),其中14名男性伴侶進(jìn)行血分析、血紅蛋白電泳篩查、地中海貧血基因診斷,5名男性伴侶進(jìn)行單獨(dú)的脊髓性肌萎縮癥(Spinal muscular atrophy,SMA)基因檢測(cè),9名男性伴侶進(jìn)行遺傳性耳聾基因檢測(cè),49名男性伴侶拒絕任何檢測(cè),最常見(jiàn)原因是沒(méi)有家族遺傳疾病史,既往生育子代無(wú)異常,認(rèn)為自己同時(shí)與女性伴侶攜帶同一種疾病的概率極低。

2.5 高危夫婦結(jié)果和生殖決策 經(jīng)ECS序貫檢測(cè),最終發(fā)現(xiàn)高危風(fēng)險(xiǎn)夫婦共4對(duì)(1.2%),其中2對(duì)夫婦為女方檢測(cè)出X染色體隱性疾病基因攜帶,1名女性患者檢測(cè)出乙型血友病F9基因攜帶(c.224G>A),男方ECS無(wú)異常,遺傳咨詢后要求繼續(xù)體外受精—胚胎移植助孕治療,妊娠后行產(chǎn)前診斷,1名女性患者檢測(cè)出進(jìn)行性假肥大型性肌營(yíng)養(yǎng)不良DMD基因攜帶(c.10034G>A),男方ECS檢測(cè)無(wú)異常,經(jīng)遺傳咨詢后擇PGT-M助孕治療。2對(duì)夫婦檢測(cè)出同種常染色體隱性遺傳疾病基因攜帶,1對(duì)夫婦檢測(cè)出遺傳性耳聾GJB2基因攜帶(c.235delC;p.Leu79Cysfs*3),另1對(duì)夫妻檢測(cè)出脊髓性肌萎縮SMN1基因攜帶(EX7 DEL),經(jīng)過(guò)遺傳咨詢,均選擇PGT-M助孕治療。

3 討論

流行病學(xué)調(diào)查研究顯示,我國(guó)不孕不育的發(fā)病率約為18%[5]。近年來(lái),隨著對(duì)遺傳疾病的研究的不斷深入,通過(guò)攜帶者篩查,夫妻雙方可以獲取關(guān)于他們是否會(huì)生育患有隱性遺傳疾病風(fēng)險(xiǎn)子代的信息。現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)攜帶者篩查工作主要集中在單種疾病的攜帶者篩查階段,如地中海貧血、脊髓性肌萎縮癥、遺傳性耳聾等發(fā)病率較高的遺傳疾病篩查,且已針對(duì)具有目標(biāo)靶向基因的檢測(cè)方式和診斷共識(shí)[6-8]。對(duì)于可針對(duì)多種遺傳疾病的擴(kuò)展性攜帶者篩查尚無(wú)統(tǒng)一的檢測(cè)方案和共識(shí)。2010年,最早提出ECS檢測(cè)項(xiàng)目[9]。隨著這項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展,使得攜帶者篩查檢測(cè)已經(jīng)變得更加全面、更便宜、應(yīng)用性更廣泛。醫(yī)療專業(yè)組織在過(guò)去幾年中發(fā)表了關(guān)于ECS的建議,2016年歐洲人類遺傳學(xué)學(xué)會(huì)和2017年美國(guó)婦產(chǎn)科學(xué)會(huì)ACOG發(fā)布的《遺傳病攜帶者篩查》指南均建議懷孕前進(jìn)行ECS檢測(cè),目前我國(guó)ECS尚處于研究階段,尚無(wú)關(guān)于ECS的臨床推廣應(yīng)用的共識(shí)和指南。

對(duì)于ECS有以下兩種常見(jiàn)篩查方案,夫婦雙方同時(shí)篩查或一方先進(jìn)行篩查的序貫篩查,至于夫婦雙方誰(shuí)先進(jìn)行篩查,夫婦雙方可以自行決定?？紤]到目前ECS檢測(cè)成本較高是患者拒絕ECS檢測(cè)的原因之一,且助孕前檢測(cè)有較充足時(shí)間等待檢測(cè)的結(jié)果,本研究采用的是女方先進(jìn)行孕前ECS患者篩查,陰性結(jié)果可以減少男方檢測(cè),減輕患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。本研究中,為607對(duì)夫婦在輔助生殖技術(shù)助孕前了ECS檢測(cè)前咨詢,324對(duì)夫婦同意采用女方先進(jìn)行檢測(cè)的序貫檢測(cè)方式進(jìn)行ECS檢測(cè),283對(duì)夫婦拒絕進(jìn)行ECS檢測(cè),拒絕檢測(cè)原因占比最高的是夫妻雙方?jīng)]有家族史,認(rèn)為不可能有生育遺傳疾病患兒的風(fēng)險(xiǎn),約占45.2%(128/283)。141名女性為陽(yáng)性攜帶者,陽(yáng)性率為43.5%。64名男性進(jìn)行ECS檢測(cè),序貫檢測(cè)的依從率為45.4%,77名男性伴侶(54.6%)拒絕序貫檢測(cè),其中28名男性伴侶在進(jìn)行遺傳咨詢后選擇目標(biāo)基因檢測(cè),49名男性伴侶拒絕進(jìn)行任何相關(guān)檢測(cè)。根據(jù)現(xiàn)有研究調(diào)查,年齡、收入、教育水平或種族之間的關(guān)聯(lián)都有可能是影響患者是否接受ECS檢測(cè)相關(guān)因素[10-13]。Van steijvoort 等[14]系統(tǒng)回顧分析了2015—2019年關(guān)于一般人群中個(gè)人和夫婦對(duì)ECS的興趣12篇研究,32%～76%的受訪者對(duì)ECS測(cè)試感興趣,而實(shí)際ECS檢測(cè)的接受率從8%～50%不等,綜合所有研究發(fā)現(xiàn)拒絕ECS研究最多的原因是缺乏家族史、作為攜帶者夫婦的感知風(fēng)險(xiǎn)低以及結(jié)果不會(huì)影響他們?cè)谖磥?lái)懷孕中的生殖選擇。Larsen等[15]研究結(jié)果顯示在受孕前接受咨詢?nèi)巳褐?接受體外授精助孕咨詢的婦女接受檢測(cè)率最高(74.5%),因?yàn)樵陉?yáng)性篩查結(jié)果后立即獲得PGT助孕治療,ECS聯(lián)合PGT可能被視為正在進(jìn)行的治療的一部分。Shapiro等[16]對(duì)2 061例接受ECS檢測(cè)的患者進(jìn)行研究,其中36.9%患者被發(fā)現(xiàn)是一種或多種隱性遺傳疾病的攜帶者,平均發(fā)現(xiàn)的突變數(shù)為1.34±0.62,73%的攜帶者讓其伴侶完成了ECS篩查,81.4%的患者認(rèn)為他們有足夠的關(guān)于伴侶測(cè)試的風(fēng)險(xiǎn)和益處的信息,可以做出知情的決定。相比之下,本研究的序貫檢測(cè)依從性較低,由于很多夫婦缺乏對(duì)遺傳疾病的認(rèn)識(shí),咨詢后很多患者可能仍無(wú)法完全理解檢測(cè)的意義,增加了ECS檢測(cè)咨詢的難度,降低了咨詢的效率。對(duì)于接受體外受精患者,PGT可能被視為治療的一部分,可能更容易接受孕前ECS檢測(cè)。

在144名陽(yáng)性攜帶者中,31.2%(101/324)的個(gè)體攜帶一種隱性遺傳疾病,而9.3%(30/324)的個(gè)體攜帶兩種不同的隱性疾病,1.9%(6/324)個(gè)體攜帶三種不同的隱性遺傳疾病,0.3%(1/324)個(gè)體攜帶四種不同的隱性遺傳疾病。在155種單基因隱性遺傳疾病數(shù)據(jù)庫(kù)中共檢測(cè)出72種,最常見(jiàn)α-地中海貧血,HBA1/HBA2基因攜帶率6.2%(20/324),其次是眼皮膚白化病2型(OCA2基因)、 β-地中海貧血(HBB基因)、隱性耳聾 1A 型(GJB2基因)、谷固醇血癥(ABCG5基因),攜帶率分布為3.4%、2.5%、2.5%、2.5%。4對(duì)高危夫婦(1.2%)均改變了他們的生殖策略,3對(duì)夫婦選擇PGT-M助孕治療。Shi等[17]研究分析了中國(guó)香港1 321名孕16周前女性進(jìn)行ECS檢測(cè)情況,該ECS包含8種常染色體和3種X連鎖隱性遺傳疾病,結(jié)果顯示8種疾病的攜帶率都超過(guò)了1%,總的陽(yáng)性攜帶率為19.23%,α-地中海貧血攜帶率最高(7.8%),這與我們的研究結(jié)果一致。篩查出8對(duì)高危夫婦(0.83%),其中4對(duì)夫婦進(jìn)行了產(chǎn)前診斷。該研究認(rèn)為建立一個(gè)好的ECS檢測(cè),仍然需要努力更全面地了解人群致病基因攜帶狀況,同時(shí)提高公眾對(duì)遺傳知識(shí)的認(rèn)識(shí)及全面、個(gè)性化檢測(cè)咨詢也至關(guān)重要。Capalbo 等[18]的孕前ECS檢測(cè)納入3 877名篩查個(gè)體,檢測(cè)結(jié)果顯示最常見(jiàn)疾病分別是苯丙酮尿癥、地中海貧血/鐮狀細(xì)胞性貧血、囊性纖維化、脊髓性肌萎縮癥,攜帶者陽(yáng)性率分別為4.4%、3.2%、2.9%和2.3%。在766對(duì)接受測(cè)試的夫婦中,173對(duì)夫婦檢查顯示有一個(gè)陽(yáng)性攜帶者伴侶(22.6%),而20對(duì)夫婦(2.6%)被發(fā)現(xiàn)為攜帶同一種隱性遺傳疾病高風(fēng)險(xiǎn)夫婦,預(yù)計(jì)每300～400例妊娠中就有1例會(huì)受到一種隱性遺傳疾病妊娠的影響,這一風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通人群中唐氏綜合征的患病率,特別是對(duì)35歲以下的女性(其唐氏綜合征的患病率約1‰),15對(duì)夫婦改變生殖計(jì)劃,選擇通過(guò)PGT-M助孕治療降低生育風(fēng)險(xiǎn)。研究提出ECS并不期望只使受測(cè)試的個(gè)體受益,ECS檢測(cè)結(jié)果對(duì)育齡一級(jí)親屬遺傳疾病的級(jí)聯(lián)分析也有間接的效用,通過(guò)總結(jié)分析和量身定制ECS檢測(cè)方案,形成類似于唐氏綜合征篩查程序。由于目前不同的ECS檢測(cè)研究的疾病范圍、人群分布不一樣,因此陽(yáng)性攜帶率、高危風(fēng)險(xiǎn)夫婦檢出率不一樣,了解人群遺傳疾病的致病基因攜帶情況,制定ECS檢測(cè)范圍,是推廣應(yīng)用ECS檢測(cè)急需解決的問(wèn)題。

綜上所述,ECS檢測(cè)可以發(fā)現(xiàn)遺傳性疾病攜帶者,通過(guò)遺傳咨詢降低生育風(fēng)險(xiǎn),特別是對(duì)于輔助生殖技術(shù)助孕的患者,因?yàn)榕咛ブ踩肭斑z傳學(xué)診斷技術(shù)的推廣應(yīng)用,ECS檢測(cè)可以為患者提供有效的決策支持和生殖自主權(quán)。缺乏對(duì)遺傳疾病知識(shí)的了解、檢測(cè)的費(fèi)用貴是影響患者拒絕ECS檢測(cè)的主要原因。本研究的局限性在于樣本量少,同時(shí)未對(duì)參與ECS檢測(cè)患者生育子代進(jìn)行隨訪,未來(lái)還需要更大的樣本量來(lái)了解本地單基因隱性疾病攜帶情況,制定適合本地育齡夫妻的ECS檢測(cè)。