基于核酸適配體傳感器的即時檢測（POCT）技術(shù)*

方 依 朱春燕 何 平 朱春楠 劉曉軍 鄭冬云 劉 超

（中南民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，武漢 430074）

近年來，受全球大范圍傳染性疾病爆發(fā)、醫(yī)療急救診斷需求上升、慢性病患者居家診斷需求上升等因素影響，傳統(tǒng)生化檢測實驗室面臨檢測成本高、耗時長、依賴專業(yè)操作人員等一系列難題。尤其是在醫(yī)療資源缺乏地區(qū)，傳統(tǒng)實驗室已無法滿足突發(fā)公共衛(wèi)生事件的檢測需求。因此，低成本、簡單快捷、不依賴大型儀器、檢測準(zhǔn)確度高、可現(xiàn)場采樣與分析的即時檢測（point-of-care testing，POCT）技術(shù)日益受到人們的關(guān)注。該技術(shù)的發(fā)展對于疾病的有效診斷、療效監(jiān)控和疫情的防控具有十分重要的意義［1］。在即時檢測傳感器的組成中，識別分子元件是即時檢測傳感器的關(guān)鍵組成部分，決定了傳感器的靈敏度、特異性、穩(wěn)定性和響應(yīng)時間。多肽、酶、抗體等蛋白質(zhì)分子作為識別元件［2-4］，在即時檢測中得到了有效應(yīng)用。然而，這些分子存在成本高、識別對象有限、不易于保存等眾多缺點，極大地限制了其應(yīng)用范圍。相較于抗體，核酸適配體具有易實現(xiàn)選擇性修飾、合成效率高、批間差異小、生產(chǎn)成本低等突出優(yōu)勢［5-8］。研究人員將核酸適配體與酶、納米材料等偶聯(lián)，結(jié)合核酸信號放大技術(shù)，在電化學(xué)與光學(xué)傳感平臺實現(xiàn)了多種疾病標(biāo)志物的快速檢測［9-10］。基于此，本文首先論述了核酸適配體的篩選策略及其研究新進展，其次，介紹了核酸適配體POCT傳感器的分子信號放大策略，以及常用傳感器類型與應(yīng)用，最后，探討了核酸適配體在POCT領(lǐng)域中面臨的挑戰(zhàn)，并展望了該技術(shù)的發(fā)展趨勢。

1 核酸適配體篩選

核酸適配體又稱為化學(xué)抗體［11］，是一段堿基數(shù)目小于100的單鏈DNA或RNA分子［12］。核酸適配體分子內(nèi)堿基通過氫鍵、范德華力和疏水堆積等作用力形成穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)，能夠與金屬離子［13-14］、糖類［15］、小分子［16］、氨基酸［17］、抗生素［18］、多肽［19］、蛋白質(zhì)［20］等靶標(biāo)特異性結(jié)合。作為傳感器的分子識別元件，核酸適配體具有親和力高、易于實現(xiàn)信號放大、檢測靈敏度高、特異性強等優(yōu)點［21］，成為環(huán)境檢測［22］、醫(yī)學(xué)診斷與治療［23-24］、食品分析［25］等眾多領(lǐng)域的重要分子工具，具有廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)展簡捷快速的適配體篩選方法，豐富識別靶標(biāo)分子的核酸適配體種類，將有效推動核酸適配體在POCT技術(shù)中的應(yīng)用。如圖1所示，人們主要以靶標(biāo)物質(zhì)為篩選對象，通過體外指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進化技術(shù)（SELEX），從人工合成的寡核苷酸文庫中篩選出特異性核酸適配體［26］。篩選對象可以是金屬離子［27］、小分子［28］、蛋白質(zhì)［29］、細菌［30］、病毒［31-32］、細胞［33］、組織或動物活體［34-35］?，F(xiàn)有篩選過程普遍包含多輪正向篩選與負向篩選程序。通過聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）富集與靶標(biāo)物質(zhì)結(jié)合的核酸分子，并采用高通量測序獲得適配體的堿基序列和相對豐度。由于核酸適配體親和力受生理環(huán)境等因素的影響，在檢測對象所處的生理環(huán)境中篩選到的核酸適配體具有更優(yōu)越的適用性［36］。如基于細胞、組織或活體為對象開展的核酸適配體篩選，不僅可以發(fā)現(xiàn)更多潛在靶點，且篩選到的核酸適配體在生理環(huán)境中能夠與靶標(biāo)分子有效結(jié)合［37-38］。

Fig.1 Schematic presentation of the typical procedure for aptamer selection圖1 核酸適配體常規(guī)篩選流程示意圖

近年來，為了克服SELEX篩選過程冗長、復(fù)雜等問題，研究人員開發(fā)了一系列篩選技術(shù)，如GO-SELEX［39］、Non-SELEX［40］、M-SELEX［41］和CE-SELEX［42］等用于提高SELEX篩選效率、增強適配體親和力，以及簡化篩選流程。最近，加拿大多倫多大學(xué)Shana O.Kelley院士團隊［43］結(jié)合微流控芯片，開發(fā)了一種名為“Pro-SELEX”的新型篩選方法，用于定量分離具有特定親和力的適配體。斯坦福大學(xué)Soh團隊［44］發(fā)展了一種大規(guī)模并行篩選靶向響應(yīng)分子開關(guān)核酸適配體的策略，解決了傳感器應(yīng)用過程中需要設(shè)計分子開關(guān)的難題。Stojanovic團隊［45］提出了針對小分子不同官能團進行分別優(yōu)化篩選的方案，為篩選靶向低分子質(zhì)量靶點的核酸適配體提供了新的思路。此外，人工堿基的引入，能夠有效擴展核酸適配體的結(jié)構(gòu)多樣性，提高核酸適配體親和力和抗酶切能力［46］。然而，人工堿基核酸適配體存在合成難度大、擴增效率不高、測序難等問題。針對人工堿基核酸適配體的篩選方法還有待進一步優(yōu)化［46］。近年來，在核酸適配體的篩選流程中，研究者利用計算機進行序列評估、結(jié)構(gòu)分析和分子對接等方式，有效縮短了篩選流程，提高了篩選效率［47］。

2 核酸適配體POCT信號放大策略

檢測速度快和靈敏度高是POCT傳感器的核心需求。為了有效提高核酸適配體POCT傳感器的檢測速度和靈敏度，合理選擇分子識別信號放大方法至關(guān)重要?，F(xiàn)有核酸適配體POCT分子識別信號放大策略包括：a.基于核酸擴增與自組裝；b.生物酶催化輔助；c.納米材料輔助；d.CRISPR/Cas系統(tǒng)輔助。

2.1 核酸擴增與自組裝信號放大策略

核酸擴增是一種通過增加核酸分子數(shù)量以提高檢測靈敏度的有效方法。核酸適配體傳感器中常用的核酸信號擴增技術(shù)包括：PCR［48］、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）［49］、重組酶聚合酶擴增（recombinase polymerase amplification，RPA）［50］、鏈置換擴增（strand displacement amplification，SDA）［51］和滾環(huán)擴增（rolling circle amplification，RCA）［52］。其中，PCR是一種常用的高特異性和高靈敏度酶催化變溫擴增技術(shù)。然而，該反應(yīng)需要借助熱循環(huán)儀精確控制樣品溫度，從而循環(huán)完成DNA的變性、退火和延伸步驟，在POCT中的應(yīng)用有限。LAMP、RPA、SDA與RCA為依賴酶催化的等溫擴增技術(shù)，廣泛用于核酸信號放大檢測［53］。其中，RPA技術(shù)擴增速度最快，可以在10～30 min內(nèi)完成DNA的擴增，非常適用于POCT的需求。如Du等［50］通過RPA，在側(cè)向?qū)游黾夹g(shù)中使用核酸適配體檢測紅霉素，檢測下限為3 pmol/L，檢測時間僅需15 min。然而，該方法存在需要對引物進行特殊設(shè)計，易產(chǎn)生非特異性擴增產(chǎn)物等問題。RCA具有線性擴增與指數(shù)擴增兩種形式，檢測靈敏度高，需要提供環(huán)狀模板。Zhou等［54］使用RCA對核酸適配體識別信號放大，開發(fā)了一種檢測血小板衍生生長因子B鏈（PDGF-BB）的電化學(xué)傳感器，檢測限低至10 fmol/L。

上述擴增均需要生物酶的參與，雖然擴增效率高，但同時也提高了對檢驗試劑的保存要求。除此之外，還有非酶介導(dǎo)的信號放大方法，包括Toehold 介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)（Toehold-mediated stand displacement reaction，TSDR）［55］、催化發(fā)夾自組裝（catalytic hairpin assembly，CHA）［56］和雜交鏈反應(yīng)（hybridization chain reaction，HCR）［57］。這類恒溫核酸自組裝信號放大技術(shù)，通過創(chuàng)建級聯(lián)DNA放大器實現(xiàn)信號增強，在POCT傳感器中得到了有效應(yīng)用［53，58］。如He等［59］通過對指數(shù)放大CHA技術(shù)進行優(yōu)化，有效提高了CHA檢測靈敏度與特異性。相對酶催化反應(yīng)擴增技術(shù)，自組裝技術(shù)存在反應(yīng)速率慢和背景信號高等問題，相關(guān)應(yīng)用還有待進一步改進。部分研究者將自組裝信號放大技術(shù)與酶催化核酸擴增進行了有效融合，如Chen等［60］將SDA與CHA放大技術(shù)聯(lián)合使用，能夠同時有效提高檢測速度與靈敏度。

2.2 基于生物酶輔助信號放大策略

酶催化反應(yīng)是一種簡單、快速和高效的信號放大方法，在電化學(xué)傳感平臺、熒光PCR平臺、酶聯(lián)免疫吸附平臺、比色法平臺中都得到了廣泛應(yīng)用［61］。酶的種類可分為生物酶和納米酶兩大類。生物酶類具有易獲取、催化活性高、催化反應(yīng)種類多、特異性強等特點。其中，核酶與脫氧核酶可直接與核酸適配體序列相連接，使用較為簡便，蛋白類酶中，HRP酶、核酸切割酶、蔗糖酶等催化反應(yīng)底物易產(chǎn)生光學(xué)或電化學(xué)信號，使用最為廣泛。輔助信號放大時，一般將生物酶偶聯(lián)在核酸適配體或其互補序列末端，或裝載在脂質(zhì)體［62］、水凝膠［63］、金屬框架［64］等納米材料中。核酸適配體識別靶標(biāo)后，能夠介導(dǎo)激活生物酶的催化反應(yīng)，產(chǎn)生光學(xué)或電化學(xué)檢測信號。通過多種酶促反應(yīng)的聯(lián)合應(yīng)用，可提高靶標(biāo)信號的檢測靈敏度。如Weng等［65］基于捕獲核酸適配體的識別，通過Exo-III酶輔助信號放大，并利用轉(zhuǎn)化酶進行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，開發(fā)了一種基于個人血糖儀的致病菌檢測方法。該技術(shù)在細菌病原菌檢測和細菌感染早期診斷方面具有廣闊的應(yīng)用前景。然而，生物酶的分子結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，催化效率易受環(huán)境與溫度的影響，是其在POCT中所面臨的挑戰(zhàn)。

2.3 基于納米材料輔助信號放大策略

納米材料如金屬納米顆粒［66］、石墨烯［67］、碳納米管［68］、金屬有機框架［69］等，具有優(yōu)異的光電性能、較大的比表面積、易偶聯(lián)適配體、優(yōu)秀的裝載能力和催化性能，在提高核酸適配體傳感器靈敏度方面發(fā)揮了重要作用［70-73］。研究早期，人們將納米材料作為電極增強或熒光猝滅材料，用于構(gòu)建適配體電化學(xué)或熒光傳感器［74］。如Hassani課題組［75］通過電沉積將金納米顆粒修飾在電極表面，提高了電化學(xué)傳感器的電子轉(zhuǎn)移效率，實現(xiàn)了二嗪磷的高靈敏度檢測。另外，部分納米材料具有類似生物酶的催化活性和選擇性，被稱為納米酶。納米酶具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、制備成本低、活性可調(diào)控、易與適配體分子偶聯(lián)等優(yōu)點，廣泛用于電化學(xué)和比色傳感器中［76-77］。然而，該材料也面臨底物特異性有限、催化效率較弱等局限。目前，多個研究課題組將納米材料作為標(biāo)記材料，用于輸出高分辨的電化學(xué)或光學(xué)響應(yīng)信號。多種納米材料相互協(xié)同可以有效增強輸出信號、提高檢測靈敏度。如Yan等［78］開發(fā)了基于二硫化鉬納米材料和二氧化硅納米顆粒的信號放大適配體電化學(xué)傳感器。該傳感器實現(xiàn)了前列腺抗原與肌氨酸的高靈敏度檢測，成功用于前列腺癌的精準(zhǔn)診斷。基于納米材料輔助的信號放大策略中，核酸適配體通常采用共價修飾等化學(xué)方法標(biāo)記在納米材料表面，但納米材料或修飾基團形成的位阻效應(yīng)會在一定程度上降低核酸適配體的親和力［79］。為解決該問題，研究人員開發(fā)了多種非標(biāo)記型納米材料增強信號傳感器［80］。

2.4 基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的信號放大策略

CRISPR/Cas系統(tǒng)不僅在基因編輯領(lǐng)域取得了突破性進展，也為生物傳感檢測帶來了新的發(fā)展方向［81］。早期基于CRISPR/Cas的核酸檢測系統(tǒng)能夠有效識別單拷貝單核苷酸突變，備受人們關(guān)注?；诖碎_發(fā)的傳感器具有特異性高、靈敏度高、檢測速度快、成本低等優(yōu)勢，十分適用于現(xiàn)場核酸靶標(biāo)的快速檢測［82］。核酸適配體的引入，使得CRISPR/Cas系統(tǒng)在小分子、蛋白質(zhì)等非核酸分子檢測體系內(nèi)得到了有效發(fā)展?；诤怂徇m配體的CRISPR/Cas檢測系統(tǒng)，主要通過核酸適配體識別靶標(biāo)，誘導(dǎo)激活Cas蛋白切割DNA或RNA分子信標(biāo)，實現(xiàn)信號放大，提高檢測靈敏度［83-84］。如陸藝團隊［85］基于核酸適配體與CRISPR/Cas12a系統(tǒng)開發(fā)了快速檢測ATP與Na+的POCT傳感器。目前，CRISPR/Cas信號放大系統(tǒng)存在易受樣本環(huán)境影響、脫靶效應(yīng)產(chǎn)生非特異性切割，以及復(fù)雜的序列設(shè)計等問題。今后，伴隨CRISPR/Cas系統(tǒng)特異性的不斷提高，該技術(shù)與核酸適配體的結(jié)合將在POCT領(lǐng)域內(nèi)取得更多應(yīng)用成果。

3 基于適配體的POCT傳感器

近年來，研究者們開發(fā)了多種基于適配體的POCT傳感器，成功用于病毒、細菌與疾病標(biāo)志物的快速檢測。根據(jù)檢測信號類型，這些傳感器可分為電化學(xué)傳感器和光學(xué)傳感器兩大類。

3.1 核酸適配體電化學(xué)傳感器

電化學(xué)傳感是一種利用電極與待測樣品之間的電化學(xué)反應(yīng)，通過測量電流、電位或電荷轉(zhuǎn)移等電化學(xué)信號，對待測樣本中目標(biāo)分析物實現(xiàn)定量或定性分析。電化學(xué)傳感具有檢測靈敏度高、特異性好、響應(yīng)速度快、裝置易微型化等優(yōu)點。目前，電化學(xué)傳感器在金屬離子、小分子、蛋白質(zhì)、細胞、細菌、病毒等物質(zhì)快速檢測領(lǐng)域獲得了廣泛應(yīng)用。電化學(xué)傳感器中，敏感元件與目標(biāo)分子之間的特異性識別作用是完成檢測的重要環(huán)節(jié)。常用識別元件有抗體、多肽、酶、核酸適配體等生化分子。相較于其他識別元件，核酸適配體更容易修飾在電極表面。常用修飾方法有：直接吸附法、自組裝膜法、共價修飾法、化學(xué)交聯(lián)法，以及生物素/親和素分子法等［86］。實際應(yīng)用過程中需要結(jié)合檢測靈敏度、選擇性和操作便捷性等因素，選擇合適的修飾方法。此外，現(xiàn)有研究表明，受空間位阻效應(yīng)和核酸適配體取向性的影響，直接修飾在電極表面上的核酸適配體靶向捕獲效率會有所降低［87］?；诖?，譚蔚泓課題組［88］開發(fā)了DNA四面體輔助修飾方法。該方法能有效增強適配體取向性和穩(wěn)定性，提高靶標(biāo)分子捕獲效率，實現(xiàn)了外泌體的高靈敏度檢測。

核酸適配體本身不具備明顯的電化學(xué)信號，通常需要在核酸適配體末端修飾電活性標(biāo)簽，如二茂鐵、鐵氰化物、亞甲基藍、CdS納米顆粒等。與抗體不同，研究者可基于核酸適配體構(gòu)象變化實現(xiàn)生物分子特異性識別信號的轉(zhuǎn)化［89］。根據(jù)該檢測原理，核酸適配體電化學(xué)傳感器分為“signal off”和“signal on”兩大類。為了提高檢測靈敏度與穩(wěn)定性，研究人員開發(fā)了多種比例型核酸適配體電化學(xué)傳感器。該傳感器能有效減少實驗操作與樣本環(huán)境帶來的干擾，具有出色的靈敏度和良好的重復(fù)性。如李峰團隊［90］基于DNA四面體的超支化雜交鏈反應(yīng)，構(gòu)建了雙核酸適配體識別介導(dǎo)的比率型電化學(xué)傳感器，實現(xiàn)了復(fù)雜生物樣本中腫瘤外泌體的精準(zhǔn)定量分析。

便攜式血糖儀是目前最成功的POCT電化學(xué)傳感設(shè)備之一，具有成本低、操作簡單和便攜性好等優(yōu)點。早期便攜式血糖儀只能對體液內(nèi)單一的葡萄糖進行檢測，其應(yīng)用范圍有限。2011年，陸藝等［91］基于核酸適配體與便攜式血糖儀，實現(xiàn)了對可卡因、腺苷、γ干擾素，以及鈾離子POCT。后續(xù)多個課題組通過核酸適配體識別元件捕獲靶標(biāo)，利用酶偶聯(lián)催化分解產(chǎn)生葡萄糖（圖2a），或調(diào)控納米材料釋放葡萄糖（圖2b），確立分析物濃度與產(chǎn)生葡萄糖的濃度之間的關(guān)系，對分析物進行定量分析［92-93］。

Fig.2 Aptamer-based POCT sensor with personal glucose meter readout圖2 基于核酸適配體的便攜式血糖儀POCT傳感器

近年來，基于場效應(yīng)晶體管和微流控芯片構(gòu)建的電化學(xué)連續(xù)檢測技術(shù)，成為了國內(nèi)外可穿戴傳感檢測研究前沿領(lǐng)域。該檢測技術(shù)可實時監(jiān)測人體內(nèi)疾病標(biāo)志物、代謝分子、藥物分子、神經(jīng)遞質(zhì)等物質(zhì)含量，對于藥物研發(fā)、發(fā)病機制研究、疾病精準(zhǔn)診斷和個性化治療具有重要意義［94］。核酸適配體具有優(yōu)異的靶向性，與靶標(biāo)分子結(jié)合產(chǎn)生的構(gòu)象變化是可逆的，十分適用于長時的連續(xù)監(jiān)測。2013年，美國Soh教授課題組和Plaxco教授課題組［95］將靶向阿霉素或卡那霉素的核酸適配體修飾在微流控芯片內(nèi)的金電極表面，通過監(jiān)測核酸適配體構(gòu)象變化引發(fā)的電信號變化，實現(xiàn)了動物體內(nèi)循環(huán)藥物濃度的長時監(jiān)控。然而，該傳感器需要提供復(fù)雜的層流液體用于減少大分子對核酸適配體的干擾。近年來，為提高核酸適配體在電極表面的穩(wěn)定性和改善電極的生物相容性，毛蘭群團隊［96］構(gòu)建了一種核酸適配體修飾碳纖維微電極，有效用于神經(jīng)遞質(zhì)的在體連續(xù)監(jiān)測。場效應(yīng)晶體管傳感器具有優(yōu)異的電化學(xué)性能，能夠有效提高檢測靈敏度高。研究者開發(fā)了多種核酸適配體功能化場效應(yīng)晶體管傳感器用于電化學(xué)連續(xù)檢測［97-98］。如Andrews團隊［99］構(gòu)建了一種可植入式核酸適配體場效應(yīng)晶體管傳感器，用于腦內(nèi)血清素的POCT，檢測靈敏度較普通電化學(xué)傳感器降低了3～6個數(shù)量級。目前，在該檢測研究領(lǐng)域，提高核酸適配體探針的穩(wěn)定性和抗干擾能力仍然是其所面臨的重要挑戰(zhàn)。

3.2 核酸適配體光學(xué)傳感器

光學(xué)傳感是一種非接觸式無損檢測方法，具有儀器操作簡便、易于微型化、檢測速度快和靈敏度高等特點。檢測原理主要是通過將待檢物質(zhì)與光學(xué)信號相關(guān)聯(lián)，實現(xiàn)對目標(biāo)分子的定性與定量分析。常見的光學(xué)檢測信號包括光的散射、光的反射、光的吸收和光的發(fā)射等。常用檢測方法有：比色法、熒光法、表面增強拉曼光譜法（SERS）、表面等離子共振法（SPR）和倏逝波光纖生物傳感等（圖3）。表1為常用光學(xué)檢測方法的特征及其優(yōu)缺點匯總。

Table 1 Aptamer-based optical POCT assays: characteristics,advantages,and disadvantages表1 基于核酸適配體的光學(xué)POCT檢測方法特征及優(yōu)缺點

Fig.3 Aptamer-based optical POCT assays圖3 基于核酸適配體的光學(xué)傳感POCT策略

3.2.1 比色法

比色法是一種不依賴激發(fā)光源的光學(xué)傳感方法。該方法基于靶標(biāo)與識別元件結(jié)合后，生成產(chǎn)物對光產(chǎn)生選擇性吸收，進而導(dǎo)致樣品發(fā)生顏色變化。人們通過肉眼或簡單儀器即可確定待測成分與含量。核酸適配體比色法中，通常在核酸適配體或其互補序列末端修飾顯色底物（如金屬納米顆粒、酶等）可完成信號的輸出。Liu等［105］最先報道了構(gòu)建核酸適配體-金納米比色體系用于腺苷的檢測，利用了金納米團聚引發(fā)溶液顏色變化的原理。Wu等［110］開發(fā)了基于滾環(huán)擴增的液晶比色適配體傳感器，有效提高了比色法適配體傳感器的檢測靈敏度。另外，為減少化學(xué)修飾對核酸適配體靶向性能的影響，研究者開發(fā)了多種非標(biāo)記技術(shù)。如譚蔚泓課題組［100］設(shè)計了一種簡單的外泌體表面蛋白非標(biāo)記比色分析法。研究者通過構(gòu)建核酸適配體-金納米-鹽比色體系，實現(xiàn)了外泌體表面蛋白的可視化和定量分析（圖3a）。目前，受限于樣品自身和檢測環(huán)境顏色干擾的影響，提高核酸適配體比色法傳感器的抗干擾能力和實現(xiàn)多靶標(biāo)分析是重點研究方向。

3.2.2 側(cè)向?qū)游龇?/p>

側(cè)向?qū)游黾夹g(shù)是一種簡單、快速（10～20 min）、低成本、不依賴大型儀器的檢測方法。非專業(yè)人員也可自行操作呈現(xiàn)檢測結(jié)果。相較于基于抗原-抗體作用的側(cè)向免疫層析技術(shù)，核酸適配體側(cè)向?qū)游黾夹g(shù)具有檢測成本低、不受批次影響、檢測對象廣等特點。該技術(shù)在POCT領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用場景［108］。該檢測器構(gòu)建方案可分為夾心法和競爭法兩種類型。其中競爭法對序列設(shè)計的要求較高，夾心法可實現(xiàn)多通道檢測［93］。由于檢測靈敏度低，傳統(tǒng)側(cè)向?qū)游鰴z測方法難以實現(xiàn)定量檢測。研究者通過結(jié)合核酸信號放大技術(shù)，以及采用納米熒光顆粒取代納米金屬顆粒，有效提高檢測靈敏度。人們利用便攜式檢測設(shè)備可實現(xiàn)定量檢測。如Jin等［101］使用上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒作為信號標(biāo)記，有效提高了檢測靈敏度。該傳感器后續(xù)通過手機完成信號檢測，實現(xiàn)了在一片試紙條上同時檢測3種不同物質(zhì)的目標(biāo)，從而體現(xiàn)了核酸適配體用于多物質(zhì)同時檢測的優(yōu)勢（圖3b）。目前，市面上還沒有成熟的核酸適配體側(cè)向?qū)游鰴z測產(chǎn)品。主要挑戰(zhàn)在于該檢測結(jié)果易受樣本環(huán)境影響（如核酸酶），存在檢測結(jié)果重復(fù)性差等問題。

3.2.3 熒光檢測法

光學(xué)傳感檢測器中熒光檢測法的檢測靈敏度高，可實現(xiàn)多種靶標(biāo)分子的檢測，能在微型化裝置內(nèi)完成檢測，是一種使用廣泛的POCT方法。由于核酸適配體具備易實現(xiàn)信號放大等特征，在熒光POCT傳感器中備受青睞。核酸適配體自身不產(chǎn)生熒光，需要在檢測體系中加入熒光分子。根據(jù)核酸適配體是否修飾固定，傳感器分為標(biāo)記型與非標(biāo)記型兩大類別。在標(biāo)記型熒光核酸適配體傳感器中，常見策略是在核酸適配體末端修飾熒光-猝滅基團或熒光共振能量分子對，從而組成分子信標(biāo)。該方案原理是基于核酸適配體構(gòu)象變化所導(dǎo)致的“熒光信號開啟”或“熒光信號關(guān)閉”響應(yīng)［107］。譚蔚泓課題組［111］最先提出并使用該策略，實現(xiàn)了對乳酸脫氫酶的快速檢測。該方案檢測信噪比高，但檢測靈敏度受到熒光基團分子間距大小的限制。另外，熒光基團標(biāo)記過程較為繁瑣，修飾基團可能降低核酸適配體的靶向性能。因此，研究者試圖開發(fā)更簡便的非標(biāo)記型方案。早期，人們主要是采用溴化乙錠（ethidium bromide，EB）［112］、釕配合物［113］等DNA嵌入染料作為信號分子。核酸適配體結(jié)合靶標(biāo)分子后，導(dǎo)致DNA嵌入染料信號分子熒光強度發(fā)生變化。近年來，研究者利用氧化石墨烯等納米材料猝滅熒光原理，開發(fā)出多種高靈敏度非標(biāo)記型熒光核酸適配體POCT傳感器［102］（圖3c）。另外，受熒光蛋白的啟發(fā)，研究者合成和篩選到了一系列能夠與熒光染料特異性結(jié)合并激活染料熒光的熒光適配體［114］。

3.2.4 表面增強拉曼光譜法（SERS）

表面增強拉曼技術(shù)具有檢測速度快、選擇性高、指紋譜檢測、低光漂白和寬激發(fā)等特點，近年來獲得了研究者的廣泛關(guān)注［108］。其中，基于核酸適配體的表面增強拉曼檢測原理主要有兩種。a.基于核酸適配體自身構(gòu)象變化產(chǎn)生拉曼信號，如Campbell等［115］通過該原理開發(fā)了人血紅蛋白的檢測傳感器。Negri等［116］采用該原理開發(fā)出檢測流感病毒核蛋白的傳感器。這種策略操作簡單，無需復(fù)雜化學(xué)反應(yīng)。但該策略檢測靈敏度較低，核酸適配體自身構(gòu)象易受修飾方法和環(huán)境因素的影響，不適用于復(fù)雜生物樣本中靶標(biāo)的定量分析。通過篩選獲取高親和力核酸適配體，改善基底材料可有效提高檢測靈敏度。Park等［103］篩選到了靶向病毒S蛋白的高親和力核酸適配體（Kd值小于2 nmol/L），在銀納米森林基底上檢測S蛋白的靈敏度為100 pg/L（圖3d）。b.核酸適配體修飾探針產(chǎn)生拉曼信號，常見標(biāo)記分子有亮甲酚藍、甲基青蓮、亞甲基藍等。通過標(biāo)記信號分子，能夠有效增強檢測靈敏度，減少背景信號的干擾。通過多標(biāo)記策略，可實現(xiàn)多靶標(biāo)物質(zhì)同時檢測［117］。近年來，卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等深度學(xué)習(xí)模型用于SERS指紋圖譜的分析，有效推動了SERS技術(shù)在POCT中的應(yīng)用范圍［118-120］。

3.2.5 表面等離子體共振法（SPR）

SPR傳感器是一種基于表面等離子共振效應(yīng)的光學(xué)傳感器，是一種無需標(biāo)記、靈敏度高、實時響應(yīng)、選擇性高、多路復(fù)用的新型光學(xué)檢測方法?；赟PR的適配體傳感器中，適配體通常修飾在在金層表面。當(dāng)靶標(biāo)分子結(jié)合核酸適配體后，表面等離子共振角度發(fā)生改變。通過監(jiān)測光的折射率變化，實現(xiàn)目標(biāo)物質(zhì)的定性或定量分析。傳統(tǒng)商業(yè)化SPR傳感器體積較大，不適于POCT。研究者基于光纖或微流控芯片構(gòu)建了可便攜式SPR傳感器，并且將樣品消耗減少至數(shù)微升或亞微升，實現(xiàn)了標(biāo)志物POCT［121-122］。Kim等［104］報道了一種新型的基于雙核酸適配體夾心平臺。該方案中，金納米棒修飾核酸適配體探針，有效增強了SPR檢測靈敏度，實現(xiàn)了諾如病毒衣殼蛋白的高靈敏度檢測（圖3e）。新型冠狀病毒感染（COVID-19）疫情后期，Lewis等［123］開發(fā)了能夠特異性檢測嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）表面SP1刺突蛋白的SPR適配體傳感器，不僅能夠用于病毒POCT，而且提供了核酸適配體與SP1刺突蛋白的親和力常數(shù)，對于優(yōu)化POCT產(chǎn)品具有重要意義。目前，由于SPR器件加工成本高，樣品需要前處理，重復(fù)使用性差等問題的影響，SPR適配體傳感器在POCT領(lǐng)域中的應(yīng)用還未得到有效開展。

3.2.6 倏逝波光纖生物傳感

倏逝波光纖生物傳感器（evanescent wave fiber optic biosensor）是一種基于光纖傳感技術(shù)的生物傳感器。激光在纖芯與包層間進行全內(nèi)反射式傳輸時，產(chǎn)生倏逝場激發(fā)光纖表面探針的熒光基團，從而實現(xiàn)目標(biāo)物的定性與定量分析（圖3f）。該傳感器具有檢測速度快、靈敏度高、可連續(xù)監(jiān)測、易便攜等優(yōu)點。核酸適配體分子作為生物識別元件，主要通過物理吸附、共價偶聯(lián)、生物素/親和素法修飾在光纖表面。如何提高核酸適配體穩(wěn)定性，實現(xiàn)高通量和連續(xù)性檢測是該傳感器所面臨的重要挑戰(zhàn)［109］。婁新徽團隊［124-125］開發(fā)了一種納米親和雙層（NADL）多功能傳感界面，有效提高了光纖表面核酸適配體抗干擾能力，實現(xiàn)了該類傳感器對小分子靶標(biāo)和蛋白質(zhì)靶標(biāo)的高靈敏度與特異性檢測。

4 總結(jié)與展望

綜上所述，核酸適配體作為分子識別元件，具有識別對象廣、易獲取、易實現(xiàn)信號放大、適用于多種生物傳感器的特點，在POCT中具有獨特的優(yōu)勢。然而，基于核酸適配體的POCT在技術(shù)研究領(lǐng)域與產(chǎn)品商業(yè)化方面還面臨著諸多挑戰(zhàn)。

在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，核酸適配體POCT技術(shù)面臨著核酸適配體篩選程序復(fù)雜、分子識別機制理解不完善、傳感器檢測靈敏度有限、檢測結(jié)果不穩(wěn)定等挑戰(zhàn)。針對上述問題，一方面，研究者需要加強核酸適配體識別分子機制的基礎(chǔ)研究，完善核酸適配體三級結(jié)構(gòu)解析技術(shù)，結(jié)合機器學(xué)習(xí)訓(xùn)練模型發(fā)展人工智能篩選核酸適配體新方法，另一方面，將核酸適配體與微流控芯片、穿戴式設(shè)備等新型集成化傳感器更高效地融合，將有效提高傳感器檢測靈敏度和穩(wěn)定性［79，126-127］。如將核酸適配體探針與基于微流控液滴技術(shù)開發(fā)的數(shù)字?jǐn)U增技術(shù)有效融合，實現(xiàn)單分子檢測與絕對定量分析。在可穿戴式柔性傳感器研究中，將核酸適配體與柔性電極材料有效融合、通過AI數(shù)據(jù)分析處理多種核酸適配體探針信號，為患者提供個性化疾病診斷與治療方案。

在產(chǎn)品商業(yè)化領(lǐng)域，一些檢測速度快，但操作復(fù)雜、檢測儀器不易便攜化的POCT技術(shù)無法轉(zhuǎn)化為POCT產(chǎn)品。因為POCT產(chǎn)品需要在患者身旁即可獲得臨床診斷結(jié)果，不受操作人員培訓(xùn)水平和檢驗場所限制。目前，基于核酸適配體的相關(guān)POCT產(chǎn)品主要有熒光或比色法的檢測試劑盒以及膠體金試紙條。如Aptagen公司開發(fā)的于熒光法檢測產(chǎn)品，Aptamer Group公司開發(fā)的SARS-CoV-2檢測試紙條，以及Achiko公司開發(fā)的SARS-CoV-2檢測試劑盒。但上述相關(guān)產(chǎn)品在POCT市場上還未能獲得廣泛認(rèn)可，主要原因在于：一方面，核酸適配體靶向的分子靶標(biāo)種類較少，篩選周期較長，能夠開發(fā)形成穩(wěn)定產(chǎn)品的種類較為缺乏；另一方面，核酸適配體POCT產(chǎn)業(yè)基礎(chǔ)薄弱，而抗體相關(guān)POCT產(chǎn)品研發(fā)、生產(chǎn)工藝、產(chǎn)業(yè)鏈條等條件發(fā)展成熟，產(chǎn)品更新速度快。核酸適配體POCT產(chǎn)品需要具有獨特的性能，才能夠取代抗體POCT產(chǎn)品。目前，在小分子檢測與多通道檢測領(lǐng)域，核酸適配體具備一定的競爭力，期待相關(guān)產(chǎn)品能夠獲得突破。