腫瘤相關(guān)碳水化合物抗原的適配體研究*

李 薇 陳 靜 張 旭 袁寶銀 臧明璽

（鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，鄭州 450001）

細(xì)胞表面豐富的碳水化合物除了構(gòu)成能源和結(jié)構(gòu)要素外，還蘊(yùn)含著大量的生物信息。異常的聚糖表達(dá)已被發(fā)現(xiàn)參與涉及癌癥的許多基本生物過程，與腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［1-2］。聚糖的特征結(jié)構(gòu)既可作為有價(jià)值的生物標(biāo)志物用于疾病診斷，也可以作為治療靶點(diǎn)用于藥物研發(fā)［3-7］。開發(fā)具有高親和力和高特異性識(shí)別的聚糖特異性識(shí)別制劑，是與碳水化合物相關(guān)的基礎(chǔ)研究以及臨床相關(guān)的診斷和治療應(yīng)用的核心。

不受直接遺傳控制的聚糖生物合成和巨大的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性長期以來阻礙了該領(lǐng)域的進(jìn)一步進(jìn)展［3-4］。盡管目前基于抗體和凝集素靶向聚糖的方法在腫瘤的臨床診斷和預(yù)后中取得了很大進(jìn)展，但這兩種方法都存在著一些局限性，例如抗體的生產(chǎn)仍然是一個(gè)復(fù)雜且昂貴的過程［8-9］，凝集素固有的低親和力和特異性阻礙了其檢測性能［10-11］。適配體是功能性的單鏈DNA或RNA寡核苷酸，能夠與小分子、蛋白質(zhì)以及整個(gè)細(xì)胞等一系列目標(biāo)物種特異性結(jié)合［12-14］，有望用于解決上述問題。近年來，適配體在碳水化合物的識(shí)別中越來越受到關(guān)注，但相關(guān)的文獻(xiàn)綜述仍然停留在十幾年前［15］，與腫瘤生物標(biāo)志物有關(guān)的描述也在五年前被報(bào)道［16］。本文將就腫瘤相關(guān)碳水化合物抗原的核酸適配體的最新進(jìn)展進(jìn)行綜述和評(píng)論。

1 癌癥中的糖基化

細(xì)胞中存在著豐富的含有共價(jià)連接聚糖的復(fù)合生物大分子，統(tǒng)稱為糖復(fù)合體［17］。這些復(fù)合糖類包括糖蛋白、蛋白聚糖和糖脂等多種類型，廣泛分布于細(xì)胞表面、細(xì)胞內(nèi)分泌顆粒，以及構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)成分。糖蛋白分子中的聚糖含量和組成因蛋白質(zhì)不同而異，有的可高達(dá)20%，通過多種方式影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。蛋白聚糖以聚糖含量為主，由糖胺聚糖共價(jià)連接于不同的核心蛋白質(zhì)形成，是構(gòu)成細(xì)胞間基質(zhì)的重要成分。糖脂則由聚糖和脂質(zhì)組成，是細(xì)胞膜脂的主要成分。此外，體內(nèi)還存在蛋白質(zhì)、糖與脂質(zhì)三位一體的復(fù)合物，即通過糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）連接到細(xì)胞膜上的GPI錨定蛋白。這些聚糖結(jié)構(gòu)中蘊(yùn)含大量的生物信息，參與許多具有生理和病理意義的生物學(xué)功能，包括細(xì)胞間的識(shí)別和黏附、宿主與病原體的相互作用、受精和胚胎發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、激素調(diào)節(jié)、腫瘤轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié)、免疫監(jiān)視和促進(jìn)炎癥反應(yīng)等［18-19］。

與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞通常表現(xiàn)出異常水平和結(jié)構(gòu)的聚糖形式，其改變主要?dú)w因于糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶的過表達(dá)或下調(diào)［20-21］。Hakomori和Kannagi［22］首先提出了與腫瘤相關(guān)的碳水化合物改變的兩種主要機(jī)制，即所謂的不完全合成和新合成過程。不完全的合成過程通常在癌癥的早期階段發(fā)生，是上皮細(xì)胞中表達(dá)的復(fù)雜聚糖正常合成受損的結(jié)果，導(dǎo)致了截短結(jié)構(gòu)的生物合成，如黏蛋白型腫瘤抗原的O-聚糖截短，表達(dá)在胃腸癌和乳腺癌。相反，新合成通常在癌癥的晚期階段觀察到，是添加的某些糖類決定簇，如糖脂和糖蛋白中唾液酸化路易斯抗原的出現(xiàn)、不同的巖藻糖基化，以及唾液酸化的末端結(jié)構(gòu)等。這些異常的聚糖合成被認(rèn)為是癌癥的標(biāo)志，并隨著腫瘤侵襲性的發(fā)展變得更加明顯。

糖基化的改變影響著癌癥進(jìn)展中的關(guān)鍵生物過程，包括腫瘤轉(zhuǎn)移、血管生成、癌細(xì)胞代謝和免疫逃逸等［23-27］。惡性腫瘤發(fā)展的部分特征在于腫瘤細(xì)胞克服細(xì)胞間黏附和獲得侵襲周圍組織的能力，唾液酸化增加可通過局部負(fù)電荷間的靜電排斥促進(jìn)腫瘤腫塊的分離，E鈣黏蛋白上異常的N-聚糖中則可以穩(wěn)定黏附連接，便于后期腫瘤成灶。腫瘤細(xì)胞上唾液酸化的路易斯抗原可通過與選擇素的相互作用促進(jìn)腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，從而介導(dǎo)癌轉(zhuǎn)移和侵襲。在腫瘤細(xì)胞遷移的過程中，整聯(lián)蛋白是N-聚糖的載體，是細(xì)胞外基質(zhì)中信號(hào)的重要受體。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體（VEGFR）的異常糖基化調(diào)節(jié)其與半乳糖凝集素的相互作用，并與腫瘤血管生成有關(guān)。此外，癌細(xì)胞中增加的β-N-乙酰葡糖胺的單糖基（O-GlcNAc）修飾可以充當(dāng)“營養(yǎng)傳感器”，調(diào)節(jié)代謝以響應(yīng)于變化的營養(yǎng)狀況。腫瘤特異性聚糖和免疫細(xì)胞上凝集素的相互作用參與調(diào)節(jié)腫瘤的微環(huán)境，導(dǎo)致癌細(xì)胞對(duì)免疫系統(tǒng)抗性的出現(xiàn)。例如，癌細(xì)胞表面聚糖的改變可以調(diào)節(jié)唾液酸結(jié)合免疫球蛋白型凝集素siglec-7介導(dǎo)的自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒性，并有助于逃避免疫等。這些糖基化的改變伴隨著腫瘤細(xì)胞行為的變化，在整個(gè)癌癥發(fā)展和進(jìn)展中都是活躍的參與者。

由于糖基化的改變與腫瘤的惡性發(fā)展密切相關(guān)，異常聚糖結(jié)構(gòu)可以作為生物標(biāo)志物，是腫瘤診斷、藥物治療以及生物醫(yī)學(xué)成像的潛在靶標(biāo)［28-29］。已發(fā)現(xiàn)一些典型的聚糖表位在腫瘤細(xì)胞上獨(dú)特表達(dá)，這些修飾的碳水化合物表位被定義為腫瘤相關(guān)碳水化合物抗原（tumor-associated carbohydrate antigens，TACAs）［30］。簡單的 TACAs如終端聚糖表位包括唾液酸、多聚唾液酸、唾液酸化路易斯抗原和Globo H，某些含唾液酸的糖鞘脂GM1a、GM2、GM3、GD2、GD3，以及 O-聚糖截短形式sTn、TF和Tn等。此外，一些腫瘤相關(guān)蛋白的N-糖基化復(fù)雜聚糖、血清糖類抗原也在近年來受到越來越多的關(guān)注。發(fā)展針對(duì)這些聚糖的靶向制劑不僅有助于癌癥臨床診斷和治療方法的開發(fā)，也將是腫瘤學(xué)相關(guān)基礎(chǔ)研究中的有效工具。

2 聚糖識(shí)別的挑戰(zhàn)和天然受體

與核酸和蛋白質(zhì)合成不同，聚糖的生物合成并沒有模板的指導(dǎo)，而是依靠細(xì)胞中一系列酶的表達(dá)和活性水平，特異性和有序性地組裝成聚糖結(jié)構(gòu)。盡管組成聚糖的單糖種類和數(shù)量有限，但由于不同單糖的性質(zhì)和連接順序、鏈的可能分支以及糖苷鍵的位置和構(gòu)象，聚糖結(jié)構(gòu)具有顯著的復(fù)雜性和多樣性。此外，聚糖可以通過一系列的單糖修飾進(jìn)一步多樣化，包括甲基化、硫酸化、乙?；土姿峄龋?0］。因此，聚糖識(shí)別受體的開發(fā)存在獨(dú)特的挑戰(zhàn)性，且需要多種策略來實(shí)現(xiàn)對(duì)生物醫(yī)學(xué)相關(guān)聚糖及其衍生物的選擇性識(shí)別。

疾病特異性聚糖特征的鑒定和表征是開發(fā)新型診斷標(biāo)志物的第一個(gè)關(guān)鍵步驟，通過各種方法例如色譜和毛細(xì)管電泳分離和檢測從糖復(fù)合體中釋放的熒光標(biāo)記聚糖，并結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行更詳細(xì)的糖組學(xué)和糖蛋白組學(xué)分析［31-32］。然而，一旦鑒定了潛在的聚糖標(biāo)志物，則需要高靈敏度的分析方法以便用于臨床實(shí)踐，因此高親和力和特異性的生物識(shí)別元件十分重要。

一些TACAs是極好的腫瘤生物標(biāo)志物，長期以來一直通過使用凝集素和單克隆抗體來檢測。凝集素作為碳水化合物的天然結(jié)合蛋白，廣泛存在于進(jìn)化樹的所有分支中，從微生物到真菌、動(dòng)植物的所有生物體中都有被發(fā)現(xiàn)。雖然在大多數(shù)情況下，當(dāng)凝集素組裝成低聚結(jié)構(gòu)時(shí)可以顯示出較高的親和力，但其表面的淺凹槽結(jié)合口袋決定了它們對(duì)單糖和相似聚糖末端結(jié)構(gòu)的選擇性不足［10，33］。使用凝集素進(jìn)行聚糖識(shí)別的主要優(yōu)勢在于低成本的粗樣品檢測，凝集素微陣列技術(shù)可實(shí)現(xiàn)復(fù)雜樣品的高通量分析。此外，單克隆抗體是臨床應(yīng)用中癌癥診斷和治療中最有效的生物制劑類別之一。然而聚糖對(duì)抗體的產(chǎn)生提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，TACAs的不良免疫原性、糖基序列的相似性，以及用于產(chǎn)生抗體的標(biāo)準(zhǔn)宿主生物中固有表達(dá)的多種復(fù)雜聚糖都限制了相應(yīng)抗體的開發(fā)［8-9］。盡管已有一些抗聚糖抗體被批準(zhǔn)或正在臨床試驗(yàn)中用于治療癌癥，例如GD2、GD3、路易斯抗原Y的抗體等［8］，總體來說碳水化合物結(jié)合單克隆抗體的開發(fā)在數(shù)量和質(zhì)量上都嚴(yán)重落后于抗蛋白質(zhì)/肽單克隆抗體。

3 TACAs識(shí)別相關(guān)核酸適配體的發(fā)展

適配體是一類能與目標(biāo)分子特異性結(jié)合的單鏈DNA/RNA寡核苷酸序列，這些序列能夠折疊成穩(wěn)定的三級(jí)結(jié)構(gòu)，對(duì)有機(jī)小分子、金屬離子、蛋白質(zhì)、碳水化合物、細(xì)胞和病毒等表現(xiàn)出親合性的功能。作為一類親和配體，適配體顯示媲美傳統(tǒng)抗體的結(jié)合性能，同時(shí)還具有分子質(zhì)量小、穩(wěn)定性好、合成容易、修飾方便等特點(diǎn)，因此在生物醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域極具吸引力［34-37］。

適配體通常通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）篩選獲得［38-39］。將核酸文庫與靶標(biāo)分子孵育，經(jīng)過多輪迭代篩選循環(huán)后，通過序列測定和固相合成制備得到最終特異性識(shí)別靶分子的適配體。經(jīng)過多年的發(fā)展，SELEX已經(jīng)研究和開發(fā)了一系列方法［40-43］，并在提高序列性能或探索篩選機(jī)制方面顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢。SELEX方法在文庫設(shè)計(jì)、靶標(biāo)類型、載體材料、篩選平臺(tái)等方面的改進(jìn)，使得適配體的篩選技術(shù)更加高效和準(zhǔn)確。后SELEX的適配體優(yōu)化策略，如剪裁、化學(xué)修飾和誘變，可進(jìn)一步改善適配體的結(jié)合親和力、靶向特異性、結(jié)構(gòu)剛性、熱穩(wěn)定性和核酸酶抗性。隨著計(jì)算領(lǐng)域的發(fā)展，人工智能算法也正在影響著SELEX。基于機(jī)器學(xué)習(xí)和生物信息學(xué)工具可以設(shè)計(jì)出與小分子或蛋白質(zhì)結(jié)合的適配體，將成為克服傳統(tǒng)SELEX工藝在時(shí)間、成本和可行性方面的關(guān)鍵［44］。

由于其良好的特性，例如高穩(wěn)定性、生產(chǎn)簡單、低廉的成本和生物相容性，適配體可以作為凝集素或抗體的替代品，用于TACAs的檢測和靶向識(shí)別。盡管糖和寡核苷酸之間的非共價(jià)結(jié)合的相互作用有限，因?yàn)樘穷惙肿拥慕Y(jié)構(gòu)中幾乎沒有帶電基團(tuán)和芳香環(huán)部分，限制了疏水位點(diǎn)和氫鍵的相互作用。目前已有相當(dāng)多的工作描述了TACAs的各種適配體，并具有μmol/L～nmol/L水平的親和力。本文將這些TACAs識(shí)別適配體進(jìn)行歸納和整理，依據(jù)SELEX程序中的靶標(biāo)來源，分為3類來進(jìn)行綜述：a.糖類分子作為靶標(biāo)；b.蛋白質(zhì)聚糖表位作為靶標(biāo)；c.血清糖類抗原作為靶標(biāo)。

3.1 糖類分子作為靶標(biāo)

唾液酸、聚唾液酸（poly-SA）、唾液酸化的路易斯抗原，以及某些神經(jīng)節(jié)苷脂是相對(duì)簡單且具代表性的TACAs，它們大多可以從商業(yè)化途徑獲得。直接以這些糖類分子作為靶標(biāo)，即可篩選獲得相應(yīng)的適配體。圖1為常見的TACAs結(jié)構(gòu)，表1為代表性的TACAs適配體。通過SELEX方法的改進(jìn)和后SELEX的適配體優(yōu)化，適配體的平衡解離常數(shù)（KD）可達(dá)到nmol/L水平，在生物技術(shù)、診斷和治療中顯示出了巨大的潛力。

Fig.1 Structures of TACAs圖1 TACAs結(jié)構(gòu)

Table 1 Representative TACA-binding aptamers表1 代表性的TACAs適配體

3.1.1 唾液酸

唾液酸（SA）是九碳糖神經(jīng)氨酸（Neu）酰化衍生物的總稱，廣泛分布于自然界中［55］。唾液酸是哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面聚糖的關(guān)鍵單糖構(gòu)建塊，在人類中最常見的形式是N-乙酰神經(jīng)氨酸（Neu5Ac）。癌細(xì)胞中唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性的增加導(dǎo)致細(xì)胞表面糖復(fù)合體的異常唾液酸化，有助于腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、免疫逃避和耐藥性。另一個(gè)重要的唾液酸成員是N-乙醇酰神經(jīng)氨酸（Neu5Gc），它雖然不存在于健康人的組織中，但可以表達(dá)在一些內(nèi)臟癌中，如肝癌、胃癌和結(jié)直腸癌等。因此，對(duì)唾液酸的測定為評(píng)估細(xì)胞的正常和病理過程提供了機(jī)會(huì)。

唾液酸是天然陰離子單糖，核酸分子上大量的帶負(fù)電荷磷酸基團(tuán)可能會(huì)影響寡核苷酸文庫向唾液酸分子的富集。為了篩選對(duì)Neu5Ac具有高親和力的適配體，Cho等［45］使用酶學(xué)方法以有序的方向?qū)eu5Ac固定在表面上（圖2a）。因?yàn)镹eu5Ac具有5個(gè)羥基官能團(tuán)和1個(gè)羧基官能團(tuán)，常規(guī)的化學(xué)偶聯(lián)方式導(dǎo)致多個(gè)官能團(tuán)以隨機(jī)取向固定在支持物表面。他們利用α-2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶催化Neu5Ac從胞苷5'-單磷酸唾液酸（CMP-Neu5Ac）轉(zhuǎn)移到固體支持物表面，指導(dǎo)了Neu5Ac的定向固定化。作者認(rèn)為，與隨機(jī)固定化Neu5Ac的方式相比，位點(diǎn)特異性固定化有助于文庫向Neu5Ac特定表位的富集和識(shí)別。篩選獲得的RNA適配體具有明顯的高親和力（KD=1.35 nmol/L），是對(duì)應(yīng)的凝集素（SNA）的約1/60。進(jìn)一步，他們將該適配體的核心結(jié)合域與具有自切割活性的核酶偶聯(lián)，設(shè)計(jì)了適配體酶傳感器。在Neu5Ac存在下，適配體通過構(gòu)象變化改變酶的催化活性，進(jìn)而影響底物熒光信號(hào)的釋放。適配體酶傳感器可以有效地識(shí)別Neu5Ac單體及其偶聯(lián)聚糖（唾液酸乳糖、CMP-Neu5Ac和poly-SA），而對(duì)非唾液酸糖（麥芽糖、葡萄糖和蔗糖）基本沒有響應(yīng)。然而，最近的另一項(xiàng)研究工作中對(duì)Neu5Ac不同官能團(tuán)固定化的適配體篩選結(jié)果，似乎并不完全支持以上觀點(diǎn)。一項(xiàng)比較研究［46］使用了3種不同的基于磁珠（MB）的SELEX方法來篩選Neu5Ac特異性DNA適配體（圖2b）。兩種方法屬于靶標(biāo)固定化的SELEX，由于靶標(biāo)Neu5Ac同時(shí)具有羥基和羧基，通過不同的官能團(tuán)將其固定在MB上，以研究官能團(tuán)對(duì)適配體篩選的影響。另一種方法屬于DNA文庫固定化的SELEX，將單鏈DNA文庫固定在MB上，而Neu5Ac在篩選過程中保持自然構(gòu)象以競爭性地從MB上置換適配體序列。結(jié)果表明，偶聯(lián)到MB上的官能團(tuán)的差異對(duì)篩選效率沒有明顯的影響，而DNA文庫固定化的SELEX在富集具有高親和力的序列方面表現(xiàn)出更高的效率。最優(yōu)適配體ap3-1經(jīng)截短優(yōu)化后親和力（KD=55.71 nmol/L）進(jìn)一步增加，構(gòu)建的Neu5Ac熒光生物傳感器可以輕松區(qū)分Neu5Ac與其他唾液酸單糖（Neu5Gc、3-脫氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖），選擇性性能優(yōu)于先前報(bào)道的Neu5Ac的RNA適配體。另一個(gè)唾液酸成員Neu5Gc特異性的DNA適配體序列也被開發(fā)［47］。通過將Neu5Gc羧基官能團(tuán)固定化的方式，體外篩選獲得的適配體N8具有最高結(jié)合常數(shù)值為6.68×109L/mol，但缺乏相應(yīng)的選擇性表征數(shù)據(jù)?；谠撨m配體建立的免疫層析試紙生物傳感器可用于腫瘤患者組織中的Neu5Gc的視覺檢測，是一種簡單、快速、靈敏的床旁檢測替代技術(shù)［56］。

Fig.2 Different SELEX strategy for SA aptamers圖2 針對(duì)SA適配體的不同的SELEX策略

3.1.2 聚唾液酸（poly-SA）

poly-SA是由2個(gè)及以上唾液酸殘基（Neu5Ac）形成的線性均一多聚糖鏈，聚合長度通常在8～400之間［57］。poly-SA主要附著在神經(jīng)細(xì)胞黏附因子（neural cell adhesion molecule，NCAM）上，在調(diào)節(jié)細(xì)胞間黏附、細(xì)胞遷移、神經(jīng)發(fā)育和重塑過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。正常成人組織中的NCAM缺乏poly-SA表達(dá)，但在一些腫瘤組織，如成神經(jīng)細(xì)胞瘤、腎母細(xì)胞瘤、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌中存在poly-SA的再表達(dá)［58］。因其帶有大量負(fù)電荷且具有親水性，poly-SA能減弱細(xì)胞間的黏附作用及細(xì)胞與基質(zhì)間的相互作用，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的分離、浸潤和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，以及腫瘤向腦部轉(zhuǎn)移的傾向。

最近的一項(xiàng)工作中，Chen等［48］以三聚唾液酸（tripolysialic acid，TPSA）為靶標(biāo)篩選了poly-SA特異性適配體。采用DNA文庫固定化的MBSELEX技術(shù)，獲得的核酸適配體不僅能特異性識(shí)別Neu5Ac，還能識(shí)別含有α-2,8-糖苷鍵的poly-SA。最優(yōu)適配體Apt3具有最高的親和力（KD=114.0 nmol/L）和中等特異性，它能夠?qū)PSA與其他種類的糖類（蔗糖、乳糖、麥芽糖和葡萄糖）區(qū)分開來，但也表現(xiàn)出與Neu5Ac和CMP-Neu5Ac的結(jié)合能力。以該適配體作為識(shí)別元件，他們構(gòu)建了一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的新型熒光生物傳感器應(yīng)用于人血清樣品中poly-SA的超靈敏檢測，具有檢測范圍寬、檢測限低、抗干擾性好等特點(diǎn)。

3.1.3 唾液酸化的路易斯抗原

唾液酸化的路易斯抗原是一種表達(dá)在腫瘤組織細(xì)胞表面糖脂和糖蛋白上的一組碳水化合物結(jié)構(gòu)，主要表達(dá)在粒細(xì)胞和某些腫瘤細(xì)胞表面，如結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌等［59］。它是內(nèi)皮細(xì)胞選擇素蛋白的配體，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附作用，引起腫瘤的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散［60］。

最早在2001年報(bào)道［49］的唾液酸化的路易斯抗原X（sialyl Lewis X，sLeX）特異性RNA適配體通過靶標(biāo)固定化的SELEX技術(shù)獲得，顯示出與市售抗體相當(dāng)甚至更好的結(jié)合能力，具有極低的解離常數(shù)（KD=3.3 nmol/L）。盡管該適配體與sLeX的結(jié)合親和力是乳糖的100倍，但對(duì)其他路易斯抗原（sLeA、LeX、LeA）的選擇性不明顯，結(jié)合親和力僅高出5～10倍。RNA適配體對(duì)表達(dá)sLeX的HL60細(xì)胞與E選擇素和P選擇素的黏附具有抑制作用，這表明其有潛力用作抗炎治療的細(xì)胞黏附抑制劑。直到近期才有另一項(xiàng)工作利用文庫DNA固定化的MB-SELEX技術(shù)篩選了sLeX特異性的DNA適配體［50］。最優(yōu)適配體的KD為 23.01 nmol/L，但對(duì)sLeX組成單元（LeX、Neu5Ac和半乳糖）也有較高的結(jié)合力，選擇性只有2～3倍。sLeA也被命名為碳水化合物抗原19-9（CA19-9）［61］，在結(jié)腸癌和胰腺癌患者的血清中被發(fā)現(xiàn)，并在臨床中被用作胰腺癌和其他胃腸道腫瘤的血清生物標(biāo)志物，用于判斷預(yù)后、術(shù)后監(jiān)測和監(jiān)測臨床對(duì)治療的反應(yīng)。已被報(bào)道的一個(gè)針對(duì)CA19-9的適配體［62］具有很高的親和力（KD=20.05 nmol/L），但并沒有進(jìn)行選擇性測試。此外，LeY抗原也被發(fā)現(xiàn)過表達(dá)于大多數(shù)腺上皮來源的腫瘤細(xì)胞表面，且與腫瘤的生長、浸潤、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［63］。LeY被認(rèn)為是一個(gè)重要的腫瘤相關(guān)糖抗原，臨床試驗(yàn)中已有抗LeY單克隆抗體被開發(fā)［64］，但目前尚無相應(yīng)的適配體被報(bào)道。

3.1.4 鞘糖脂（GSL）

GSL是以神經(jīng)酰胺（Cer）為母體，通過糖苷鍵與聚糖共價(jià)連接而形成的復(fù)合脂［65］。GSL是細(xì)胞膜脂的普遍成分，在分子信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞黏附和運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮重要作用，使得大多數(shù)亞型不適合作為癌癥治療的靶標(biāo)。然而，與腫瘤相關(guān)的GSL包括Globo H，以及含有唾液酸的鞘糖脂，可以通過控制細(xì)胞黏附、運(yùn)動(dòng)和生長、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)移以及耐藥性來影響癌癥的進(jìn)展［66］。

最常見的Globo系列的癌癥相關(guān)GSL抗原是Globo H神經(jīng)酰胺，Globo H殘基參與常見腫瘤內(nèi)的免疫抑制和血管生成［67］。它在幾種癌癥中過表達(dá)，包括乳腺癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、胰腺癌和前列腺癌等。Wang等［51］使用一種新的逐步序列構(gòu)建SELEX方法來開發(fā)能夠識(shí)別Globo H的DNA適配體（圖3a），即在SELEX程序中逐步延伸DNA文庫序列的長度，以確保所有可能的序列都參與篩選過程。對(duì)于第一個(gè)SELEX程序，合成含有15個(gè)堿基隨機(jī)區(qū)域的寡核苷酸文庫用于體外篩選。經(jīng)過7輪體外篩選，對(duì)產(chǎn)物克隆和測序，并選擇與Globo H具有最高親和力的特異性適配體用于序列構(gòu)建。通過在5'端和3'端將適配體的長度各延長7個(gè)堿基隨機(jī)區(qū)域，以生成新的DNA文庫用于第二個(gè)SELEX程序。在執(zhí)行第二個(gè)SELEX程序后，同樣在最優(yōu)適配體的兩端各延長7個(gè)堿基隨機(jī)區(qū)域以生成新的DNA文庫用于第三個(gè)SELEX程序。通過第三個(gè)SELEX程序獲得的命名為241163的適配體結(jié)合親和力（0.7 μmol/L）比第一個(gè)SELEX程序的名為24的適配體（23 μmol/L）好30倍，表明DNA適配體與Globo H的結(jié)合力增強(qiáng)。DNA適配體241163能夠區(qū)分與Globo H具有顯著結(jié)構(gòu)差異的聚糖（乳糖和甘露四糖），但對(duì)Globo H類似物（甘露九糖、Globo四糖和Globo五糖）有相似的結(jié)合親和力。將該適配體與有機(jī)染料偶聯(lián)可作為一種有效、準(zhǔn)確的分子標(biāo)記探針，用于在納米尺度上的Globo H直接觀察［68］。結(jié)合超分辨率顯微鏡，可視化了Globo H在癌細(xì)胞膜上的詳細(xì)分布和空間聚類，為進(jìn)一步理解癌癥中碳水化合物的空間結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系提供了依據(jù)。

Fig.3 Different SELEX strategy for GSL aptamers圖3 針對(duì)GSL適配體的不同SELEX策略

糖基部分含有唾液酸的鞘糖脂，常稱為神經(jīng)節(jié)苷脂［69-70］。神經(jīng)節(jié)苷脂分布于神經(jīng)系統(tǒng)中，其頭部復(fù)雜的碳水化合物參與細(xì)胞間相互識(shí)別，因此在細(xì)胞生長、分化，甚至癌變時(shí)具有重要作用。神經(jīng)節(jié)苷脂可根據(jù)含唾液酸的多少以及與神經(jīng)酰胺相連的糖鏈順序命名，M、D、T分別表示含1、2、3個(gè)唾液酸，下標(biāo)1、2、3表示與神經(jīng)酰胺（Cer）相連的糖鏈順序（圖1）。目前與臨床抗腫瘤治療效用最相關(guān)的是二唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂GD2［71-72］。它在正常組織中的表達(dá)水平較低，而在大多數(shù)神經(jīng)母細(xì)胞瘤（NB）、黑色素瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤以及幾種尤因氏肉瘤中大量表達(dá)。它可誘導(dǎo)酪氨酸磷酸化，激活多種激酶途徑，導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力增強(qiáng)。Zhang等［52］使用體內(nèi)和體外的組合SELEX方法成功篩選了GD2的DNA適配體DB99，對(duì)GD2具有高親和力（KD=21.21 nmol/L）。該適配體不僅可以區(qū)分GD2陽性和陰性細(xì)胞，而且可將GD2與對(duì)照神經(jīng)節(jié)苷脂（GM1a、GD3和GM2）區(qū)分開?；诖薌D2適配體，他們構(gòu)建了一種多功能、可生物降解的納米藥物靶向遞送系統(tǒng)，用于靶向轉(zhuǎn)運(yùn)阿霉素（Dox）和小干擾RNA（siRNA）藥物，在腫瘤細(xì)胞和小鼠模型中表現(xiàn)出有希望的抗癌應(yīng)用和生物安全性。同年，該課題組也報(bào)道了另一個(gè)體內(nèi)SELEX方法獲得的GD2的DNA適配體DB67［73］，同樣展現(xiàn)出對(duì)GD2陽性細(xì)胞的特異性結(jié)合，但沒有給出具體的KD值。適配體DB67介導(dǎo)的pH敏感藥物遞送系統(tǒng)，能夠靶向GD2陽性的腫瘤細(xì)胞并釋放Dox藥物，延長小鼠存活期并抑制腫瘤生長，顯示出增強(qiáng)的抗NB腫瘤治療效果。此外，其他類型的神經(jīng)節(jié)苷脂，如GD3、GM2、GM3和巖藻糖基GM1也被報(bào)道和惡性腫瘤相關(guān)聯(lián)［70］，但相應(yīng)的適配體鮮有開發(fā)。一個(gè)關(guān)于神經(jīng)節(jié)苷脂GM3的DNA適配體在2004年被報(bào)道。為了獲得具有高親和力的適配體，Masud等［53］采用靶標(biāo)固定的MB-SELEX程序從陽離子修飾的DNA文庫中篩選唾液酸乳糖結(jié)合適配體。修飾的DNA文庫是通過對(duì)稱和隨后的不對(duì)稱PCR制備的，使用在C5位置帶有末端氨基的胸苷三磷酸（TTP）衍生物（圖3b）和其他三個(gè)天然核苷酸，以及KOD Dash DNA聚合酶，所得DNA文庫中除前引物區(qū)域外所有胸苷殘基均被修飾的胸苷替換。獲得的適配體由于胸苷上帶正電荷的氨基修飾，增加了對(duì)帶負(fù)電荷的唾液酸乳糖的結(jié)合（KD為μmol/L級(jí)），但沒有進(jìn)行選擇性測試。另一個(gè)被報(bào)道的GM3適配體［54］是利用微流體裝置快速篩選獲得的，結(jié)合親和力為17.51 μmol/L。由于該適配體尚未進(jìn)行結(jié)構(gòu)上的優(yōu)化，較低的親和力是可以理解的。

3.2 蛋白質(zhì)聚糖表位作為靶標(biāo)

表位特異性SELEX是針對(duì)聚糖區(qū)域有效篩選適配體的另一種可能性。在這種類型SELEX程序中（圖4a），靶標(biāo)分子為工程化的糖基化肽或糖基化蛋白，且通常需要引入相應(yīng)的非糖基化變體作為陰性靶標(biāo)來進(jìn)行反向篩選，以引導(dǎo)靶向聚糖部位的序列富集。該方法的最大優(yōu)勢在對(duì)于一些難以化學(xué)合成和商業(yè)化獲取的復(fù)雜結(jié)構(gòu)聚糖，特別是N-連接聚糖的適配體篩選工作中的可行性。此外，某些N/O-糖基化位點(diǎn)處的核心肽序列也是抗原決定簇，因此篩選獲得的適配體可同時(shí)具有對(duì)肽和糖兩個(gè)區(qū)域的雙重識(shí)別。

Fig.4 SELEX strategy for targeting glycan epitope of proteins圖4 蛋白質(zhì)聚糖表位作為靶標(biāo)的SELEX策略

3.2.1 黏蛋白型O-糖基化

MUC1（CD227）是黏蛋白家族（mucins）的一員，一種I型跨膜糖蛋白［75］。正常細(xì)胞中，MUC1胞外區(qū)結(jié)構(gòu)為一個(gè)大的、高度糖基化的N端結(jié)構(gòu)域，而在腫瘤中，雖然其蛋白質(zhì)核心的糖基化位點(diǎn)與正常MUC1相同，但碳水化合物側(cè)鏈明顯要短得多，且以唾液?；鶠槟┒耍▓D4b）。簡單的黏蛋白型O-糖基化抗原，如Tn抗原（CD175）、TF抗原（CD176）和唾液酸Tn抗原（sTn，CD175s），是抗腫瘤治療的非常有吸引力的靶點(diǎn)，因?yàn)樗鼈冊(cè)诖蠖鄶?shù)胃癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌、乳腺癌和胰腺癌中高度表達(dá)，而在健康組織中未檢測到［76］。

MUC1的胞外多肽骨架含有空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定一致的可變數(shù)目重復(fù)序列（variable number of tandem repeats，VNTR），該區(qū)域富含O-糖基化位點(diǎn)。腫瘤細(xì)胞上MUC1糖鏈的改變，導(dǎo)致該區(qū)域的核心肽抗原表位和糖抗原表位暴露出來，從而具有免疫原性。一項(xiàng)適配體篩選工作以5個(gè)MUC1串聯(lián)重復(fù)序列的O-糖基化形式MUC1-5TR-GalNAc（Tn抗原）作為靶標(biāo)，獲得了短的單鏈DNA適配體［77］。最佳的適配體5TRG2對(duì)Tn抗原的親和力達(dá)到KD為18.6 nmol/L，且可以很容易地區(qū)分含有或不含有GalNAc殘基的肽靶標(biāo)。電泳遷移率位移測定顯示出5TRG2對(duì)單獨(dú)的肽（5TR）和糖（GalNAc）這兩個(gè)區(qū)域也有一定程度的結(jié)合。合成DNA適配體可以用作遞送載體，將光動(dòng)力治療劑等前藥貨物特異性地輸送到上皮癌細(xì)胞，光激活以產(chǎn)生破壞性的單線態(tài)氧而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。

3.2.2 蛋白質(zhì)N-糖基化

一些腫瘤相關(guān)蛋白質(zhì)的N-糖基化在近年來受到越來越多的關(guān)注，盡管其確切的糖基化模式和糖型變化尚未完全明了，已有少數(shù)研究者發(fā)展了靶向這些特征聚糖結(jié)構(gòu)的適配體。

血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一種高度保守的外分泌型糖蛋白，可與肝素結(jié)合且選擇性誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖［78］。VEGF在腫瘤組織中的高水平表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生和預(yù)后不良有關(guān)，如肺癌、肝癌、大腸癌、卵巢腫瘤和神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤等?？寡苄纬墒且种颇[瘤的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移的研究方向，因此VEGF已成為藥物開發(fā)的重要靶點(diǎn)。VEGF的N-糖基化肽片段是肝素結(jié)合域的暴露部分，靶向結(jié)合該表位的DNA適配體已被成功開發(fā)［79］。由于在SELEX策略中包括了糖基化VEGF肽靶標(biāo)的正向篩選和非糖基化變體的反向篩選，最好的核酸適配體能夠區(qū)分僅因單個(gè)糖基化位點(diǎn)而不同的肽變體，且對(duì)糖基化VEGF肽的親和力（KD=2.5 μmol/L）是非糖基化變體的52倍。然而這項(xiàng)研究并未顯示核酸適配體識(shí)別天然VEGF的可行性，后續(xù)也沒有在細(xì)胞和體內(nèi)應(yīng)用的研究進(jìn)展。

前列腺特異性抗原（prostate specific antigen，PSA）是由前列腺上皮細(xì)胞產(chǎn)生的分泌蛋白，具有極高的組織器官特異性。PSA在正常人血清中含量極微，是診斷和預(yù)測前列腺癌的金標(biāo)準(zhǔn)。已有研究表明，在腫瘤發(fā)生過程中，PSA的聚糖結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生細(xì)微變化，檢測這些特異性糖基化變化可能為臨床應(yīng)用提供新的視角［80］。Díaz-Fernández等［81］首次開發(fā)了靶向PSA聚糖結(jié)構(gòu)域的DNA適配體。通過在SELEX 程序中引入非糖基化的PSA蛋白進(jìn)行反向篩選，可將序列引導(dǎo)至聚糖部分。獲得的適配體雖然能夠區(qū)分人PSA和非糖基化蛋白，但對(duì)具有相似聚糖結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)沒有區(qū)分能力。為了實(shí)現(xiàn)核酸適配體的更精細(xì)靶向，作者引入了更嚴(yán)格的反向篩選步驟，使用PhoSL凝集素阻斷序列對(duì)蛋白核心巖藻糖的結(jié)合［82］。通過利用這種方法，新開發(fā)的適配體PSAG-1可以識(shí)別蛋白質(zhì)最內(nèi)層的糖殘基和糖基化位點(diǎn)周圍的肽區(qū)域。結(jié)合對(duì)適配體的結(jié)構(gòu)預(yù)測和截?cái)嘌芯?，證實(shí)了適配體PSAG-1不僅具有高親和力（KD為72 nmol/L），而且能夠?qū)⑷薖SA與具有非常相似的聚糖結(jié)構(gòu)蛋白（如中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（NGAL）和甲胎蛋白（AFP））區(qū)分開來。在電化學(xué)傳感器中使用糖靶向PSA適配體和抗PSA適配體（顯示僅與PSA的蛋白質(zhì)區(qū)域結(jié)合）構(gòu)建三明治夾心結(jié)構(gòu)，可用于定量檢測血清中的人PSA。

還有一些有趣的工作，巧妙地利用非腫瘤肽或蛋白作為聚糖支架，篩選了靶向某些腫瘤相關(guān)的復(fù)雜聚糖結(jié)構(gòu)的適配體。Li等［74］以轉(zhuǎn)鐵蛋白作為糖鏈來源，其胰蛋白酶解產(chǎn)物中的特定糖肽為陽性靶標(biāo)，引入人工合成的非糖肽用于反向篩選，成功獲得了對(duì)一個(gè)雙觸角雙半乳糖基二唾液酸化N-聚糖結(jié)構(gòu)A2G2S2結(jié)合的適配體（圖4c）。由于在SELEX程序中使用分子印跡的磁珠作為糖肽靶標(biāo)固定和分離的基底材料，該方法避免了繁瑣的聚糖制備過程，并使天然復(fù)雜聚糖的構(gòu)象易于暴露?；贏2G2S2聚糖在肝癌患者中上調(diào)的表達(dá)量，作者驗(yàn)證了該適配體在肝癌細(xì)胞靶向成像中的應(yīng)用。最近，該課題組［83］又提出了一種基于分子印跡磁珠的消減SELEX策略，獲得了高甘露糖聚糖的適配體。該策略選取糖蛋白核糖核酸酶B和非糖蛋白核糖核酸酶A作為交替的篩選靶標(biāo)，兩種蛋白質(zhì)除了一個(gè)高甘露糖基化位點(diǎn)外具有相同的三級(jí)結(jié)構(gòu)。篩選獲得的高甘露糖聚糖的適配體不僅具有對(duì)乳腺癌細(xì)胞和正常乳腺細(xì)胞的區(qū)分能力，而且展示了對(duì)病毒抗原蛋白的有效識(shí)別和阻斷能力。盡管這兩個(gè)工作中適配體對(duì)聚糖的親和力（μmol/L水平）和選擇性并不突出，但為開發(fā)其他有價(jià)值的復(fù)雜聚糖的適配體提供了一種新思路。

3.3 血清糖類抗原作為靶標(biāo)

一些最常見的臨床上用于癌癥診斷和惡性進(jìn)展監(jiān)測，以及疾病復(fù)發(fā)的預(yù)后生物標(biāo)記物，是腫瘤相關(guān)血清糖類抗原［84-86］。它們是腫瘤細(xì)胞分泌的一系列糖蛋白類物質(zhì)，已被證明具有異常的癌癥相關(guān)糖基化。如表2所示，這些糖類抗原大多因?qū)?yīng)的單克隆抗體識(shí)別而命名，如碳水化合物抗原CA125、CA153、CA724、CA199等。糖類抗原對(duì)于惡性腫瘤的敏感性尤為高，依據(jù)其數(shù)值能夠相對(duì)特異性地提示腫瘤在人體內(nèi)的生長部位，并判斷患者的病情嚴(yán)重程度。盡管已有多種基于抗體的商業(yè)檢測試劑盒可用，識(shí)別這些糖類抗原的新型適配體的開發(fā)仍然具有重要價(jià)值，例如在成本和批量檢測上的優(yōu)勢。以這些血清糖類抗原作為靶標(biāo)，已有相應(yīng)的適配體被篩選出來［62，87-89］。除此之外，常見的血清腫瘤標(biāo)志物如癌胚抗原（CEA）、堿性磷酸酶（ALP）也都是糖蛋白，以其篩選獲得的適配體具有對(duì)蛋白質(zhì)和聚糖的混合識(shí)別［89-90］。適配體通常展現(xiàn)出很高的親和力（KD值大多在nmol/L水平），可方便地用于生物傳感器的構(gòu)建和高靈敏度的疾病標(biāo)志物檢測［91-92］。

Table 2 Common clinical serum CA biomarkers and their aptamers表2 臨床應(yīng)用中常見的血清糖類標(biāo)志物及其適配體開發(fā)

對(duì)癌癥早期診斷的特異性和敏感性的更高需求，促使人們基于對(duì)某些血清蛋白質(zhì)的特定糖型的檢測來尋找新的生物標(biāo)記物用于癌前期的診斷。典型的實(shí)例是AFP，一種用于檢測肝臟疾病的血清學(xué)生物標(biāo)志物。雖然AFP是用于肝癌（HCC）診斷的廣泛驗(yàn)證的糖蛋白，但血清AFP水平不能區(qū)分HCC和良性肝病。與慢性肝病相比，HCC患者的巖藻糖基化指數(shù)顯著提高，因此提出了另一種基于AFP的糖基化形式（AFP-L3組分）的腫瘤標(biāo)記物，已被FDA批準(zhǔn)用于肝硬化階段早期HCC的血清檢測［93］。然而目前，AFP-L3的檢測主要依賴于其對(duì)凝集素的反應(yīng)性［94-95］，尚無相應(yīng)的適配體被開發(fā)。

4 總結(jié)與展望

自1990年代核酸適配體首次報(bào)道以來，適配體的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用有了巨大的增長，但只有少數(shù)具有足夠的親和力、特異性和穩(wěn)定性的適配體可實(shí)際應(yīng)用，可用于聚糖識(shí)別的適配體更加有限。本綜述主要總結(jié)和討論了癌癥中特征性的糖基化改變，以及腫瘤相關(guān)碳水化合物抗原核酸適配體的開發(fā)進(jìn)展。據(jù)統(tǒng)計(jì)，已報(bào)道的TACAs識(shí)別適配體只有十多余種，適配體的親和力在微摩爾到納摩爾水平不等。研究最多的TACAs是一些簡單和代表性的聚糖結(jié)構(gòu)，如唾液酸、poly-SA、sLeX、GD2等。這些糖類分子易于合成純化和從商業(yè)化途徑獲得，可直接作為SELEX程序中的靶標(biāo)分子，篩選獲得的適配體顯示出在生物傳感、靶向成像、藥物遞送和治療等領(lǐng)域中的應(yīng)用潛力。表位特異性SELEX為聚糖適配體的開發(fā)提供了另一種可能性，它以工程化的糖蛋白或糖肽作為靶標(biāo)，通過正反向的篩選程序?qū)⑽膸煨蛄袕?qiáng)制引導(dǎo)至聚糖及其周圍區(qū)域。該策略使得一些復(fù)雜結(jié)構(gòu)聚糖，特別是N-連接多天線聚糖的適配體篩選具有可行性，因?yàn)檫@些糖鏈的化學(xué)合成和獲取過程耗時(shí)、費(fèi)力且產(chǎn)量低。盡管該方法目前還不夠成熟，如受到糖蛋白不均一糖型的限制，但為開發(fā)其他復(fù)雜聚糖形式的TACAs適配體提供了一種新思路。此外，臨床上用于腫瘤診斷和檢測的血清糖類抗原，如CA724、CA153、CA125、CA199適配體也有被報(bào)道，相對(duì)有限的數(shù)量可能是因?yàn)檫@些血清糖類抗原本身已經(jīng)具有成熟的抗體。然而，相對(duì)于抗體，適配體仍然是一股新興的力量，需要進(jìn)一步的發(fā)展以確保持續(xù)進(jìn)步。因此，迫切需要高性能的聚糖識(shí)別適配體來促進(jìn)基于適配體的科學(xué)研究和轉(zhuǎn)化應(yīng)用。

雖然針對(duì)TACAs識(shí)別適配體的研究已經(jīng)取得了較大進(jìn)展，但仍然存在許多的應(yīng)用挑戰(zhàn)和改進(jìn)空間。在臨床轉(zhuǎn)化方面仍需更多努力，將核酸適配體在癌癥診斷和治療中的應(yīng)用提升到一個(gè)新的程度。目前，有數(shù)十到數(shù)百種適配體正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)或臨床前研究，它們識(shí)別的生物標(biāo)志物絕大多數(shù)都是糖蛋白。但值得注意的是，這些針對(duì)糖蛋白生物標(biāo)志物的適配體大都是在沒有指向靶標(biāo)特定區(qū)域的情況下篩選獲得的，糖基化是否參與適配體的結(jié)合也并沒有完全表征［96-97］，且獲批用于臨床治療的適配體藥物仍然只有一種pegaptanib。

在未來的工作中需要在以下方面繼續(xù)努力。一方面，高性能的聚糖識(shí)別適配體的開發(fā)仍然是一大難點(diǎn)。集中于建立寡核苷酸與聚糖之間親和作用的研究已經(jīng)顯示了長足的進(jìn)步，通過SELEX變體策略獲得的最優(yōu)適配體的親和力可達(dá)到nmol/L水平。然而聚糖結(jié)合實(shí)體需要能夠區(qū)分微小變化的單糖連接方式和分支異構(gòu)體，如何增強(qiáng)適配體對(duì)特定TACAs靶標(biāo)的選擇性似乎是更大的挑戰(zhàn)。另一方面，TACAs適配體在實(shí)際生物學(xué)環(huán)境中的應(yīng)用尚且不足?；诟咝V和質(zhì)譜的深度分析已使我們能夠測定各種臨床樣品中靶蛋白上的癌癥特異性糖型，以建立新的糖型特異性癌癥生物標(biāo)志物，這些標(biāo)志物將是適配體開發(fā)的新靶標(biāo)。但大多數(shù)直接從SELEX分離出的適配體未能達(dá)到實(shí)際應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)，后SELEX策略對(duì)于提高適配體的質(zhì)量具有重要作用。在這種情況下，需要在制定有針對(duì)性的后SELEX策略中做出努力，結(jié)合截?cái)?、突變、修飾等傳統(tǒng)方法和新興的計(jì)算機(jī)輔助方法（例如人工智能和分子模擬技術(shù)等）建立基于其構(gòu)效關(guān)系的適配體指導(dǎo)數(shù)據(jù)庫，以獲得高質(zhì)量的治療性適配體。隨著SELEX技術(shù)的不斷提高，相信將有更多新型的TACAs適配體被開發(fā)，特異性也將進(jìn)一步提高，核酸適配體將成為臨床實(shí)踐中具有巨大價(jià)值的工具。