基于分子對接和步進序列群的蓖麻毒素核酸適配體序列優(yōu)化*

劉 佳 楊志芳 王 闖 肖 蘭 郭 磊 ** 吳海霞 謝劍煒

（1）河北科技大學化學與制藥工程學院，石家莊 050091；2）軍事醫(yī)學研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室，北京 100850；3）中央民族大學藥學院，教育部民族醫(yī)藥重點實驗室，北京 100081）

蓖麻毒素（ricin communis agglutinin 60，RCA60）是最早發(fā)現(xiàn)的植物毒素蛋白，也是一種凝集素，在油料作物——蓖麻的種子（蓖麻子）中高豐度存在，一般可占到植物種子重量的1%～5%。RCA60的分子質(zhì)量約66 ku，結(jié)構(gòu)由A、B兩條鏈組成，其中B鏈是一種對半乳糖（胺）具有特異性的凝集素，可與真核細胞膜上的糖蛋白或糖脂的半乳糖位點結(jié)合，介導A鏈進入胞內(nèi)，而A鏈具有N-糖苷酶活性，能夠識別真核細胞28S核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）中含有5'-GAGA-3'序列的特定核苷酸（nucleotide，nt）區(qū)域即α帚曲霉蛋白-蓖麻毒素環(huán)（α-sarcin-ricin loop，SRL）結(jié)構(gòu)域，脫去其特定的腺嘌呤（如水解小鼠細胞28SrRNA的A4324位點腺苷酸上的N-糖苷鍵），使核糖體失活并不可逆地抑制蛋白質(zhì)合成，繼而導致細胞死亡［1］。

RCA60是同時被列入國際《禁止化學武器公約》和國際《禁止生物和毒素武器公約》的唯一一種蛋白質(zhì)毒素［2］，其小鼠靜脈染毒的半數(shù)致死劑量為5～10 μg/kg［3］，具有劇烈毒性，且來源廣泛、易于制備、無特效解毒藥。近年來國內(nèi)外發(fā)生了包括誤食蓖麻子在內(nèi)的多起中毒事件，以及多起RCA60白色粉末信件等恐怖事件，說明該類型毒素對公共安全和民眾健康存在高度危害。一直以來，發(fā)展靈敏快速的分析檢測方法、篩選有效的抑制劑等都是RCA60防治研究的重要內(nèi)容。

通過體外文庫技術(shù)——指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）所篩選到的核酸適配體（aptamer），具有高親和力、高特異性、可功能化修飾等特點，且易于實現(xiàn)在體外的大量、快速合成，被譽為“化學抗體”［4］，是一類高效的親和識別元件。對于RCA60，目前已經(jīng)報道了幾種RNA或單鏈DNA（ssDNA）適配體，例如Fan等［5］篩選出特異性結(jié)合RCA60 A鏈的RNA適配體RA80，Lamont等［6］篩選出的特異性結(jié)合B鏈的DNA適配體SSRA1、本課題組針對RCA60全蛋白進行篩選所獲得的 ssDNA 適配體 A3、C1、C5［7］、L7、L14、P3［8］等。

一般而言，通過SELEX技術(shù)所獲得的適配體由兩端固定引物和中間的一段非引物序列組成，典型全長為70～130 nt，但絕大多數(shù)情況下，并不是全長序列均參與靶分子的識別，核心識別區(qū)域的長度為20～50 nt不等，其他則為輔助支撐結(jié)構(gòu)或無效序列［9］，因此，在后續(xù)的應用或機理研究中需要首先針對全長適配體進行一定的結(jié)構(gòu)裁剪［10］。

自1990年SELEX出現(xiàn)至今，國內(nèi)外已經(jīng)出現(xiàn)了多種針對適配體的裁剪方法，絕大多數(shù)為經(jīng)驗試錯法。針對模擬產(chǎn)生的全長適配體的二級結(jié)構(gòu)，人為界定其局部高級結(jié)構(gòu)（莖環(huán)、假結(jié)等）后，再采用去除未配對結(jié)構(gòu)、去除或縮短莖、縮小環(huán)等手法獲得截短結(jié)構(gòu)［11］，還可對于截短結(jié)構(gòu)再次進行隨機裁剪［12］、定點突變［13］，或通過遺傳算法等構(gòu)建小型突變文庫等獲取更優(yōu)結(jié)構(gòu)［14］。前期本課題組［5］通過構(gòu)建步進式文庫，構(gòu)建向左縮進、向右縮進、兩端收縮、兩端延伸序列群的途徑，以合理“窮盡”適配體序列中與靶蛋白產(chǎn)生親和力的大多數(shù)可能結(jié)果，針對重組促紅細胞生成素α，成功裁剪優(yōu)化出一條27 nt的ssDNA適配體。對于RCA60的全長適配體，早期僅采用二維結(jié)構(gòu)模擬及簡單的局部剪裁等思路，例如SSRA1是將60 nt全長的適配體保留隨機區(qū)結(jié)構(gòu)，經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附法獲得其與RCA60在不同溶液中的解離常數(shù)（dissociation constant，KD）值為5～22 nmol/L。

多種適配體的結(jié)構(gòu)剪裁方法極大依賴于經(jīng)驗和直覺，具有較大的工作量以及不確定性。本工作以分子對接模擬為指導、靈活引入步進式序列群策略，驅(qū)動實驗結(jié)果進行評估驗證。首先將本課題組前期篩選出的3條全長ssDNA適配體L14、P3、L7，在去掉引物區(qū)保留其隨機區(qū)核苷酸序列的基礎上，通過三維（3D）分子對接預測了隨機區(qū)適配體L7r、P3r、L14r與RCA60的結(jié)合情況，并通過所預測的蓖麻毒素活性口袋具體結(jié)合位點，分別確定了3條適配體的最短結(jié)合單元。繼而構(gòu)建基于最短結(jié)合單元的兩端延長步進序列群，使用表面等離子體共振技術(shù)（surface plasmon resonance，SPR）測定該序列群與RCA60的親和力和動力學參數(shù)，成功快速篩選得到親和力更強、序列最短的最優(yōu)適配體。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

微量RCA60、蓖麻凝集素（ricin agglutinin，RCA120）、相思子毒素（abrin）均由本實驗室微量制備，電泳純度大于95%。L14（CAGCTCAGAAGCTTGATCCTGTGACAGCAGGGGGAGT GTGCGTAATAAGCGAGGAGATGACTCGAAGTCGTGCATAATCA）、P3（CAGCTCAGAAGCTTGATCCTGTGAGTCGACCTGAGCCCGAGCAGGTTCCGAATCCGTGGACTCGAAGTCGTGCATCTGCA）、L7（CAGCTCAGAAGCTTGATCCTGTGGACAGGAGCTGGTTAAATAGGCAGCACCGAGCA GACTCGAAGTCGTGCATCTGCA）、L14rm（CGTAATAAGCG）、P3r（GAGTCGACCTGAGCCCGAGCAGGTTCCGAATC）、L7rm-2（TGGACAGGAGCTGGTTAA）等ssDNA寡核苷酸序列由生工生物工程公司合成（HPLC純化）。N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）、1-乙基 -3-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl）-carbodiimide hydrochloride，EDC）、乙醇胺、氫氧化鈉、乙酸鈉-乙酸緩沖液（pH 4.0）均購自Cytiva公司（美國），其中EDC、NHS、乙醇胺來源于氨基偶聯(lián)試劑盒（Cytiva，BR100050）；4-（2-羥乙基）哌嗪-1-乙磺酸（4-（2-hydroxyethyl）piperazine-1-ethanesulfonic acid，HEPES）、Tween 20購自于Sigma公司（Missouri，美國）。Zeba Spin脫鹽柱（截止分子質(zhì)量7 ku）購自于Thermo（美國）。超純水為18.2 MΩ·cm，由Milli-Q A10水凈化系統(tǒng)（Millipore，MA，美國）制備。所有其他試劑均為分析純及以上純度，購自于國藥化學試劑有限公司（北京，中國）。

RCA60是高毒性生物毒素，所有相關(guān)實驗均應根據(jù)生物安全操作指南進行。所有實驗都在通風良好的通風櫥中進行，并佩戴防護手套和護目鏡。實驗結(jié)束后，通過沸水蒸煮30 min或高壓滅菌（121℃，0.2 MPa）20 min，對含有相關(guān)毒素的樣品進行完全洗消，然后用堿液（0.1 mol/L NaOH，pH>10）浸泡1 h以上［15］。

1.2 SPR

所有親和力及動力學參數(shù)測定均在Biacore T200分子互作儀上進行（Cytiva，美國），緩沖液為HBS-T（10 mmol/L HEPES，140 mmol/L NaCl，0.5% Tween 20，用NaOH調(diào)pH為7.4），包括緩沖液配制用水及進樣針清洗、儀器管路清洗用水在內(nèi)的儀器用水均經(jīng)過滅菌處理并用0.22 μm濾膜（津騰，中國）過濾后使用。

蛋白質(zhì)在共價偶聯(lián)前經(jīng)脫鹽處理，通過Nanodrop儀（Eppendorf，德國）測定其260 nm、280 nm處的紫外吸收，并使用Lowry-Kalcker經(jīng)驗公式“蛋白質(zhì)濃度（g/L）=1.45A280-0.74A260”計算獲得蛋白質(zhì)濃度［16］，繼而加入10 mmol/L乙酸鈉-乙酸緩沖液（pH 4.0）稀釋至50 mg/L。

1.2.1 芯片活化與蛋白質(zhì)的共價偶聯(lián)

使用Series S Sensor Chip CM5（Cytiva，美國）芯片［17］，使用 100 mmol/L EDC、391.2 mmol/L NHS混合溶液流經(jīng)CM5芯片中的Fc 2通道表面，流速為10 μl/min，持續(xù)時間為900 s，以活化CM5芯片上葡聚糖的羧基。向Fc 2通道注入50 mg/L 的RCA60（pH 4.0）溶液，流速為10 μl/min，持續(xù)時間120 s，荷正電的RCA60（等電點為7.0［18］）通過靜電作用吸引到荷負電的葡聚糖表面后，其氨基與葡聚糖上被活化的羧基實現(xiàn)共價偶聯(lián)。每次蛋白質(zhì)偶聯(lián)水平均固定為5 000響應單位（response unit，RU），最后用HBS-T緩沖液沖洗2 min至基線平穩(wěn)［5］。Fc 1為空白通道。

1.2.2 樣品處理及測定

所有寡核苷酸序列均以超純水配制為100 μmol/L的儲備液，按使用量分裝并置于-20℃條件下儲存，避免反復凍融。使用時，所有寡核苷酸序列均以HBS-T緩沖液稀釋至2 μmol/L，95℃，5 min變性后并緩慢恢復至室溫，然后稀釋為合適的濃度梯度，提交至SPR進行測定，測定溫度為25℃。在Biacore T200中，裝載入已偶聯(lián)好蛋白質(zhì)的CM5芯片，緩沖液為HBS-T，流速為30 μl/min，結(jié)合時間120 s，解離時間180 s，再生條件為0.1 mmol/L NaOH，30 μl/min，30 s，再生后基線變化維持在±5 RU范圍內(nèi)。

對于全長及剪裁的各種適配體，首先在1 μmol/L的濃度下進行單次結(jié)合實驗，判斷序列變化對結(jié)合相互作用的影響；再對出現(xiàn)陽性結(jié)果的樣品進行多循環(huán)動力學（multiple cycle kinetics，MCK）測定，進行親和力和動力學參數(shù)評價。所有操作由Biacore T200 Control Software（2.0.0）軟件控制。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

使用Biacore T200 Evaluation Software（2.0.0）軟件，采用Kinetics，1∶1結(jié)合模式進行擬合，獲得結(jié)合速率常數(shù)（association velocity constant，ka）、解離速率常數(shù)（dissociation velocity constant，kd）、KD等數(shù)據(jù)。以U<15，χ2接近1篩選出合理的擬合結(jié)果。

1.3 分子對接

所有寡核苷酸序列通過Mfold（http://www.mfold.org/mfold/applications/dna-folding-form.php）獲取其二維（2D）結(jié)構(gòu)，條件為5 mmol/L Mg2+，140 mmol/L Na+，從中選取Gibbs自由能（ΔG）最低的模擬結(jié)構(gòu)?；谏鲜?D結(jié)構(gòu)，通過RNAcomposer（https://rnacomposer.cs.put.poznan.pl/）實現(xiàn)3D結(jié)構(gòu)預測，并采用OpenBabel 2.4.1軟件獲取pH 7.4下的RCA60（PDB ID：3RTJ）和多條候選寡核苷酸序列的3D結(jié)構(gòu)，并使用SYBYL-X2.0基于Tripos力場進行能量最小化以減少構(gòu)建模擬系統(tǒng)中的非正常構(gòu)象。針對RCA60，設置其A鏈的rRNA N-糖苷酶活性口袋中的14個關(guān)鍵殘基（R48、D75、N78、Y80、V81、D96、D100、G121、Y123、R134、E177、R180、E208、W211）為適配體對接位點，將RCA60與多條序列通過H-DOCK（http://hdock.phys.hust.edu.cn/）進行分子對接［19］。計算前 100個姿勢的DS值和配體RMSD值，進一步選擇10種較低DS的姿勢。

2 結(jié)果與討論

針對經(jīng)SELEX篩選獲得的核酸適配體時，一般均需通過結(jié)構(gòu)剪裁，獲取較短的適配體序列，既保留了其針對靶分子的核心序列，也節(jié)省了經(jīng)濟成本，這也成為了適配體應用于生物傳感、即時診斷、DNA納米技術(shù)、藥物靶向遞送之前的必備步驟。

另外，在篩選和優(yōu)化適配體時，合適的適配體與靶分子間結(jié)合作用的預測及評價方法是必要的。預測方法方面，已涌現(xiàn)出使用高通量測序技術(shù)、FASTAptamer、APtaCluster等工具對實驗產(chǎn)生的大量序列進行測序、聚類、模型搜索以及多維度評分，之后對篩選的結(jié)果進行結(jié)構(gòu)模擬并進一步優(yōu)化的策略，其中通過Mfold、Ufold、RNAcomposer、ARES等方法進行2D、3D結(jié)構(gòu)預測，并使用HDOCK、GRAMM、Z-DOCK等對適配體和靶分子進行分子對接預測，這種策略允許更精確地評估適配體-靶分子復合物的結(jié)合能力，可為進一步的序列截短或突變提供有價值的信息［20］，但目前尚未見基于分子對接指導適配體結(jié)構(gòu)剪裁的系統(tǒng)報道。實驗方法方面，普遍使用凝膠電泳遷移率變動分析［21］、SPR［22］、生物膜干涉技術(shù)［23］、等溫滴定量熱法［24］、微量熱泳動法［25］、分析超速離心技術(shù)［26］，根據(jù)結(jié)合作用前后的特征值變化判定親和力及得到其他相關(guān)特征值如動力學參數(shù)、熱力學參數(shù)等［27］。其中SPR是一種實時無標記的檢測技術(shù)，在分子相互作用評價方面應用甚廣，可以高通量地提供親和力及動力學特征參數(shù)。本工作即以分子對接和SPR為核心技術(shù)，以RCA60為靶蛋白，提出了并評估以3D分子對接模擬及步進序列群指導適配體優(yōu)化的策略，可僅提交少量序列至SPR進行結(jié)合評價實驗。

2.1 適配體全長與隨機序列的分子對接與SPR測定

本團隊前期通過毛細管電泳-SELEX技術(shù)，采用非涂層毛細管或者中性涂層毛細管，進行了4輪篩選，分別篩選到了L14、P3、L7等3條可與RCA60結(jié)合的適配體序列，全長80 nt，均存在多個莖環(huán)結(jié)構(gòu)，具有較低的ΔG和KD值。經(jīng)SPR測定，與已報道的ssDNA適配體SSRA1相比，P3略低于SSRA1的KD值，但L7、L14的KD值要高2～4倍（圖1）。該SPR評價方法所得的結(jié)果與篩選者Lamont等［6］獲取的KD值有所差異，應該是由于使用的評價方法不同引起的。本工作所有的評價實驗都基于SPR進行，這就保持了較好的評價一致性和可信度。

Fig.1 The 2D structures,Gibbs’ energy,and the SPR evaluation results of four aptamers,SSRA1,L14,P3 and L7

2.2 隨機區(qū)適配體與分子對接

Goto等［28-29］根據(jù)RCA60和抑制劑的復合物的X射線晶體衍射結(jié)果揭示出，RCA60的活性口袋中，G121、Y123、R134、E177、R180、E208、W211組成了初級口袋，R48、D75、N78、V81、D96、D100組成了次級口袋，兩者被Y80殘基劃分，Y80類似于“門”殘基，其運動可導致抑制劑從初級口袋滑向次級口袋，發(fā)生相互作用，這也可能是抑制劑作用不佳的根本原因［30-31］。通過使用H-DOCK，在pH 7.4的條件下，針對RCA60的活性口袋14個氨基酸殘基進行分子對接，預先模擬判斷裁剪的適配體與蛋白質(zhì)的活性口袋是否存在結(jié)合，并使用DS值概算比較各適配體間結(jié)合力大小，選取合適的適配體序列進行下一步評價與驗證。

先對全長適配體進行直接裁剪，保留隨機區(qū)域的發(fā)卡結(jié)構(gòu)（具體剪裁位置如圖1的2D結(jié)構(gòu)圖中的虛線位置所示），分子對接結(jié)果顯示，L14r（34 nt，DS-262.8，RMSD 92.5 ?）、P3r（32 nt，DS-250.1，RMSD 82.0 ?）、L7r（32 nt，DS-292.4，RMSD 99.4 ?）的DS值皆優(yōu)于陰性序列40 T（40 nt，DS-239.3，RMSD 91.5 ?）。其中 L14r共與RCA60的11個關(guān)鍵氨基酸殘基結(jié)合（R48、D75、N78、Y80、D96、D100、G121、R134、R180、E208、W211），距離小于5 ?的預測結(jié)合位點有20個，P3r中的4個核苷酸與RCA60活性口袋中8個殘基（R48、N78、Y80、D96、D100、R134、R180、W211）緊密連接，包括4個次級口袋殘基與3個初級口袋殘基，共存在12個距離小于5 ?的預測結(jié)合位點，L7r的2D結(jié)構(gòu)為通過1個核苷酸相連的2個莖環(huán)形式，其分子對接預測的結(jié)合位點則產(chǎn)生在2個莖部分，與9個關(guān)鍵氨基酸相連（R48、N78、Y80、D96、D100、Y123、R134、E208、W211），存在15個距離小于5 ?的預測結(jié)合位點（圖2）。根據(jù)分子對接結(jié)果所示，推測三者具有良好的與RCA60結(jié)合能力。

Fig.2 The H-DOCK docking results of L14r,P3r and L7r

對3條隨機區(qū)適配體進行SPR評價的結(jié)果表明，L14r、P3r、L7r 與 RCA60 的KD值分別為（109±20）、（167±19）、（228±68）nmol/L，與L14、P3、L7適配體的KD值（（900±80）、（151±26）、（526±40）nmol/L）相比，L14r、L7r的KD值下降至全長適配體的1/9和1/2，提示這兩條全長適配體中兩側(cè)過長的序列結(jié)構(gòu)在與靶蛋白作用的過程中阻礙了結(jié)合。對于L14r，還可以從分子對接結(jié)果直觀性的發(fā)現(xiàn)，與活性口袋緊密結(jié)合僅有一段核苷酸，提示可能還有進一步優(yōu)化空間。P3全長序列與截短序列KD值基本一致，兩端長鏈形成的空間結(jié)構(gòu)對結(jié)合影響較不明顯，說明固定序列為無效序列。

2.3 確定最短結(jié)合單元及構(gòu)建步進延長序列群

將L14r、P3r、L7r進行分子對接后，可順利獲取3條適配體與RCA60活性口袋的結(jié)合位點。針對上述3條隨機區(qū)適配體，僅選取其與RCA60活性口袋所結(jié)合的序列部分，將之往外擴展至該部分能自折疊為一定的3D結(jié)構(gòu)，將上述序列作為最短適配體結(jié)合單元（minimum aptamer binding motif，MABM）。將L14r、P3r、L7r的MABM分別命名為L14rm、P3rm和L7rm，分別比原隨機區(qū)適配體截短了23、14、22 nt。進一步，對上述MABM構(gòu)建兩端延長型的序列群，以期延長的游離核苷酸鏈能通過與靶蛋白產(chǎn)生更多的相互作用位點而起到一定的輔助結(jié)合效果，除了有利于溶液條件下的親和力評價，亦可明確MABM與RCA60結(jié)合的具體作用規(guī)律。序列群組成如圖3所示，共17條序列。

Fig.3 The Mfold results of elongated sequences of L14r,P3r,and L7r

圖4給出了3條MABM及其延長序列群的分子對接結(jié)果，總結(jié)歸納了序列群的每條寡核苷酸與RCA60活性口袋中14個關(guān)鍵氨基酸的最短距離，以此來推斷兩者結(jié)合的緊密程度。L14rm僅保留了L14r中3'端的莖部，分子對接預測L14rm（DS-232.1，RMSD 94.5 ?）與10個關(guān)鍵氨基酸相連（R48、N78、Y80、D96、D100、Y123、E177、R180、E208、W211），存在18個距離小于5 ?的預測結(jié)合位點。以步進n=2構(gòu)建其延長序列群，共含5條序列。P3rm是含有5個堿基對的獨立發(fā)卡結(jié)構(gòu)，DS值為-235.0，RMSD值為109.9 ?，與10個關(guān)鍵氨基酸相連（R48、D75、N78、Y80、D100、Y123、R134、E177、R180、E208）。其延長序列群則構(gòu)建了6條序列。

L7r預測結(jié)合位點位于2個莖末端之間（GGAGCT），將兩側(cè)延長兩個堿基，形成了含有2個堿基對的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，即將其作為L7r的MABM（L7rm）。L7rm（DS-272.5，RMSD 91.1 ?）分子對接預測其與13個關(guān)鍵氨基酸相連（R48、D75、N78、Y80、D96、D100、G121、Y123、R134、E177、R180、E208、W211），存在20個距離小于5 ?的預測結(jié)合位點。其延長序列群則構(gòu)建了3條序列。

經(jīng)SPR測定，L14rm、L7rm的KD值為（64±30）、174 nmol/L，說明兩者與RCA60具有很好的結(jié)合，驗證了分子對接中預測的結(jié)合位點的正確性，但P3rm的結(jié)構(gòu)過于柔性，未測得有效的KD值，此時將其延長序列群重新逼近原P3r序列，應可有助于恢復一定的結(jié)合力。因此，在確保MABM能嵌合進入RCA60活性口袋的前提下，構(gòu)建兩端延長序列群的策略是較為有效、簡捷的。

Fig.4 The H-DOCK results of elongated sequences of L14rm,P3rm and L7rm

兩端延長序列群中，L14rm-1～L14rm-5兩端分別延長了2對堿基，L14rm-1～L14rm-3 DS值逐漸升高，連接關(guān)鍵氨基酸數(shù)目整體減少，提示此時未形成穩(wěn)定的莖部結(jié)構(gòu)；L14rm-4和L14rm-5，分子對接結(jié)果為L14rm-4（DS-258.1，RMSD 94.4 ?）、L14rm-5（DS-281.4，RMSD 133.8 ?），關(guān)鍵性氨基酸連接數(shù)目逐步增多（圖4），對DS值較低的L14rm-5（DS-281.4，RMSD 133.8 ?）進行SPR測定，KD值為（158±46）nmol/L（表1，圖5）。在H-DOCK 結(jié)果中，L14rm-4的 5'端 A3、G4、T5、G6、T7、G8、C9 與 RCA60 的 R125、E127、Q128、L133、I205、T206、N209、S210、R213、S228、P229、I230、Q231形成相互作用、L14rm-5的5'端的G1、G2、G3、G4、A5、G6、T7、G8與RCA60的N88、N97、A101、D110、V111、Q112、N113、R114、Y115、T116、F117形成相互作用，提示此時延長的核苷酸鏈起到一定的固定支撐的作用，輔助兩者結(jié)合，但最優(yōu)適配體仍然為L14rm。

P3rm不與RCA60進行結(jié)合，將之逐步延長兩端直到構(gòu)成P3r結(jié)構(gòu)，其中P3rm-2、P3rm-6存在較低的 DS 值，KD值分別為（375±175）、（629±126）nmol/L（表1，圖5），進一步延長，兩側(cè)核苷酸鏈形成第二個莖后恢復至P3r的結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生更優(yōu)的結(jié)合能力，提示P3r中第二個莖為輔助結(jié)合的關(guān)鍵性結(jié)構(gòu)，最終選擇P3r為P3的最優(yōu)適配體。

L7rm-1（12個氨基酸，20個結(jié)合位點）、L7rm-2（6個氨基酸，7個結(jié)合位點）、L7rm-3（10個氨基酸，14結(jié)合位點）連接氨基酸與距離小于5 ?的預測結(jié)合位點皆有所減少，提示結(jié)構(gòu)的延長阻礙了莖環(huán)結(jié)構(gòu)進入蛋白質(zhì)的活性口袋。而對接結(jié)果L7rm-1（DS-227.1，RMSD 95.0 ?）、L7rm-2（DS-283.8，RMSD 95.2 ?）、L7rm-3（DS-249.4，RMSD 112.4 ?）顯示DS值先下降再升高，L7rm-2與RCA60結(jié)合效果更佳。SPR測定結(jié)果表明，L7rm-1、L7rm-3不具有結(jié)合能力，而L7rm-2的KD值為（120±1）nmol/L（表1，圖5），為L7的最優(yōu)適配體。

Fig.5 SPR multiple cycle kinetic measurement results of L14r/P3r/L7r,L14rm/P3rm/L7rm and thereafter elongated sequences with RCA60

Table 1 The affinity and docking results of all truncated aptamers with RCA60

3 結(jié)論

針對目前適配體剪裁仍較依賴于經(jīng)驗驅(qū)動的現(xiàn)狀，本文針對蓖麻毒素的適配體，以分子對接模擬為指導、靈活引入步進式序列群策略，驅(qū)動實驗結(jié)果評估驗證，避免了人為判斷因素，方便、快捷地獲得了最優(yōu)適配體序列。所采用的分子對接的結(jié)果參數(shù)（DS值、RMSD值）以及對接模型的模擬預測具有較高的可信度，有效預測了各序列的結(jié)合可能性。所選取的最短適配體結(jié)合單元，在兩端延長步進序列群的輔助下，僅使用了17條適配體，就得到了親和力更強、序列最短的最優(yōu)適配體。L14rm、P3r、L7rm-2 的KD值分別為（64±30）、（167±19）、（120±1）nmol/L。最優(yōu)適配體與RCA60的親和力提高到全長適配體的14、1、4倍，也說明了本套基于分子對接和步進序列群的蓖麻毒素適配體序列優(yōu)化策略的獨特價值。預期將在適配體的結(jié)構(gòu)剪裁方面有所裨益，也為蓖麻毒素的最優(yōu)適配體在傳感和抑制劑等方面的應用奠定基礎。