基于AS1411適配體的DNA-RNA雜交載體的抗腫瘤研究*

趙昌麒 葛科立 賈子涵 白佳瑤 張金玉 葛銀林 **

（1）青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，青島 266071；2）青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，青島 266071）

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與腫瘤細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制息息相關(guān)［1-3］，人體的免疫系統(tǒng)具有免疫監(jiān)視的功能，通常能夠識(shí)別、殺傷并及時(shí)清除體內(nèi)突變細(xì)胞以維持機(jī)體的穩(wěn)定，防止腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。然而，腫瘤細(xì)胞常?？梢蕴颖軝C(jī)體免疫系統(tǒng)的識(shí)別和攻擊，在體內(nèi)迅速增殖和轉(zhuǎn)移，從而形成腫瘤［4］。腫瘤的免疫逃逸機(jī)制中，腫瘤細(xì)胞大量表達(dá)的免疫檢查點(diǎn)，如 PD-L1［5］、CTLA-4［6］、B7-H4［7］等蛋白質(zhì)因子可直接抑制免疫系統(tǒng)應(yīng)答或招募分泌免疫抑制因子的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，造成免疫抑制。

TIGIT［8］（T cell Ig and ITIM domain）是脊髓灰質(zhì)炎病毒受體（poliovirus receptor，PVR）/Nectin家族成員，是一種新發(fā)現(xiàn)的免疫檢查點(diǎn)。它由細(xì)胞外免疫球蛋白可變區(qū)（IgV）結(jié)構(gòu)域、I型跨膜結(jié)構(gòu)域、具有經(jīng)典免疫受體酪氨酸抑制基序（ITIM）和免疫球蛋白酪氨酸尾（ITT）基序的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成。TIGIT可以抑制NK細(xì)胞效應(yīng)，減少NK細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷。通常，在長(zhǎng)期炎癥反應(yīng)或慢性抗原的反復(fù)刺激下［9-10］，T細(xì)胞功能失調(diào)或衰竭并上調(diào)許多免疫抑制性受體（IRs），包括程序性細(xì)胞死亡受體1（PD-1）和帶有免疫球蛋白和ITIM結(jié)構(gòu)域的T細(xì)胞免疫受體（TIGIT），腫瘤細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞（APCs）在腫瘤微環(huán)境（TME）中表達(dá)IR配體，從而使腫瘤細(xì)胞具備了逃避免疫監(jiān)視的能力。因此，若能有效降低腫瘤細(xì)胞TIGIT蛋白的表達(dá)，將有效降低腫瘤細(xì)胞的免疫耐受。p21基因是一種抑癌基因［11］，是細(xì)胞周期依賴性激酶抑制劑家族中的主要成員之一，p21受抑癌基因p53調(diào)控［12］，在抑制腫瘤發(fā)生中起調(diào)節(jié)作用；p21基因在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)常維持在極低的水平［13］，可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡，有效削弱腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力。此外，p21基因參與T細(xì)胞活化［14］和先天性免疫反應(yīng)的激活，并提高免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的有效殺傷。因此，若能有效促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的p21基因表達(dá)或抑制TIGIT基因的表達(dá)，便可抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。近年來(lái)，核酸藥物療法發(fā)展迅速，核酸藥物以其用量小、效率高、毒性低的優(yōu)點(diǎn)備受青睞，這其中如小干擾RNA（siRNA）、小激活RNA（saRNA）、mRNA等［15-19］是最常用的核酸藥物。

然而，核酸藥物的發(fā)展受到遞送系統(tǒng)的嚴(yán)重限制［20］。常用的RNA遞送系統(tǒng)［21］如脂質(zhì)體、陽(yáng)離子聚合物、可變電荷納米聚合物和病毒載體等都存在細(xì)胞毒性大、無(wú)靶向性和生物安全性等問(wèn)題。因此，若能構(gòu)建一種低毒性高靶向性安全高效的RNA遞送系統(tǒng)，將對(duì)核酸藥物的發(fā)展提供新的思路。DNA/RNA雜交雙鏈可以抵抗核酸酶降解，比較穩(wěn)定，且對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性。核酸適配體作為一種寡核苷酸分子［22-26］，具有復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其性質(zhì)類似抗體蛋白，可特異性結(jié)合靶標(biāo)分子，被廣泛應(yīng)用于診斷、納米探針、食品檢測(cè)和藥物開發(fā)等領(lǐng)域。核酸適配體較小，靶向性高，因此若能將適配體與RNA相連，并輔以適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)保護(hù)，即可實(shí)現(xiàn)小RNA藥物的靶向遞送。1999年，Bates等［27］在研究G-四鏈體結(jié)構(gòu)適配體GRO29A時(shí)發(fā)現(xiàn)，部分腫瘤細(xì)胞開始出現(xiàn)了凋亡現(xiàn)象，這種適配體經(jīng)改進(jìn)成為了今天的AS1411核酸適配體。AS1411適配體是一種G-四鏈體結(jié)構(gòu)適配體，其靶蛋白是腫瘤細(xì)胞表面的核仁素（nucleolin，NCL），作為一種腫瘤細(xì)胞表面跨膜蛋白，核仁素每隔數(shù)小時(shí)將會(huì)內(nèi)吞入細(xì)胞，基于這一特性，AS1411核酸適配體被廣泛應(yīng)用于靶向藥物的制備和靶向載體的構(gòu)建。近年來(lái)，AS1411核酸適配體應(yīng)用發(fā)展迅速，常常作為靶向遞送工具適配體使用，Khatami等［28］開發(fā)了一種新型靶向遞送系統(tǒng)，將AS1411作為靶向分子，阿霉素（doxorubicin，DOX）結(jié)合到介孔二氧化硅納米粒子（MSN）中，并應(yīng)用殼聚糖覆蓋MSN的表面，制備納米復(fù)合物實(shí)現(xiàn)miR-21的靶向遞送。Carvalho等［29］用AS1411適配體優(yōu)化了傳統(tǒng)的脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)，合成AS1411適配體修飾的脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)，能夠在含有Mg2+的溶液中形成納米聚集體，應(yīng)用于宮頸癌的治療。此外，AS1411核酸適配體作為納米探針被廣泛使用，用于膠質(zhì)瘤細(xì)胞的穩(wěn)定檢測(cè)［30］和NCL蛋白的超分辨率納米成像［31］。

因此，本研究采用G-四鏈體結(jié)構(gòu)核酸適配體AS1411作為靶向分子，通過(guò)DNA/RNA雜交雙鏈連接小RNA藥物p21saRNA和TIGITsiRNA，在特定緩沖體系的輔助下，組裝構(gòu)建成AS1411-DNA/RNA-sxRNA雜交載體，使之同時(shí)具靶向性和藥物功能，并研究雜交載體的小RNA藥物靶向遞送和抗腫瘤效果。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑

SKOV3人卵巢癌細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；氟代修飾RNA、siRNA、saRNA和AS1411適配體由生工生物（上海）股份有限公司合成提供；Trizol、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；Monarch RNA Cleanup Kit購(gòu)自NEB公司；Tris-Glycine電泳液、電轉(zhuǎn)液購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；DMEM（高糖）培養(yǎng)基購(gòu)自上海逍鵬生物科技有限公司；1.5 mol/L Tris-HCl（pH=8.8），1 mol/L Tris-HCl（pH=6.8），10% SDS溶液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；5×TBM緩沖液（5.4 g Tris，2.75 g硼酸，0.22 g四水合乙酸鎂加水定容至100 ml）（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；胰酶EDTA消化液（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；青鏈霉素混合液（100×）（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；PVDF膜Millipore 0.45 μm購(gòu)自上海逍鵬生物科技有限公司；抗熒光猝滅封片劑、羊抗小鼠-HRP標(biāo)記二抗、羊抗兔-HRP標(biāo)記二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Anti-P21和anti-TIGIT均購(gòu)自武漢艾博泰克生物科技有限公司。

1.2 AS1411-DNA-RNA-sxRNA納米載體的制備

1.2.1 AS1411-DNA-RNA-sxRNA納米載體的組裝

設(shè)計(jì)并合成目的序列，將所需序列合成并添加CTP、UTP氟代化學(xué)修飾（圖1），單鏈DNA模板及單鏈硫代修飾DNA由生工生物（上海）股份有限公司提供，RNA及DNA序列如表1所示。

Fig.1 Chemical formulas of 2'-fluoro-modified CTP and UTP in DNA-RNA hybrid nanocarriers

將b鏈與相應(yīng)的a、c鏈等摩爾混合，加入等體積MgCl2雜交緩沖液（2×PBS，2 mmol/L MgCl2），于熱循環(huán)儀加熱80℃ 3 min、50℃ 5 min、25℃15 min、4℃ 20 min，完成DNA-RNA雜交載體的制備，制備好的雜交載體可存于4℃低溫環(huán)境備用。

1.2.2 AS1411-DNA-RNA-sxRNA納米載體的組裝分析

以攜帶P21saRNA的雜交載體（記為P21 saRNA）為例，攜帶TIGITsiRNA的雜交載體（記為TIGIT siRNA）組裝步驟相同。按照各組分兩兩排列組合進(jìn)行分組，最后一組為三組分等摩爾加入反應(yīng)體系，分別如下：P21-a（a）、AS1411-b（b）、P21-c（c）、P21-a+P21-c（ac）、P21-a+AS1411-b（ab）、AS1411-b+P21-c（bc）、P21-a+AS1411-b+P21-c（abc），TIGIT siRNA和AS1411-NC雜交載體用同樣的方法檢測(cè)組裝。按雜交步驟于熱循環(huán)儀上反應(yīng)，反應(yīng)后在每個(gè)體系內(nèi)加入適量DNA/RNA上樣緩沖液。其中，各組分體積見表2。由于DNA-RNA雜交鏈的觀察在特定緩沖體系下更為明顯，因此須配制8% TBM聚丙烯酰胺凝膠并使用TBM電泳緩沖液（1×）進(jìn)行電泳。凝膠配方見表3，并在100 V恒壓條件下電泳，電泳完成后取下凝膠，置于加入適量溴化乙錠的TBM電泳液中染色，拍照、記錄組裝情況。

Table 2 Consumption of each component of DNA RNA hybrid nanocarriers

1.2.3 AS1411-DNA-RNA-sxRNA納米載體的血清穩(wěn)定性測(cè)試

制備1 nmol左右的AS1411-DNA-RNA-sxRNA雜交載體，加入至含10 %胎牛血清的完全培養(yǎng)基，37 °C 恒溫孵育，并在 0、1、2、4、8、12、24、48、72、96 h取樣，每次取到的樣品立即加入DNA或RNA上樣緩沖液并凍存于-80℃超低溫冰箱中進(jìn)行TBM丙烯酰胺凝膠電泳，觀察，拍照記錄。

1.3 分析AS1411-DNA-RNA-sxRNA納米載體進(jìn)入細(xì)胞效果

1.3.1 顯微鏡檢測(cè)納米載體入胞情況

人卵巢癌SKOV3細(xì)胞正常培養(yǎng)，隨后接種于24孔板中（約1×105個(gè)細(xì)胞/孔）。用加FAM標(biāo)記的P21-c（2'-F RNA）或TIGIT-c（2'-F RNA）替換不加熒光標(biāo)記的RNA單鏈，組裝DNA-RNA雜交載體。加入培養(yǎng)板內(nèi)至終濃度為1 μmol/L，恒溫培養(yǎng)48 h，用PBS緩沖液反復(fù)漂洗3次，并使用DAPI染色液對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行熒光染色，使用熒光正置顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。

1.3.2 CCK-8檢測(cè)納米載體對(duì)細(xì)胞生存率的影響

取狀態(tài)良好的人卵巢癌SKOV3細(xì)胞，將其接種于4個(gè)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板過(guò)夜培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組接種P21 saRNA、TIGIT siRNA雜交載體，轉(zhuǎn)染試劑實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染p21siRNA、TIGITsaRNA（記為TF-P21和TF-TIGIT）；陰性對(duì)照組接種NC雜交載體（圖2b）、含AS1411適配體和對(duì)照小RNA的雜交載體（記為AS1411-NC，圖2c）；轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組轉(zhuǎn)染空白小RNA（記為TF-NC）；其中轉(zhuǎn)染試劑組在轉(zhuǎn)染12 h后進(jìn)行換液處理。按照0、24、48和72 h的時(shí)間梯度每隔24 h取出一塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。每孔加入10 μl CCK-8溶液，輕輕搖晃混勻，并于恒溫CO2培養(yǎng)箱37℃孵育1 h；使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度值，記錄數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)P21、TIGITmRNA水平

SKOV3細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板過(guò)夜培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)良好，細(xì)胞匯合度為30%～40%時(shí)，用AS1411-DNA-RNA-sxRNA雜交載體孵育細(xì)胞。按照實(shí)驗(yàn)組孵育P21 saRNA、TIGIT siRNA雜交載體（終濃度為1 μmol/L），陰性對(duì)照組孵育NC雜交載體（終濃度為1 μmol/L）和AS1411-NC雜交載體，空白對(duì)照組加入正常培養(yǎng)基，孵育時(shí)間為48 h。隨后將細(xì)胞取出培養(yǎng)箱并用PBS沖洗細(xì)胞，每孔加入1 ml Trizol 裂解液裂解細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞總RNA的提取。提取完成后，測(cè)定提取總RNA濃度，再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)接種P21 saRNA及TIGIT siRNA納米載體后目的基因的mRNA水平變化。

1.3.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)P21、TIGIT蛋白變化

SKOV3細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板（密度為2×105/孔）后過(guò)夜培養(yǎng)，按照實(shí)驗(yàn)組孵育組裝好的P21 saRNA、TIGIT siRNA雜交載體（終濃度為1 μmol/L），陰性對(duì)照組孵育NC雜交載體（終濃度為1 μmol/L），空白對(duì)照組加入正常培養(yǎng)基，孵育48 h后更換含雜交載體的培養(yǎng)基繼續(xù)孵育24 h。用PBS緩沖液清洗細(xì)胞，RIPA組織細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)。使用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，等濃度上樣至各個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔，上樣量為15～20 μl/孔，電泳、電轉(zhuǎn)后用5% BSA封閉液封閉2～4 h，用TBST震蕩沖洗PVDF膜，孵育β-actin/P21/TIGIT蛋白一抗過(guò)夜，TBST沖洗后孵育二抗1 h，TBST再次沖洗膜后，避光配制ECL發(fā)光液，于顯影儀上顯影并記錄。

1.3.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SKOV3細(xì)胞的遷移能力

在6孔板背部，使用直尺和黑色記號(hào)筆均勻劃線，橫穿過(guò)孔，板內(nèi)每孔5條直線，并接種適量細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組接種P21 saRNA、TIGIT siRNA雜交載體（終濃度均為1 μmol/L），陰性對(duì)照組孵育NC雜交載體（圖2b）和AS1411-NC雜交載體（圖2c），空白對(duì)照組正常培養(yǎng)。孵育48 h后，更換含雜交載體的培養(yǎng)基繼續(xù)孵育24 h。用10 μl移液器吸頭使用直尺垂直于背后的橫線劃痕，用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞3次，充分洗去劃下的細(xì)胞，加入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，并放入恒溫CO2培養(yǎng)箱37℃條件下培養(yǎng)，按照劃線后0、24、48 h的時(shí)間順序拍照記錄，用Image J測(cè)定細(xì)胞的劃痕愈合率。

1.3.6 Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力

首先，提前1 d對(duì)Transwell小室進(jìn)行準(zhǔn)備工作，在檢測(cè)卵巢癌SKOV3細(xì)胞的侵襲能力時(shí)須使用基質(zhì)膠。將基質(zhì)膠均勻鋪在Transwell小室上室中，35 μl/孔。將鋪好基質(zhì)膠的Transwell小室放在37℃恒溫CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)；次日使用前水化基質(zhì)膠，操作步驟為每孔加入60 μl無(wú)血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱培養(yǎng)40 min；當(dāng)檢測(cè)卵巢癌SKOV3細(xì)胞的遷移能力時(shí)，不使用基質(zhì)膠。

接種細(xì)胞到6孔板，將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組接種P21 saRNA、TIGIT siRNA雜交載體，陰性對(duì)照組孵育NC雜交載體（圖2b）和AS1411-NC雜交載體（圖2c），空白對(duì)照組正常培養(yǎng)。處理48 h后，更換含雜交載體的培養(yǎng)基繼續(xù)孵育24 h。孵育完成后，用DMEM無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓處理12 h；向Transwell小室上室中加入200 μl細(xì)胞懸液，下室中加入600 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，其中，檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的遷移能力在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；恒溫培養(yǎng)后PBS清洗3次上室；甲醇固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，PBS清洗殘留結(jié)晶紫，晾干；隨機(jī)選取5個(gè)低倍鏡（100×），在顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡

將細(xì)胞接種至6孔板，分為空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組接種P21 saRNA、TIGIT siRNA雜交載體，陰性對(duì)照組孵育NC雜交載體（圖2b），空白對(duì)照組正常培養(yǎng)。孵育48 h后更換含雜交載體的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。隨后按照細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)，并記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 GraphPad Prism v5.01 軟件（La Jolla，CA，USA）進(jìn)行分析作圖，采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均以獨(dú)立3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（SEM）表示。采用單因素方差分析（One-way ANOVA）檢驗(yàn)均值的意義。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和相關(guān)分析。假設(shè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)按α=0.05判定，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AS1411-DNA-RNA-sxRNA雜交載體組裝成功

以組裝P21 saRNA雜交載體為例，分別將DNA單鏈和兩條RNA單鏈，記為b鏈及a、c鏈，等摩爾加入同一體系內(nèi)，與等體積雜交緩沖液混合，孵育，然后進(jìn)行TBM凝膠電泳（圖2d）。圖2a為AS1411-DNA-RNA-sxRNA雜交載體的完整結(jié)構(gòu)，圖2b為去掉AS1411適配體后陰性對(duì)照NC雜交載體的結(jié)構(gòu)，圖2c為攜帶陰性對(duì)照小RNA的DNA-RNA雜交載體。TBM凝膠電泳（圖2d）從左至右為 50 bp DNA ladder、AS1411-b、P21-a、P21-c、P21-a+P21-c、P21-a+AS1411-b、AS1411-b+P21-c、P21-a+AS1411-b+P21-c，結(jié)果說(shuō)明AS1411-DNA-RNA-sxRNA雜交載體的組裝成功。

Fig.2 Structure and assembly of DNA-RNA hybrid nanocarriers

2.2 AS1411-DNA-RNA-sxRNA雜交載體可抵抗核酸酶的降解

裸核酸常受到核酸酶的降解，其抗降解能力非常弱。因此，本研究通過(guò)將RNA中的CTP和UTP進(jìn)行2'-F修飾，并對(duì)DNA鏈的ATP進(jìn)行硫代修飾，以提升裸核酸的抗降解能力。以P21 saRNA雜交載體為例，取等摩爾的AS1411-b、P21-a、P21-c，并組裝1 nmol的雜交載體，向體系內(nèi)添加胎牛血清至10%，37℃恒溫水浴，按時(shí)間段分別取樣并-80℃低溫保存，統(tǒng)一進(jìn)行TBM凝膠電泳。結(jié)果顯示，在不同時(shí)間，DNA-RNA雜交載體在血清中出現(xiàn)降解，48 h后雜交載體仍然穩(wěn)定存在，在72 h后開始出現(xiàn)明顯降解，雜交載體在凝膠中正確的位置仍存在清晰的條帶，DNA-RNA雜交載體具備優(yōu)良的抗降解能力（圖3）。

2.3 AS1411-DNA-RNA-sxRNA雜交載體能靶向腫瘤細(xì)胞

為檢測(cè)AS1411-DNA-RNA-sxRNA雜交載體是否能夠靶向結(jié)合腫瘤細(xì)胞，在雜交載體上添加了FAM綠色熒光標(biāo)記（標(biāo)記位置見圖2），隨后將組裝好的熒光標(biāo)記雜交載體與SKOV3細(xì)胞共培養(yǎng)48 h。可以發(fā)現(xiàn)，雜交載體孵育后，攜帶AS1411核酸適配體的雜交載體P21 saRNA成功結(jié)合卵巢癌SKOV3細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)外出現(xiàn)大量綠色熒光信號(hào)，陰性對(duì)照雜交載體NC未能結(jié)合SKOV3細(xì)胞（圖4）。激光共聚焦顯微鏡照片（圖5）顯示，細(xì)胞表面及內(nèi)部都出現(xiàn)了明顯的綠色熒光，對(duì)照組為不攜帶AS1411適配體的小RNA，細(xì)胞表面及其內(nèi)部均無(wú)明顯綠色熒光。

Fig.3 Serum stability of DNA-RNA hybrid nanocarriers

這一結(jié)果說(shuō)明，AS1411-DNA-RNA-sxRNA雜交載體存在靶向性，雜交載體可與腫瘤細(xì)胞表面的NCL蛋白結(jié)合，在細(xì)胞內(nèi)吞作用下將NCL蛋白及其表面吸附的DNA-RNA雜交載體成功攝入。這一過(guò)程中，AS1411適配體作為靶向工具將小RNA藥物帶入細(xì)胞，隨后與之相連的小RNA藥物將與目的基因相互作用，使腫瘤細(xì)胞的p21和TIGIT基因的表達(dá)得到調(diào)控。

Fig.4 Fluorescence microscopy verified that aptamers successfully bound and entered the cells

Fig.5 Confocal laser microscopy verified that aptamers successfully bound and entered the cells

2.4 AS1411-DNA-RNA-sxRNA細(xì)胞毒性低于轉(zhuǎn)染試劑

相較于傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染試劑存在較為嚴(yán)重的細(xì)胞毒性，AS1411-DNA-RNA-sxRNA雜交載體可有效避免轉(zhuǎn)染試劑所帶來(lái)的細(xì)胞毒性。由于大量的AS1411適配體會(huì)促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡，因此對(duì)于以AS1411適配體作為靶向載體的方案需要對(duì)其細(xì)胞毒性進(jìn)行準(zhǔn)確的評(píng)估。實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組?？瞻讓?duì)照組為正常培養(yǎng)的SKOV3細(xì)胞，陰性對(duì)照組為不含AS1411適配體的雜交載體（記為NC，結(jié)構(gòu)見圖2b）；實(shí)驗(yàn)組為使用轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染p21saRNA和TIGITsiRNA的細(xì)胞，記為TF-P21和TF-TIGIT，孵育攜帶P21 saRNA和TIGIT siRNA雜交載體的細(xì)胞記為P21 saRNA和TIGIT siRNA，攜帶陰性對(duì)照小RNA的記為AS1411-NC（結(jié)構(gòu)見圖2c）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DNA-RNA雜交載體在細(xì)胞毒性方面要優(yōu)于傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染試劑（圖6a），AS1411-NC的細(xì)胞活力遠(yuǎn)大于TF-NC，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。同樣，AS1411-DNA-RNA-sxRNA雜交載體孵育后SKOV3細(xì)胞的細(xì)胞活力下降（圖6b），孵育P21 saRNA和TIGIT siRNA后細(xì)胞活力相較于對(duì)照組下降顯著，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。

Fig.6 CCK-8 detects the cytotoxicity of DNA-RNA hybrid nanocarriers

2.5 AS1411-DNA-RNA-sxRNA有效調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄

實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果顯示，在mRNA水平上，P21 saRNA有效升高了p21基因的表達(dá)，TIGIT siRNA有效降低了TIGIT基因的表達(dá)（圖7），差異呈統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P<0.05，**P<0.01）。

Fig.7 Relative levels of p21 mRNA and TIGIT mRNA after hybrid nanocarrier treatment

2.6 AS1411-DNA-RNA-sxRNA有效調(diào)控靶基因的蛋白質(zhì)表達(dá)

從P21 saRNA/TIGIT siRNA雜交載體孵育的細(xì)胞中提取總蛋白質(zhì)。Western blot結(jié)果顯示，P21 saRNA組與對(duì)照組相比，P21條帶（18 ku左右）灰度明顯增加，TIGIT siRNA組與對(duì)照組相比，TIGIT條帶（30 ku左右）明顯變淺，符合預(yù)期（圖8）。3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)灰度值分析，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P<0.05，**P<0.01）。

Fig.8 Expression of P21 and TIGIT in tumor cells after treating with AS1411-DNA-RNA-sxRNA nanocarriers

2.7 AS1411-DNA-RNA-sxRNA抑制腫瘤細(xì)胞的遷移能力

通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)孵育P21 saRNA和TIGIT siRNA后，細(xì)胞的遷移能力變化，劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖9a。P21 saRNA組和TIGIT siRNA組在24 h及48 h對(duì)SKOV3細(xì)胞的遷移能力影響顯著，劃痕愈合速度明顯低于對(duì)照組，其劃痕閉合率如圖9b所示，計(jì)算公式如下，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。

劃痕閉合率=［（At=0h-At=Δh）/At=0h］×100%

At=0h：劃痕0 h后測(cè)量的閉合面積

At=Δh：劃痕h小時(shí)后測(cè)量的閉合面積

Fig.9 Scratch assay to detect cell migration ability

2.8 AS1411-DNA-RNA-sxRNA抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲能力

通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)孵育雜交載體后的細(xì)胞遷移與侵襲能力。實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，對(duì)照組為正常培養(yǎng)的SKOV3細(xì)胞、孵育NC雜交載體的細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組為孵育P21 saRNA和TIGIT siRNA雜交載體的SKOV3細(xì)胞。隨機(jī)選取5個(gè)低倍鏡（100×），在顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)目并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（圖10）?？梢园l(fā)現(xiàn)，使用P21 saRNA和TIGIT siRNA雜交載體分別孵育細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞的侵襲（圖10a）和遷移能力（圖10b）顯著下降，SKOV3細(xì)胞穿過(guò)小室的數(shù)量明顯減少，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

Fig.10 Analysis of migration and invasion ability of cells by Transwell

2.9 AS1411-DNA-RNA-sxRNA促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡

將AS1411-DNA-RNA-sxRNA雜交載體和人卵巢癌SKOV3細(xì)胞共培養(yǎng)后，對(duì)SKOV3細(xì)胞的凋亡率進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，P21 saRNA和TIGIT siRNA處理后腫瘤細(xì)胞的凋亡率顯著上升（圖11），與空白對(duì)照組相比，差異呈現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01），其中TIGIT siRNA處理腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率大于P21 saRNA處理后腫瘤細(xì)胞的凋亡率。

Fig.11 The apoptosis rate of tumor cell was detected by flow cytometry after treating with AS1411-DNA-RNA-sxRNA

3 討論

根據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，卵巢癌發(fā)病人數(shù)高達(dá)31萬(wàn)，死亡人數(shù)高達(dá)21萬(wàn)。其中，卵巢癌在女性總癌癥發(fā)病率中占5%，為一種嚴(yán)重危害女性生命健康的癌癥。卵巢癌的發(fā)展過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜而多階段的過(guò)程，與重要基因改變的長(zhǎng)期積累有著緊密的聯(lián)系。抑癌基因的表達(dá)抑制及腫瘤免疫逃逸會(huì)使腫瘤的發(fā)生發(fā)展極為迅速，常見腫瘤免疫抑制因子如PD-L1、B7-H4、CTLA-4等則會(huì)使腫瘤細(xì)胞免受免疫系統(tǒng)的攻擊。

核酸既是遺傳信息的儲(chǔ)存者又是遺傳信息的傳遞者，其在生命活動(dòng)中起著不可或缺的作用。腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展都與基因密碼或基因表達(dá)的異常有關(guān)。因此，從基因水平對(duì)基因的表達(dá)加以控制是治療腫瘤的有效策略，尤其是控制mRNA的水平?？刂苖RNA的生成或降解，利用雙鏈小RNA如saRNA和siRNA是理想的方法。但是小RNA沒有靶向性、易受核酸酶的降解且不易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。如何克服上述問(wèn)題將小RNA遞送到細(xì)胞內(nèi)，是RNA藥物研發(fā)的核心問(wèn)題。現(xiàn)有的遞送系統(tǒng)如脂質(zhì)體載體、化學(xué)偶聯(lián)載體、可變電荷轉(zhuǎn)運(yùn)體、脂質(zhì)多聚復(fù)合物、聚合物納米顆粒等，雖成功將小RNA藥物遞送進(jìn)入細(xì)胞，但都存在一些缺陷，如無(wú)靶向性、細(xì)胞毒性大、免疫原性高、轉(zhuǎn)染效率差等，這就需要研發(fā)一個(gè)低毒靶向高效的RNA遞送系統(tǒng)。因此，若能設(shè)計(jì)一種靶向腫瘤細(xì)胞而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)害的遞送載體，對(duì)于癌癥的治療將有極大的臨床意義。

核酸-配體結(jié)合物的裸核酸遞送系統(tǒng)［32-33］，是一種全新的遞送系統(tǒng)研發(fā)思路，這一遞送系統(tǒng)常通過(guò)化學(xué)合成技術(shù)將小RNA藥物與部分小分子化合物共價(jià)結(jié)合，以賦予小RNA藥物對(duì)于特定細(xì)胞或分子的靶向性，這些化合物常為寡糖［34］、葉酸等低毒性小分子有機(jī)物并與細(xì)胞膜存在極高的親和性，部分化學(xué)配體如葉酸等［35］，本就為細(xì)胞表面受體的配體分子。這些遞送系統(tǒng)具有效果優(yōu)良、細(xì)胞毒性低、靶向性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)。然而，這些遞送系統(tǒng)同樣存在極高的化工技術(shù)難度、RNA與配體的共價(jià)結(jié)合效率差、純化效率低等問(wèn)題，需要進(jìn)行多次合成、純化，合成成本高昂。為解決這一問(wèn)題，本研究用核酸適配體替代化學(xué)配體分子，用DNARNA雜交技術(shù)將配體分子與小RNA藥物相連接，降低技術(shù)難度和成本，為裸核酸遞送提供成本更低廉、操作更簡(jiǎn)便的方案。

核酸適配體作為靶向配體，其優(yōu)點(diǎn)是核酸適配體分子小、免疫原性低和可透過(guò)血腦屏障。其中，G-四鏈體結(jié)構(gòu)核酸適配體具有廣泛的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。G-四鏈體主要由鳥嘌呤之間形成氫鍵，組成一個(gè)穩(wěn)定的立體結(jié)構(gòu)［36］，例如 AS1411 適配體［31，37］。AS1411對(duì)腫瘤細(xì)胞具有明顯的靶向性，其靶蛋白為腫瘤細(xì)胞表面核仁蛋白。本研究參考GalNAc［38-39］技術(shù)中的4個(gè)組成要素——配體分子、連接臂、效應(yīng)RNA和保護(hù)基團(tuán)，在此基礎(chǔ)上創(chuàng)新，替換化學(xué)配體分子為更廉價(jià)的核酸適配體，并使用雜交雙鏈連接小RNA藥物，設(shè)計(jì)了由AS1411適配體（工具配體）、DNA-RNA雜交鏈（連接臂）、3,5-磷酸二酯鍵連接的RNA（小RNA藥物）和2'-F化學(xué)修飾保護(hù)4個(gè)部分組成的DNA-RNA雜交載體——AS1411-DNA-RNA-sxRNA雜交載體。

DNA-RNA雜交鏈相較于dsDNA和dsRNA，存在著明顯的特性［40］：DNA-RNA雜交鏈難以被核酸酶降解且難解鏈；DNA-RNA雜交鏈的體外構(gòu)建簡(jiǎn)單，通過(guò)鎂離子緩沖液和特定溫度梯度即可實(shí)現(xiàn)。在血液內(nèi)裸核酸易受到核酸酶的降解。常見的裸核酸保護(hù)基團(tuán)是2'-O-Me修飾、2'-O-（2-甲氧基乙基）（MOE）修飾［41-42］和2'-氟代化學(xué)修飾（2'-F修飾）［43］。本研究采用2'-氟代修飾［44］作為化學(xué)保護(hù)基團(tuán)，所以，AS1411-DNA-RNA-sxRNA雜交載體表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，在含10%血清緩沖體系72 h后仍保持穩(wěn)定。

作為一種G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA核酸適配體，AS1411適配體具備良好的抗降解能力和NCL蛋白靶向性，G-四鏈體結(jié)構(gòu)極為穩(wěn)定，離子環(huán)境依賴性低?？菇到饽芰?qiáng)，在2'-F修飾的保護(hù)下可在血清環(huán)境穩(wěn)定存在48 h，AS1411適配體的靶蛋白NCL與核糖體活動(dòng)密切相關(guān)，NCL僅在腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)。本研究選用AS1411適配體作為配體分子，對(duì)腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的NCL蛋白精準(zhǔn)結(jié)合，賦予了AS1411-DNA-RNA-sxRNA雜交載體遞送系統(tǒng)良好的腫瘤靶向性。

綜合上述技術(shù)，設(shè)計(jì)構(gòu)建了一種AS1411-DNA-RNA-sxRNA雜交載體裸核酸靶向遞送系統(tǒng)，分別攜帶的小RNA藥物為p21saRNA和TIGITsiRNA（命名為P21 saRNA和TIGIT siRNA的雜交載體）。為驗(yàn)證雜交載體是否能進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用，在其RNA短鏈的3'端添加FAM綠色熒光標(biāo)記。各組分在體外成功組裝后，與細(xì)胞共孵育，熒光正置顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀測(cè)。結(jié)果證明，攜帶熒光標(biāo)記的DNA-RNA雜交載體結(jié)合到SKOV3細(xì)胞表面，同時(shí)還有雜交載體通過(guò)胞吞進(jìn)入細(xì)胞，在細(xì)胞核附近聚集。這說(shuō)明DNA-RNA雜交載體能將小RNA藥物導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞。實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western Blot結(jié)果顯示，DNA-RNA雜交載體進(jìn)入細(xì)胞后，p21、TIGIT基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平上表達(dá)分別上調(diào)和下調(diào)。CCK-8實(shí)驗(yàn)、劃痕和Transwell結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和遷移能力下降，細(xì)胞凋亡率明顯增加。這些結(jié)果充分說(shuō)明了AS1411-DNA-RNAsxRNA雜交載體良好的藥物RNA分子攜帶能力和抗腫瘤作用。

總之，基于AS1411適配體的DNA-RNA雜交載體對(duì)腫瘤細(xì)胞具有高靶向性，能有效遞送小RNA進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞毒性遠(yuǎn)優(yōu)于傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染試劑。作為一個(gè)新的遞送策略，DNA-RNA雜交載體具有良好的研發(fā)價(jià)值。

4 結(jié)論

本研究很好地構(gòu)建了一種以AS1411核酸適配體為靶向分子并攜帶p21saRNA或TIGITsiRNA核酸藥物的DNA-RNA雜交載體，同時(shí)賦予了其靶向性和藥物功能，成功遞送目標(biāo)小RNA進(jìn)入細(xì)胞并調(diào)控靶基因的表達(dá)，為RNA遞送系統(tǒng)的研發(fā)提供了新的思路。

數(shù)據(jù)可用性聲明本篇論文的關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)（DOI：10.57760/sciencedb.06229/CSTR：31253.11.sciencedb.06229）可在科學(xué)數(shù)據(jù)銀行（Science Data Bank，ScienceDB）中訪問(wèn)并開放獲取，訪問(wèn)鏈接為https://www.scidb.cn/detail?dataSetId=b1ddcc76c22e49a7a85e52c4d40cc136。