基于核酸適配體的細胞外囊泡分離分析方法*

朱 琳 鄭美玉 王宇林 袁麗杰 伊 雪 池彩星 王 匯 吳玲玲 楊朝勇 2，

（1）廈門醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學部，機能與臨床轉(zhuǎn)化福建省高校重點實驗室，廈門醫(yī)學院呼吸疾病研究所，廈門 361023；2）廈門大學化學化工學院，福建省化學生物學重點實驗室，譜學分析與儀器教育部重點實驗室，廈門 361005；3）上海交通大學醫(yī)學院，仁濟醫(yī)院，分子醫(yī)學研究院，上海 200127）

細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是細胞分泌于胞外的脂質(zhì)囊性小泡［1］，廣泛存在于大多數(shù)體液（如血液、尿液、唾液、淚液等）以及組織中。EVs在細胞間通訊與生物活性分子運輸中發(fā)揮重要作用，參與神經(jīng)傳導(dǎo)［2］、免疫調(diào)節(jié)［3］、細胞代謝［4］等生物學過程，并與惡性腫瘤［5］、神經(jīng)退行性疾?。?］、心血管疾?。?］等的發(fā)生和進展密切相關(guān)。根據(jù)EVs的尺寸、形成與分泌機制的差異，EVs可分為多種亞群，包括微泡、外泌體等［8］，其中，微泡直徑為100～1 000 nm，以細胞質(zhì)膜向外出芽方式形成［9］；外泌體直徑為40～160 nm，由細胞內(nèi)吞運輸途徑形成［10］。除了細胞膜表面蛋白，EVs還包含有來自親本細胞的胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，可為諸多生理病理學機制研究及疾病診療提供豐富的基因型和表型信息。此外，由于具有低免疫原性和歸巢效應(yīng)，EVs作為藥物運輸載體時，可延長藥物的半衰期，增加藥物遞送的靶向性［11-12］。因此，基于上述眾多的生物醫(yī)學價值，EVs已成為近年的研究熱點。而EVs的高效分離和分析是探究其生物學機制以及發(fā)揮其臨床應(yīng)用價值的重要前提。

核酸適配體（aptamers）是從體內(nèi)或體外篩選獲得的單鏈寡核苷酸（DNA或RNA）［13-14］，通過折疊成獨特的三級結(jié)構(gòu)，對靶標具有高特異性和親和力。與其他類型的識別配體相比，核酸適配體有諸多優(yōu)勢。首先，核酸適配體篩選方法高度靈活，通過改變篩選靶標，可獲得眾多類型的核酸適配體，如針對蛋白質(zhì)［15］、聚糖［16］、細胞［17］、外泌體［18-19］、細菌［20］、組織［21］等。其次，核酸適配體可通過固相合成進行批量化生產(chǎn)、成本低、批次間差異小，且核酸適配體穩(wěn)定性好，對運輸及儲存條件要求低。此外，核酸適配體尺寸較?。?～10 ku），在固相界面的修飾密度更高。核酸適配體可定點修飾功能基團，在高性能捕獲平臺和生物傳感器設(shè)計中具有獨特優(yōu)勢。最后，核酸適配體可編程性強?；趬A基互補配對原則，通過程序化的序列設(shè)計，結(jié)合納米技術(shù)，可實現(xiàn)靈活多樣的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與放大。核酸適配體的上述特征為EVs的分離和分析提供了眾多有效策略。

本綜述首先討論了核酸適配體的篩選方法，包括傳統(tǒng)篩選方法，以及核酸適配體篩選新方法，從提高核酸適配體的篩選效率以及獲得高性能的核酸適配體兩方面闡述該領(lǐng)域的發(fā)展。其次，總結(jié)比較了用于EVs分離的不同核酸適配體修飾界面或材料，以及不同亞型EVs的分離方法。在EVs檢測方面，根據(jù)核酸適配體的識別信號的輸出方式的不同，總結(jié)了基于核酸適配體的EVs電化學、可視化、表面增強拉曼散射（surface-enhanced Raman scatting，SERS）、熒光檢測法，并比較了直接信號放大方法以及競爭性放大方法。最后討論基于核酸適配體的EVs研究面臨的挑戰(zhàn)，并展望該領(lǐng)域未來的發(fā)展方向。

1 核酸適配體篩選方法

核酸適配體的傳統(tǒng)篩選方法為指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）。為進一步提高核酸適配體的篩選效率，研究者們發(fā)展了高效核酸適配體篩選技術(shù)，以簡化篩選步驟，提高核酸適配體甄定效率。此外，通過改變篩選條件，可以提高核酸適配體性能。目前用于細胞外囊泡分離和分析的核酸適配體的篩選主要以EVs表面蛋白質(zhì)為靶標，利用上述篩選方法，研究者們篩選出多種結(jié)合EVs表面不同蛋白質(zhì)的核酸適配體，可用于EVs的分離和分析（表1）。

Table 1 Aptamers used in EV isolation and analysis表1 用于EVs分離和分析的核酸適配體

1.1 傳統(tǒng)篩選方法

核酸適配體篩選采用SELEX，該技術(shù)于1990年由Tuerk和 Gold首次提出［13，44］。經(jīng)典的 SELEX流程包括：a.文庫構(gòu)建，化學合成庫容量為1010～1016量級的隨機寡核苷酸（DNA或RNA）文庫；b.篩選富集，將靶標與文庫共孵育，選擇性分離、富集與靶標結(jié)合的寡核苷酸序列；c.擴增，通過PCR擴增與靶標結(jié)合的寡核苷酸序列，生成次級文庫，用于下一輪富集；d.重復(fù)上述富集與擴增步驟，結(jié)合正篩選以及負篩選，通過多輪篩選獲得與靶標高親和力的寡核苷酸文庫；e.甄定與表征，對最終富集的文庫測序，甄定可與靶標高親和力、高特異性結(jié)合的寡核苷酸序列，即核酸適配體序列。

傳統(tǒng)SELEX往往需要10～20輪的富集才能獲得候選核酸適配體序列，步驟繁瑣，耗時長，效率低。此外，PCR擴增具有序列偏好性，尤其是當靶標序列在文庫中豐度較低時，擴增偏差可能會掩蓋高親和力的靶標序列，降低篩選的成功率。最后，傳統(tǒng)SELEX文庫結(jié)構(gòu)單一、并且在緩沖液中進行，獲得的核酸適配體對工作環(huán)境（如溶液中Mg2+濃度等）要求較高，適用性差，限制了核酸適配體的廣泛應(yīng)用。因此，簡化篩選步驟、優(yōu)化篩選方法，獲取結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、親和力高、適用性好的核酸適配體，是核酸適配體篩選的重要發(fā)展方向。

1.2 核酸適配體篩選新方法

針對傳統(tǒng)SELEX存在的不足，研究者們發(fā)展了多種核酸適配體篩選新方法，提高核酸適配體的篩選效率及性能。一方面，高效的核酸適配體篩選技術(shù)，如自動化篩選平臺、高效核酸適配體甄定技術(shù)以及生物信息學技術(shù)被提出，以簡化篩選步驟，規(guī)避擴增偏差，提高核酸適配體甄定效率。另一方面，通過改變篩選環(huán)境，以及提高文庫多樣性，提高核酸適配體性能。

1.2.1 高效核酸適配體篩選技術(shù)

傳統(tǒng)的SELEX技術(shù)操作繁瑣、耗時長，限制了高性能核酸適配體的快速、大規(guī)模篩選。另外，核酸序列擴增偏差可能會導(dǎo)致錯失最佳核酸適配體序列。因此，發(fā)展SELEX的集成化方法，簡化篩選步驟，降低核酸序列擴增偏差，是當前SELEX技術(shù)發(fā)展熱點之一。例如，Mendonsa等［45］和Takao等［46］基于游離寡核苷酸和靶標-寡核苷酸復(fù)合物的電荷/質(zhì)量比的差異，提出毛細管電泳SELEX法。將靶標與寡核苷酸文庫孵育，由于電荷/質(zhì)量比的差異，毛細管電泳可產(chǎn)出不同的電泳遷移率，自動化分離游離的寡核苷酸和靶標-寡核苷酸復(fù)合物，無需靶標分子的固定，無需手動清除游離的寡核苷酸序列，簡化了篩選步驟。另外，由于靶標免固定，靶標與寡核苷酸接觸效率更高，非特異性吸附更少［47-48］。然而，靶標-寡核苷酸復(fù)合物在高電壓下易解離，影響篩選結(jié)果。Lou等［49］發(fā)展了一種基于磁分離的微流控SELEX方法，利用微流控芯片中的磁場梯度，自動地將游離的寡核苷酸與結(jié)合在靶標修飾磁珠上的寡核苷酸分離。Hong等［50］報道了一種高度集成化的鎳陣微流控芯片，利用連續(xù)流提高核酸適配體的篩選效率，同時減少與靶標非特異或弱結(jié)合的寡核苷酸。該平臺集成了正篩選、負篩選以及分選過程，并采用熒光原位實時監(jiān)測篩選過程，增強了篩選的可控性（圖1a）。該平臺的高度集成化縮短了篩選時間，降低了試劑消耗量，同時篩選效率提高了約10倍。在此基礎(chǔ)上，Hong等［51］發(fā)展了可同時篩選兩種核酸適配體的微流控篩選平臺。上述篩選平臺的簡化了篩選流程，節(jié)約了篩選成本，大大提高了核酸適配體的篩選效率。Chang等［52］采用高性能微流控分選技術(shù)，發(fā)展了篩選可編程結(jié)合親和力核酸適配體的篩選技術(shù)Pro-SELEX。將單鏈寡核苷酸庫展示在微珠上，產(chǎn)生微珠文庫，并與磁性納米顆粒結(jié)合，根據(jù)磁性含量將核酸適配體顆粒分選到微流控芯片的不同隔間中，不但簡化了篩選步驟，還可篩選獲得具有特定親和力的核酸適配體。

Fig.1 Efficient selection platforms for aptamers圖1 核酸適配體高效篩選平臺

富集文庫中核酸適配體的甄定對于提高篩選效率至關(guān)重要。傳統(tǒng)SELEX通過多輪篩選將文庫縮小到相對少量的序列，再通過Sanger測序選出高頻重復(fù)的序列作為核酸適配體候選序列，化學合成后實驗驗證候選核酸適配體的結(jié)合性能。PCR擴增中的序列偏好容易丟失結(jié)合性能較高、但擴增效率較低的序列，造成篩選失敗。為解決這一問題，Zhang等［53］發(fā)展了單分子擴增方法，通過液滴微流控將核酸序列物理分割，創(chuàng)造無競爭的反應(yīng)條件，實現(xiàn)單分子的擴增，消除整體擴增的偏好性。在此基礎(chǔ)上，Zhang等［54］發(fā)展了基于瓊脂糖液滴核酸適配體篩選技術(shù)（圖1b）。利用液滴微流控技術(shù)將富集文庫序列以單分子形式分隔至大量瓊脂糖液滴，序列在瓊脂糖液滴中進行單分子擴增，獲得每個文庫分子的單克隆產(chǎn)物。隨后利用瓊脂糖液滴的“液-固”相態(tài)轉(zhuǎn)換，獲得包含有單克隆序列的瓊脂糖微球。通過表征每個微球中序列的結(jié)合性能，獲得目標核酸適配體序列。該方法簡化了核酸適配體甄定步驟，并且克服了整體擴增的偏差。隨后，為了簡化液滴生成操作，克服液滴生成過程對儀器的依賴，Li等［55］開發(fā)了按壓式陣列微流控芯片。以手動按壓的方式，將加熱的液態(tài)瓊脂糖分布于聚二甲基硅氧烷陣列芯片中，利用加熱的硅油生成瓊脂糖液滴，該過程不依賴大型儀器，液滴生成過程簡單。然而，逐一表征大量的單克隆微球的過程較為繁瑣、耗時。為進一步提高核酸適配體甄定效率，Zhu等［56］發(fā)展了單克隆表面展示核酸適配體篩選新方法。將擴增引物偶聯(lián)于微球，利用液滴產(chǎn)生單分子反應(yīng)體系，經(jīng)單分子擴增將單分子序列復(fù)制至微球表面，獲得單克隆微球文庫。通過單克隆微球文庫與靶標結(jié)合可視化地表征單克隆微球中序列與細胞的結(jié)合性能。該方法通過單分子液滴擴增不但克服了整體擴增的偏好，還避免了對富集文庫進行克隆測序及結(jié)合力表征步驟，因此更加經(jīng)濟、高效。傳統(tǒng)SELEX甄定核酸適配體依賴大型儀器，限制了其應(yīng)用范圍。Song等［57］開發(fā)了一種快速、便攜的核酸適配體表征微流控平臺Afi-Chip（圖1c）。將候選核酸適配體進行生物素化標記，與靶標孵育后，再與鏈霉親和素標記的過氧化氫酶結(jié)合，置于Afi-Chip中?；诿复呋疕2O2分解產(chǎn)生的氣體推動墨條移動，從而產(chǎn)生距離讀數(shù)，以監(jiān)測核酸適配體的進化，表征核酸適配體的親和力。該方法無需復(fù)雜設(shè)備、快速、成本低，通用性強。

傳統(tǒng)SELEX對最后一輪富集文庫中的少量克隆進行Sanger測序，選出高頻重復(fù)的序列為候補核酸適配體序列，但該策略只能檢測到高拷貝的序列，可能錯失擴增效率低、結(jié)合性能好的序列。高通量測序（high-throughput sequencing，HTS）可分析每輪富集庫中的數(shù)百萬個序列，并提供序列在篩選進化過程中動態(tài)變化信息，能夠克服拷貝數(shù)依賴性，有助于發(fā)現(xiàn)高性能核酸適配體［59-60］。此外，生物信息學為從HTS數(shù)據(jù)庫中高效甄定性能優(yōu)越的核酸適配體提供了有力工具［61-62］。Soh等［63］將微流控篩選技術(shù)與HTS結(jié)合，僅通過3輪篩選及文庫進化分析，即從千萬級序列中甄定出高親和力的核酸適配體。此外，通過比較不同富集輪次的序列發(fā)現(xiàn)，序列的親和力與拷貝數(shù)無關(guān)。因此，常規(guī)序列分析法僅考慮拷貝數(shù)，可能無法獲得性能最佳的核酸適配體［64］。除了富集軌跡，家族大小以及二級結(jié)構(gòu)也是HTS數(shù)據(jù)庫中用于核酸適配體甄定的重要序列信息。聚類分析算法基于序列共性學習［65］以及迭代比較［66］將序列聚類，將大家族中的序列作為候選序列。然而，聚類分析忽略了核酸適配體的二級結(jié)構(gòu)，而二級結(jié)構(gòu)決定了核酸適配體與靶標的結(jié)合性能。為此，研究者們開發(fā)多種結(jié)構(gòu)基序分析方法，用于鑒定序列的二級結(jié)構(gòu)［67］。例如，Song等［68］發(fā)展了序列多維分析算法SMARTAptamer（圖1d）。結(jié)合多級結(jié)構(gòu)分析以及無監(jiān)督機器學習，綜合分析基序富集、家族大小、二級結(jié)構(gòu)，成功篩選出高效結(jié)合上皮細胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）的核酸適配體、波形蛋白的核酸適配體［58］，以及嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型（SARS-CoV-2）受體結(jié)合域的核酸適配體［68］。Li等［69］發(fā)展了“In Silico”篩選策略。通過結(jié)構(gòu)預(yù)測模型構(gòu)建單鏈DNA的3D結(jié)構(gòu)，通Autodock Vina交叉驗證、分子動態(tài)（molecular dynamic，MD）模擬以及分子力學模擬預(yù)測聚糖-核酸適配體復(fù)合物的結(jié)合模式和能量，篩選獲得對巴龍霉素具有較高親和力的核酸適配體。隨著測序成本的降低及生物信息學的快速發(fā)展，高通量測序?qū)⑼苿雍怂徇m配體的高效發(fā)現(xiàn)以及其生物醫(yī)學中的應(yīng)用。

1.2.2 高性能核酸適配體篩選

隨著核酸適配體高效篩選平臺的開發(fā)，大量核酸適配體被發(fā)現(xiàn)。然而，僅有少數(shù)核酸適配體具有較好的性能，限制了臨床中的應(yīng)用。因此，研究者們致力于優(yōu)化SELEX技術(shù)以獲得高性能的核酸適配體。吉布斯自由能（ΔG）可用于評估核酸適配體的親和力，其由熵分量以及焓分量組成。與熵驅(qū)動的配體相比，焓驅(qū)動的配體與靶標之間可產(chǎn)生豐富的結(jié)合鍵，如氫鍵、離子鍵，從而提高配體的結(jié)合親和力。Huang等［70］提出了一種分子擁擠SELEX策略，以血漿作為分子擁擠的篩選基質(zhì)，降低靶蛋白和核酸適配體的自由度，抑制熵的貢獻，以篩選焓驅(qū)動核酸適配體（圖2a）。與緩沖液體系SELEX相比，分子擁擠SELEX進化的EpCAM核酸適配體的親和力提高了6.5倍；篩選獲得的針對SARS-CoV-2受體結(jié)合域（RBD）野生型及突變型核酸適配體的平衡解離常數(shù)分別降低了約41%和61%，對SARS-CoV-2假病毒的檢測限低了約79%［71］。

Fig.2 Approaches for selecting aptamers with high properties圖2 高性能核酸適配體篩選方法

核酸適配體的結(jié)合功能依賴于其折疊的三級結(jié)構(gòu)，即結(jié)構(gòu)決定功能。因此，文庫結(jié)構(gòu)多樣性能夠提高篩選的成功率及核酸適配體的性能?？贵w由20多種氨基酸作為基本單元組成，且氨基酸側(cè)鏈具有疏水、親水或帶電荷等不同特征，可利用多種相互作用與其靶標結(jié)合。相比而言，核酸適配體僅由4種核苷酸組成，其結(jié)構(gòu)多樣性和化學多樣性都十分有限，對高效篩選高性能的核酸適配體是不利的［72］?；瘜W修飾法是提高文庫多樣性的直接方法，使用化學修飾的非天然堿基從頭進化，可獲得化學修飾的核酸適配體［73］。例如，在嘧啶的C5和嘌呤的C8位置化學修飾蛋白樣側(cè)鏈或疏水基團，提高核酸適配體的親和力［74］。該修飾還具有核酸酶耐受性，可增加核酸適配體在血清中的穩(wěn)定性［75］。此外，核糖2'位置的修飾，如甲氧基取代會增加寡核苷酸和氨基酸殘基之間的空間位租，從而減少核酸酶和核酸適配體之間的親和力，增加核酸適配體的核酸酶耐受性，提高在臨床樣本中的穩(wěn)定性［76］。然而，大多數(shù)化學修飾的核苷酸不能被傳統(tǒng)的DNA聚合酶有效識別，限制了候選核酸適配體的擴增和測序。此外，需要大量的試驗才能在核酸適配體序列中確定合適的修飾位置與基團［77］。

除了通過化學修飾獲得非天然的堿基，還可通過設(shè)計非線性的核酸文庫、加入結(jié)構(gòu)調(diào)控分子等提高文庫的多樣性。例如，Liu等［78］以環(huán)狀DNA文庫進行進化，獲得對谷氨酸脫氫酶不同表位具有高親和力的環(huán)狀核酸適配體。與線性DNA核酸適配體相比，環(huán)狀DNA核酸適配體抵抗核酸酶降解，生物穩(wěn)定性更高，在生物樣本中有更高的應(yīng)用潛力［79］。此外，環(huán)狀結(jié)構(gòu)易被用于設(shè)計滾環(huán)擴增（rolling circle amplification，RCA），用于組裝生物傳感器。Zhou等［80］采用結(jié)合抑制有機反應(yīng)（BINOR）SELEX，發(fā)展了區(qū)域選擇性核酸適配體篩選方法。使用羧基功能化磁珠結(jié)合高半胱氨酸表面的氨基，去除識別半胱氨酸氨基的序列，通過多輪篩選可獲得只與高半胱氨酸的烷烴硫醇鏈側(cè)鏈結(jié)合而不與氨基結(jié)合的核酸適配體序列。Huang等［81］提出“卡夾核酸適配體（clipped aptamers）”概念，在篩選文庫中加入DNA錯配結(jié)合小分子Z-NCTS，Z-NCTS與核酸序列中預(yù)設(shè)的CGG/CGG序列之間產(chǎn)生“別針”樣特異性相互作用，調(diào)節(jié)其結(jié)合親和力（圖2b）。因此，篩選獲得EpCAM核酸適配體，能夠被Z-NCTS調(diào)控從非活性狀態(tài)到活性狀態(tài)的有效轉(zhuǎn)變，調(diào)節(jié)細胞的黏附能力。該核酸適配體的結(jié)構(gòu)多樣性使其在生物傳感、細胞行為調(diào)節(jié)和藥物遞送方面具有巨大的潛力。

傳統(tǒng)的SELEX技術(shù)獲得的核酸適配體通常是單價的。與多價相互作用相比，單價作用因明顯的“協(xié)同缺陷”，結(jié)合親和力較低［83］。通過支架將單價核酸適配體組裝為多價核酸適配體的策略是目前常用的多價策略，但需要精確控制核酸適配體之間的距離和取向，并預(yù)先獲得匹配靶標的核酸適配體對［84］。對于沒有匹配的核酸適配體對的靶分子，體外篩選策略能快速獲得多價核酸適配體。例如，Tang等［82］受抗體和抗原之間自然進化的多價相互作用啟發(fā)，使用預(yù)先組裝的DNA框架庫，實現(xiàn)EpCAM的“抗體樣多價核酸適配體”（Amap）從頭進化（圖2c）。通過從頭定向進化避免了核酸適配體對的試錯，通過DNA框架介導(dǎo)的Apt 1和Apt 2的多價性有效地提高核酸適配體的結(jié)合性能，此外，篩選獲得的核酸適配體具有剛性的DNA-三角形框架，具有更好的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和剛性，為快速獲得高親和力的多價核酸適配體提供了有效策略。

2 基于核酸適配體的EVs分離方法

EVs的分離富集方法通常利用EVs與體液中其他組分的物理性質(zhì)差異，如差速離心法、尺寸排阻色譜、聚合物沉淀法等，但存在回收率低、純度低、步驟繁瑣、耗時長等問題。核酸適配體修飾于不同的材料或界面，基于核酸適配體與EVs表面標志物的特異、高效識別作用的親和分離法，可有效提高EVs分離的效率及純度（表2）。

Table 2 Summary of EV isolation methods表2 EVs分離方法總結(jié)

目前，研究者們已將核酸適配體修飾于不同的材料或界面，用于EVs的捕獲，如磁珠［27］、碳布［25］、石墨烯［85］、Ti2CTxMXene膜［86］等。然而，單價的核酸適配體容易被降解，造成局部核酸適配體濃度降低，降低捕獲效率。Xue等［87］利用滾環(huán)擴增在微珠表面制備長單鏈DNA多價核酸適配體，通過多價效應(yīng)提高了核酸適配體的親和力，從而有效提高了EVs的捕獲效率。

EVs捕獲通常發(fā)生于固-液界面，而溶液中的EVs與傳統(tǒng)親和界面上的核酸適配體之間的接觸機會有限，導(dǎo)致EVs低捕獲效率。為解決上述問題，Niu等［32］設(shè)計了一種流動納米多孔微界面（FluidporeFace）微流控芯片，實現(xiàn)腫瘤來源EVs的高效捕獲與靈敏檢測。在微流控芯片基底構(gòu)筑納米多孔魚骨型微陣列，并在其表面包裹一層修飾磷脂雙分子層和修飾EpCAM核酸適配體。該芯片中，魚骨型結(jié)構(gòu)有效促進EVs向界面的傳質(zhì)，多孔結(jié)構(gòu)克服界面的流體的黏滯阻力，提高EVs和界面之間的緊密接觸，流動磷脂雙分子層膜界面可使識別分子聚集，產(chǎn)生流動多價效應(yīng)，與非流體界面相比，親和力提高了83倍。該芯片對腫瘤來源EVs的檢測限低至10顆粒/μl。為了便于下游分析，Niu等［33］進一步發(fā)展了一種可控去組裝的流動多價磁性界面（FluidmagFace）芯片（圖3a）。首先，在磁珠表面形成脂質(zhì)雙分子層，通過疏水作用修飾EpCAM核酸適配體形成流動界面磁珠（FluidFaceMBs）。隨后，在外加磁場作用下，F(xiàn)luidFaceMBs被磁吸引于魚骨形芯片基底，形成FluidmagFace。與非流動界面相比，F(xiàn)luidmagFace的親和力提高105倍，分離EVs的效率提高了13.9%?；诖趴厝ソM裝，該方法可簡便、高效地釋放被捕獲的EVs，用于EVs蛋白質(zhì)組學分析。

Fig.3 Aptamer-based isolation methods for EVs圖3 基于核酸適配體的EVs分離方法

核酸適配體捕獲EVs時易受體液中游離蛋白質(zhì)的干擾，降低捕獲EVs的純度及檢測準確性。為克服這一問題，Zhang等［29］通過脂質(zhì)探針和細胞程序性死亡配體1（programmed cell death ligand 1，PD-L1）核酸適配體作為輸入，進行DNA邏輯計算，實現(xiàn)了PD-L1+EVs的特異性捕獲（圖3b）。通過設(shè)計能嵌入EVs膜的膽固醇DNA探針和PD-L1核酸適配體探針，只有當膽固醇DNA和PD-L1核酸適配體探針同時存在時，才能誘導(dǎo)生物素標記的連接器激活的DNA計算，而游離PD-L1蛋白無法激活連接器。該方法可特異性分離PD-L1+EVs，排除游離PD-L1蛋白的干擾。該方法對癌癥患者的檢測靈敏度和特異性達100%。EVs具有高度異質(zhì)性，不同表型的EVs代表不同的來源及生物學功能，而上述方法均無法分離不同表型的EVs。Lu等［28］開發(fā)了一個模塊化平臺，用于分離腫瘤和非腫瘤來源PD-L1+EVs（圖3c）。腫瘤來源的EVs可與EpCAM和PD-L1核酸適配體識別并誘導(dǎo)“AND”邏輯運算，而非腫瘤來源的PD-L1+EVs僅表達PD-L1，可誘導(dǎo)“NOT”邏輯運算。上述兩個獨立的輸出可以通過串聯(lián)微流控分別實現(xiàn)腫瘤和非腫瘤來源的PD-L1+EVs分離。該方法可用于區(qū)分癌癥患者和健康人，還可以釋放EVs用于下游分析?？傊珽Vs的高效分離是其生物學功能研究和臨床應(yīng)用的前提，仍需發(fā)展高效、高純度的EVs亞型分離新方法。

3 基于核酸適配體的EVs檢測方法

EVs的定性和定量分析對發(fā)展疾病診斷新方法至關(guān)重要。核酸適配體由于具有DNA可擴增，可程序化設(shè)計等優(yōu)勢，易于構(gòu)建生物傳感器用于EVs的分析。研究者們發(fā)展了一系列基于核酸適配體的EVs分析方法，根據(jù)信號輸出方式的不同，可分為電化學、可視化、表面增強拉曼光譜、熒光法等（表3）。此外，為提高EVs檢測靈敏度，研究者們也發(fā)展了多種基于核酸適配體的信號放大方法。

Table 3 Summary of EV analysis methods表3 EVs分析方法總結(jié)

3.1 電化學檢測

基于核酸適配體的電化學檢測方法，是將核酸適配體與EVs的結(jié)合轉(zhuǎn)變成電信號。通過對電信號的檢測，實現(xiàn)EVs的快速、靈敏和選擇性檢測［114-115］。核酸適配體作為生物識別元件通常被修飾于電極表面，其修飾方法會影響核酸適配體對EVs的識別和結(jié)合效率［114］。目前，研究者們已開發(fā)多種核酸適配體修飾電極的方法以提高檢測靈敏度。

核酸適配體可以直接修飾于電極表面。例如，硫代核酸適配體可以通過Au-S鍵有效地固定在金電極表面，當捕獲EVs時，引起電活性標簽或探針的電化學性質(zhì)改變從而輸出電信號［116］。固定在電極表面的核酸適配體之間需有一定的間距，保證核酸適配體識別靶標并折疊后進行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)?？梢岳脦€基己醇取代金電極上非特異性吸附的核酸適配體，以提高核酸適配體的方向性，并降低核酸適配體的非特異吸附［117-118］。Zhou等［24］通過這種方法，將CD63核酸適配體固定在金電極表面，并將其集成到微流控平臺中。該平臺對外泌體的檢出限低至1×103顆粒/μl。Pei等［119］研究表明，多聚腺嘌呤可輔助核酸適配體在金電極表面的固定，多聚腺嘌呤不僅能與Au納米顆粒表面結(jié)合，還能有效阻斷非特異性DNA-Au結(jié)合，進而精確控制金電極表面核酸適配體的定位和密度。

此外，在金電極表面修飾石墨烯基材料也是降低非特異性吸附的常用方法。Szunerits課題組［34，120］用聚乙烯亞胺/還原氧化石墨烯薄膜修飾金電極，將炔基修飾到聚乙烯亞胺/還原氧化石墨烯薄膜，通過銅催化Click反應(yīng)將疊氮化核酸適配體固定在電極表面，進而用于EVs分析［34，120］。基于核酸適配體的外泌體電化學傳感器大部分使用單信號輸出，易受環(huán)境干擾。Sun等［89］開發(fā)了一種新型的雙信號和內(nèi)在自校準外泌體核酸適配體傳感器，將黑磷納米片（BPNSs）和二茂鐵（Fc）摻雜的金屬有機框架（ZIF-67）組裝于氧化銦錫（ITO）薄片上，接著在ITO薄片上修飾亞甲基藍（MB）標記的單鏈DNA適配體，構(gòu)建成核酸適配體-BPNSs/Fc/ZIF-67/ITO傳感器（圖4a）。該傳感器具有MB（標記在核酸適配體上）和Fc（摻雜至ZIF-67中）的雙重氧化還原信號反應(yīng)，在檢測乳腺癌細胞MCF-7分泌的外泌體時，MB的氧化還原電流有規(guī)律地降低，而Fc（作為參照）的氧化還原電流幾乎不變，以氧化還原峰值電流強度的雙信號比（IFc/IMB）作為信號輸出，實現(xiàn)了內(nèi)在自校準，使檢測限低至0.1顆粒/μl，展現(xiàn)出了良好的選擇性和高靈敏度。固定在電極上的核酸適配體通常是無序且纏繞的，一定程度上影響了核酸適配體和EVs的結(jié)合。為了克服這一挑戰(zhàn)，Wang等［88］采用DNA四面體為支架錨定核酸適配體，提高了核酸適配體在界面組裝的方向性，提高了對外泌體的識別及捕獲效率（圖4b）。與傳統(tǒng)的核酸適配體傳感器相比，該方法對肝癌細胞外泌體的檢測靈敏度提高了100倍。

Fig.4 Aptamer-based electrochemical detection of EVs圖4 基于核酸適配體的EVs電化學檢測

直接將核酸適配體固定在電極表面用于識別EVs，并產(chǎn)生電化學信號的方法耗時、昂貴、可控性差，易受非特異性吸附的干擾，并且核酸適配體與外泌體的識別受限于溶液-電極界面反應(yīng)效率［114］。針對此問題，研究者們發(fā)展了“捕獲探針-外泌體-核酸適配體”的夾心法，大大提高了檢測靈敏度。例如，F(xiàn)eng等［90］通過水熱法合成了三維立方體（AuPt DNs）/Ti3C2，并修飾CD63適配體，可用于外泌體捕獲。同時將CD63修飾的氧化石墨烯固定在絲網(wǎng)印刷碳電極上，被捕獲的外泌體與氧化石墨烯上CD63適配體識別，可引起絲網(wǎng)印刷碳電極上電化學信號的改變，以檢測結(jié)直腸癌外泌體（圖4c）。在最佳條件下，該平臺的檢測線性范圍為100～5×105顆粒/μl。除了“捕獲探針-外泌體-核酸適配體”的夾心法外，研究者們還開發(fā)了免固定的均相電化學傳感器。在均相電化學傳感器中，無需信號探針標記，靶標識別和信號放大過程都在均相溶液中進行，極大地提高了靈敏度。例如，Yin等［91］開發(fā)了一種基于蒽環(huán)類阿霉素信號報告和核酸外切酶III（Exo III）輔助擴增的免固定均相電化學傳感平臺。該傳感器包括核酸適配體探針P1、觸發(fā)DNA探針P2和發(fā)卡DNA探針Hp。當P1與外泌體蛋白CD63結(jié)合，釋放出一個P2探針，隨后，P2與另一個富含GC的Hp探針雜交，并觸發(fā)Exo III切割，最終使溶液中的Hp探針數(shù)量減少。阿霉素可以與雙鏈GC序列結(jié)合，產(chǎn)生電流信號。此方法檢出限低至12顆粒/μl?？傊?，由于高靈敏度和簡便性，基于核酸適配體的EVs電化學傳感器有望成為臨床標志物的有效分析工具，但仍需更多的研究以提升電化學方法的檢測性能，拓展應(yīng)用范圍。

3.2 可視化檢測

可視化檢測方法利用肉眼可辨識的信號及信號變化檢測待測物，具有快速、操作簡單、儀器便攜等優(yōu)勢，有較大的現(xiàn)場應(yīng)用潛力。比色法通常使用不同的酶，包括天然酶、納米酶等催化顯色底物，如2,2'-氮唑［3-乙基苯并噻唑-6-磺酸］-二銨鹽（ABTS）和3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）等，使其產(chǎn)生顏色變化信號，用于靶標的可視化檢測。天然酶具有較高的催化活性和底物特異性，然而一些固有的缺點，如分離提純難、穩(wěn)定性差、昂貴，限制了其適用性。納米酶具有成本低、可批量制備、穩(wěn)定性高等優(yōu)點，在生物醫(yī)學領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景［121］。自從具有酶活性的Fe3O4納米顆粒被發(fā)現(xiàn)以來［122］，零維納米酶被廣泛用于模擬過氧化物酶在靶標可視化檢測中的應(yīng)用。

Chen等［23］構(gòu)建了基于Fe3O4納米顆粒的核酸適配體傳感器，用于可視化檢測前列腺癌患者血漿中的外泌體。EpCAM核酸適配體非特異吸附在Fe3O4納米顆粒上，提高Fe3O4納米顆粒的催化活性，在反應(yīng)體系中催化TMB生成藍色的氧化產(chǎn)物。當外泌體存在時，核酸適配體與外泌體上EpCAM結(jié)合，脫離Fe3O4納米顆粒，導(dǎo)致Fe3O4納米顆粒的酶催化活性降低。因此，外泌體的含量與TMB顏色變化程度呈負相關(guān)。盡管零維納米酶的結(jié)構(gòu)設(shè)計取得了較大進展，但納米顆粒易聚集并且具有有限的表面積和可及性，不利于充分發(fā)揮納米酶的催化功能［123］。與零維納米酶相比，二維納米材料，如納米片、納米帶、納米板和納米壁等呈片狀結(jié)構(gòu)，具有較大的比表面積和較高的酶活性［124］，被用于構(gòu)建高效比色傳感平臺。例如，Xia等［92］將單層石墨烯卷曲成單壁碳納米管（s-SWCNTs），構(gòu)建比色傳感平臺。此外，Wang等［93］以石墨氮化碳納米片（g-C3N4NSs）作為二維納米酶，用于EVs的檢測（圖5a）。將核酸適配體吸附在g-C3N4NSs上，核酸適配體與外泌體識別后從g-C3N4NSs上脫離，降低其酶催化活性，極大地提高了外泌體檢測的靈敏度，實現(xiàn)外泌體的可視化檢測。盡管二維納米材料與零維納米材料相比，酶催化能力有所提高，但檢測靈敏度仍不能滿足臨床診斷需求。因此，信號放大方法，如末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）［94］、雜交鏈式反應(yīng)（HCR）［95］、滾圈擴增（RCA）［96］、鏈位移擴增（SDA）［97］、球形核酸（SNAs）［97］等被用于提高EVs比色檢測的靈敏度。

Fig.5 Aptamer-based visual detection of EVs圖5 基于核酸適配體的EVs可視化檢測

基于核酸適配體的外泌體可視化檢測并未局限于酶催化底物顯色的原理。例如，Jiang等［125］構(gòu)建了僅依賴Au納米顆粒和一組核酸適配體的外泌體可視化檢測傳感器（圖5b）。該傳感器的工作原理簡單：核酸適配體與Au納米顆粒的絡(luò)合作用可防止Au納米顆粒在高鹽溶液中聚集；而核酸適配體與外泌體結(jié)合后，會從Au納米顆粒脫離，導(dǎo)致Au納米顆粒聚集從而產(chǎn)生顏色變化。Hu等［98］發(fā)展了氣壓輔助的原子火焰測定法（圖5c）。在該體系中，EpCAM核酸適配體-外泌體-Pt納米顆粒復(fù)合物產(chǎn)生酶催化反應(yīng)，催化H2O2產(chǎn)生O2，O2通過密閉的裝置進入裝有Cu2＋溶液的容器中，產(chǎn)生的壓力將一定量的Cu2＋溶液排出裝置外，不同含量Cu2＋溶液可產(chǎn)生不同顏色的原子火焰，進而對外泌體進行定量檢測。Ding等［99］在便攜式微孔板上構(gòu)建抗體-核酸適配體夾心免疫結(jié)構(gòu)，特異性識別EVs。設(shè)計的核酸適配體引物與多功能環(huán)狀DNA模板（CDT）序列匹配，在EVs表面觸發(fā)原位切割介導(dǎo)的指數(shù)滾動圓擴增（CM-ERCA），產(chǎn)生大量血紅素/G-四聯(lián)體，催化TMB的氧化，氧化的TMB具有良好的光熱效應(yīng)，產(chǎn)生熱量輸出信號，僅通過家用溫度計的讀數(shù)即可實現(xiàn)EVs的定量檢測。Yu等［100］基于外泌體膜上CD63蛋白的核酸適配體，成功開發(fā)了以Au納米顆粒為可視化探針的低成本側(cè)流核酸適配體測定（LFAA）試紙條。CD63核酸適配體-Au納米顆粒復(fù)合物與修飾于試紙條上的DNA互補配對，試紙條T線顯色。外泌體與CD63核酸適配體-Au納米顆粒復(fù)合物識別，該復(fù)合物從試紙條上脫離，T線顏色減弱，以此可視化檢測外泌體。此外，Yang等［126］提出了單個EVs表面分子模式識別策略，結(jié)合單個EVs上雙靶標蛋白協(xié)同識別和邏輯計算，以及酶比色信號放大，實現(xiàn)腫瘤EVs的可視化檢測（圖5d）。設(shè)計靶蛋白結(jié)合配體Apt-S1-R1，該配體包含3個結(jié)構(gòu)域：特異性識別EVs表面靶蛋白的核酸適配體域、間隔域（S1）以及報告激活域（R1）。使用兩種Apt-S1-R1分別識別EVs表面不同的蛋白質(zhì)后，加入DNA輔助鏈（S2）和報告探針（R2，生物素修飾）觸發(fā)“AND”邏輯運算，連接上報告探針（R2），再通過生物素-鏈霉親和素相互作用在R2上連接酶，催化比色反應(yīng)，結(jié)合薄層色譜（TLC），實現(xiàn)裸眼可見的可視化信號輸出，可用于乳腺癌和前列腺癌的篩查?？傊?，可視化檢測方法具有快速、便攜的特點，適用于床旁檢測以及資源有限地區(qū)的應(yīng)用。然而，可視化檢測方法的靈敏度需要進一步提高。

3.3 表面增強拉曼光譜檢測

表面增強拉曼散射（SERS）是一種特殊的拉曼散射現(xiàn)象，指的是在一些特殊材料，如金屬（Ag、Au）納米顆粒表面，分子的拉曼散射光譜強度顯著增強。由于較窄的光譜指紋特征，SERS與核酸適配體組合的檢測平臺已廣泛應(yīng)用于EVs的檢測。

SERS的信號增強效應(yīng)集中在高折射率面（即尖端和邊緣）［127］，因此，使用具有尖端或鋒利邊緣的納米結(jié)構(gòu)，如納米金字塔和納米星，可獲得比傳統(tǒng)的球形納米顆粒更強的SERS信號［128］。另外，還可通過調(diào)控金屬納米粒子的組裝模式來調(diào)整其等離子體特性，從而增強拉曼散射信號［127-128］。例如，Pan等［101］將Au納米星（AuNSs）修飾于二硫化鉬（MoS2）納米片上，組成MoS2-AuNSs復(fù)合材料，將SERS信號分子ROX標記的核酸適配體組裝在MoS2-AuNSs表面，捕獲外泌體。通過AuNSs和MoS2納米片的協(xié)同拉曼增強效應(yīng)，獲得了較強的SERS信號，外泌體的檢測限達17顆粒/μl。Zhang等［102］在三角錐DNA中組裝Au納米顆粒，獲得強電磁熱點SERS探針（圖6a）。在這種SERS探針中，Au納米顆粒之間的連接處可出現(xiàn)強電磁熱點，從而產(chǎn)生較強的SERS信號，同時，精確排列的TP-DNA納米結(jié)構(gòu)允許在三角形的特定角上組裝識別DNA，避免交叉偶聯(lián)事件。該方法對外泌體的檢測限達1.1×102顆粒/μl。除了通過改進金屬納米顆粒的組裝模式來增強檢測的信號強度，多種核酸擴增技術(shù)也被廣泛用于提高SERS傳感器檢測外泌體的靈敏度。如Cun等［103］將堿性磷酸酶誘導(dǎo)的SERS信號增強與HCR擴增相結(jié)合，建立一種快速檢測外泌體的-SERS免疫分析法，外泌體的檢出限為19顆粒/μl。

Fig.6 Aptamer-based SERS detection of EVs圖6 基于核酸適配體的EVs SERS檢測

非特異性吸附和金屬納米顆粒的隨機聚集導(dǎo)致熱點分布不可控，進而導(dǎo)致SERS檢測結(jié)果重復(fù)性差。因此，減少非特異性吸附，以及精確控制顆粒間距分布是靈敏和可重復(fù)性SERS分析的必要條件。Zhu等［104］將疏水等離子體底物與納米顆粒相結(jié)合，在沒有目標外泌體的情況下阻止Au@Ag納米立方體（Au@Ag NCs）非特異吸附SERS探針，提高結(jié)果可重復(fù)性（圖6b）。此外，Wang等［105］提出了一種基于自組裝金納米棒（AuNR）垂直陣列的超靈敏外泌體檢測新策略（圖6c）。AuNRs表面修飾的EpCAM核酸適配體捕獲外泌體后，DNA邏輯過程發(fā)生，CD63和HER2核酸適配體雙識別靶外泌體形成Co-DNA-Locker復(fù)合物，通過羅丹明6G的SERS信號檢測外泌體。AuNRs均勻地排列成六邊形，密集的“熱點”產(chǎn)生的“熱表面”大大提高了檢測的靈敏度和均勻性。

盡管SERS技術(shù)可用于外泌體的檢測，但有限的樣本量下實現(xiàn)外泌體的高效全面分析仍具有挑戰(zhàn)性。Ning等［106］為實現(xiàn)腫瘤相關(guān)外泌體的多重檢測，制備了3種核酸適配體修飾的磁珠（MB），以及修飾不同拉曼報告分子的3種金-銀-銀核-殼-殼納米棒（GSSNT）。3種GSSNT偶聯(lián)有DNA，通過堿基互補配對與核酸適配體探針雜交錨定在MB上，核酸適配體與靶外泌體特異性結(jié)合可釋放GSSNT，導(dǎo)致SERS信號減弱，從而實現(xiàn)外泌體的多重檢測（圖6d）。SERS技術(shù)因其高靈敏度、高分辨率、快速、低背景、抵抗基質(zhì)干擾以及對生物樣品的無創(chuàng)性等優(yōu)點在臨床診斷中具有很大的應(yīng)用前景。

3.4 熒光檢測

熒光法具有靈敏度高、特異性好等優(yōu)勢，在EVs的檢測中應(yīng)用廣泛。由于核酸適配體具有可編程性，可設(shè)計一系列的熒光生物傳感器，用于EVs的定量以及定性分析。使用熒光標記的核酸適配體識別EVs表面蛋白質(zhì)是當前EVs熒光檢測的常用方法，例如，Bai等［107］利用熒光分子標記的EpCAM和PD-L1核酸適配體預(yù)先識別細胞培養(yǎng)基或者血清中的外泌體，通入螺旋芯片中，納米尺度的預(yù)標記外泌體在螺旋芯片的黏彈性流體中單線聚集而被分離。實現(xiàn)了單顆粒水平的外泌體檢測（圖7a）。然而，該方法難以排除游離蛋白質(zhì)的干擾，在臨床診斷中的應(yīng)用價值受限。Hao等［30］提出了核酸適配體-二價膽固醇錨定組裝DNAzyme（ABCzyme）的策略，用于選擇性檢測PD-L1+EVs（圖7b）。利用PD-L1核酸適配體識別EVs表面PD-L1，二價膽固醇修飾的雙鏈DNA插入EVs的磷脂雙分子層，兩者在連接DNA鏈的作用下原位組裝成ABCzyme，可切割與其雜交的熒光報告DNA鏈（末端標記熒光分子FAM和猝滅分子BHQ1，具有RNA切割位點），釋放FAM熒光分子。通過檢測溶液中FAM的熒光強度，即可反映EVs來源的PD-L1表達量，排除游離PD-L1蛋白的干擾，可用于動態(tài)監(jiān)視癌癥發(fā)展情況。

Fig.7 Aptamer-based fluorescence detection of EVs圖7 基于核酸適配體的EVs熒光檢測

在非均勻溫度場的溶液中，具有不同物理性質(zhì)的分子的擴散速率不同，該現(xiàn)象被稱為熱泳。熱泳技術(shù)具有靈敏度高、無需預(yù)標記EVs、試劑與樣品消耗量少等優(yōu)勢，在EVs快速分析中的應(yīng)用日益廣泛。Huang等［26］使用篩選獲得的PD-L1核酸適配體標記外泌體，在熱泳裝置的熱點中，利用結(jié)合在外泌體的PD-L1核酸適配體比游離的核酸適配體擴散速度慢的特點，實現(xiàn)PD-L1+外泌體的快速、高靈敏度分析（圖7c）。Liu等［41］結(jié)合7種熒光標記的核酸適配體與熱泳技術(shù)，用于6種癌癥的檢測和分類。Tian等［108］結(jié)合8種熒光標記核酸適配體與熱泳技術(shù)，用于分析血漿EVs的癌癥相關(guān)蛋白質(zhì)譜，可鑒別非轉(zhuǎn)移性乳腺癌、轉(zhuǎn)移性乳腺癌和健康人，成功實現(xiàn)轉(zhuǎn)移性乳腺癌的療效預(yù)測。盡管上述方法可用于EVs的多靶標分析，但無法區(qū)分EVs的來源。Deng等［129］基于兩種核酸適配體的“AND”邏輯運算，發(fā)展腫瘤來源外泌體前列腺特異性膜抗原（prostate specific membrane antibody，PSMA）的選擇性檢測（圖7d）。EpCAM和PSMA的核酸適配體分別標記Cy3和Cy5熒光。僅當EpCAM和PSMA核酸適配體同時結(jié)合于外泌體表面EpCAM或PSMA時，Cy3和Cy5可在橋聯(lián)DNA鏈的作用下靠近，并發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移。通過熱泳檢測熒光共振能量轉(zhuǎn)移信號，選擇性分析腫瘤來源外泌體PSMA。該方法區(qū)分前列腺癌患者與良性前列腺增生的準確度可達91%。

上述檢測方法多對EVs進行定量檢測或者檢測其表面蛋白質(zhì)。近期研究表明，EVs表面蛋白質(zhì)的糖基化修飾在腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中有重要作用［130］，因此，檢測EVs蛋白糖基化對理解EVs的細胞間通訊功能具有重要意義。傳統(tǒng)的EVs表面蛋白質(zhì)糖基化檢測方法有免疫印跡［131］、質(zhì)譜［132］和凝集素陣列［133］等，這些方法需要將EVs裂解，純化蛋白質(zhì)。因此，難以準確探究EVs蛋白糖基化的生物學功能。為實現(xiàn)EVs蛋白糖基化的原位、非侵入檢測，Guo等［110］通過結(jié)合局部化學重塑和定量電化學，實現(xiàn)MUC1末端半乳糖/N-乙酰氨基半乳糖定量檢測。Wang等［109］發(fā)展了一種自助式軌道DNA行走器（STDW），以外泌體作為三維（3D）軌道，利用催化發(fā)卡組裝（catalytic hairpin assembly，CHA）驅(qū)動的分體式核酸適配體識別啟動行走器的自主運行，可實現(xiàn)外泌體N-乙酰半乳糖胺修飾蛋白的高靈敏度檢測（圖8a）。代謝聚糖標記是一種利用非天然單糖代謝途徑標記細胞表面聚糖的方法，結(jié)合代謝聚糖標記和熒光共振能量轉(zhuǎn)移，可實現(xiàn)蛋白糖基化的原位、非侵入檢測［134］。Zhu等［135］利用Cy3標記的PD-L1核酸適配體（PD-L1-Cy3）識別外泌體表面PD-L1，代謝聚糖標記以及后續(xù)生物正交反應(yīng)引入的Cy5熒光標記外泌體表面的糖，利用Cy3與Cy5的熒光共振能量轉(zhuǎn)移，實現(xiàn)外泌體表面PD-L1糖基化的原位可視化檢測（圖8b）。該方法首次證實了外泌體表面PD-L1糖基化在PD-1識別和CD8+T細胞增殖抑制中的生物功能。隨后，Kang等［136］利用代謝聚糖標記以及PD-L1核酸適配體標記，結(jié)合非功能表位雜交鏈式反應(yīng)（hybridization chain reaction，HCR），將EVs表面PD-L1糖基化信號增強了7.7倍。為探究外泌體PD-L1糖基化在癌癥診斷中的應(yīng)用價值，Zhu等［111］發(fā)展了基于凝集素以及核酸適配體的鄰位連接方法，結(jié)合實時定量PCR定量檢測糖基化外泌體PD-L1，檢測限達1.09 μg/L，并首次驗證了糖基化外泌體PD-L1比總外泌體PD-L1具有更高的癌癥診斷價值。

Fig.8 Aptamer-based detection of EV protein-specific glycosylation and nucleic acids圖8 基于核酸適配體的EVs蛋白糖基化和核酸檢測

除豐富的蛋白質(zhì)外，EVs還包含有大量細胞來源的核酸分子，如DNA、RNA、miRNA等，它們在疾病發(fā)展中具有重要的作用［137］。傳統(tǒng)EVs的miRNA分析方法包括核酸酶輔助信號放大［138］，下一代測序技術(shù)［139］等，這些方法需要裂解EVs、提取核酸、逆轉(zhuǎn)錄等過程，步驟較為繁瑣，并且易造成miRNA降解。Cui等［112］發(fā)展了一步原位分析EVs miRNA的方法。通過核酸適配體介導(dǎo)的脂質(zhì)體與EVs的融合，脂質(zhì)體中包裹的分子信標與EVs中的miRNA識別后熒光信號恢復(fù)，利用流式細胞儀即可高效分析EVs中的腫瘤來源miRNA。該方法無需裂解待測EVs，且具有特異性好、耗時短和通用性強等優(yōu)勢。利用該方法首次發(fā)現(xiàn)PD-L1+EVs中miRNA-21與患者的腫瘤負荷相關(guān)。進一步，F(xiàn)eng等［113］提出了一種編碼融合策略，通過制備具有內(nèi)置編碼的膜融合載體，用于腫瘤EVs miRNA的多重檢測（圖8c）。以雙編碼多孔硅珠為載體，制備一組編碼的靶向融合微珠（ETFBs），且微珠內(nèi)裝載有識別miRNA的分子信標。在微柱表面覆蓋脂質(zhì)雙分子層，并修飾腫瘤EVs靶向核酸適配體，用于選擇性識別和融合腫瘤EVs。融合后，微珠中分子信標與其靶向的miRNA互補配對開啟報告信號，通過商品化流式細胞儀即可對腫瘤EVs的miRNA進行多重檢測，用于胰腺癌的診斷。

3.5 信號放大方法

為了提高EVs的檢測靈敏度，往往需對與EVs結(jié)合的核酸適配體的輸出信號進行放大。核酸適配體因易組裝與可程序化設(shè)計等優(yōu)勢，可實現(xiàn)與多種信號放大機制結(jié)合，以增強EVs的分析靈敏度。核酸適配體的信號擴增方法分為兩種：直接信號放大以及競爭性信號放大。

直接信號放大是通過特殊的序列設(shè)計，在核酸適配體序列中增加功能性片段，利用功能性片段直接觸發(fā)核酸擴增反應(yīng)，實現(xiàn)待測信號放大。常用的核酸擴增方法有RCA、HCR、CHA等。例如，He等［140］發(fā)展了基于掛鎖探針式指數(shù)RCA擴增方法（R-EPCA），用于EVs的高特異性和高靈敏熒光檢測。通過掛鎖探針（具有核酸內(nèi)切酶切割位點）與偶聯(lián)于特異性核酸適配體末端的引物序列的互補配對，引發(fā)指數(shù)RCA反應(yīng)，用核酸內(nèi)切酶切割R-EPCA反應(yīng)產(chǎn)物，可產(chǎn)生單鏈DNA，用于下一輪擴增。用熒光染料SYBR Green II將R-EPCA產(chǎn)物染色，即可反映EVs的含量。該方法對EVs的檢測限為～4.2顆粒/μl。但RCA反應(yīng)操作復(fù)雜，且反應(yīng)過程依賴酶催化，從而限制了其在臨床診斷中的應(yīng)用。HCR與CHA為無酶核酸擴增技術(shù)，在臨床樣本檢測中的適用性更好。例如，Shen等［141］發(fā)展了一種單個EV流式分析技術(shù)，用于單個EV計數(shù)以及表型分析（圖9a）。通過設(shè)計一種由CD63核酸適配體和觸發(fā)結(jié)構(gòu)域組成的可切換探針，用于觸發(fā)HCR擴增，不僅放大了熒光信號，還將EVs的尺寸增加至500 nm以上，使用傳統(tǒng)流式細胞儀即可檢出EVs的熒光信號。Chen等［142］設(shè)計了一種可編程恒溫級聯(lián)式無酶報告器（PIKER），利用EpCAM和CD63核酸適配體分別標記外泌體表面對應(yīng)靶標，并與CHA擴增結(jié)合，用于定量分析腫瘤患者血漿中腫瘤來源EVs和總EVs（圖9b）。該方法對腫瘤來源EVs的檢測限達420顆粒/μl。然而，直接信號放大方法中，核酸擴增一般在EVs表面發(fā)生。受空間位阻的影響，擴增效率有限，影響信號放大效率。

Fig.9 Signal amplification methods圖9 信號放大方法

競爭性信號放大方法中，設(shè)計特殊的擴增反應(yīng)引發(fā)序列，使其與EVs表面蛋白競爭核酸適配體上的序列。無EVs存在時，引發(fā)序列與核酸適配體互補配對，無法引發(fā)核酸擴增反應(yīng)；而當EVs與核酸適配體結(jié)合后，釋放引發(fā)序列于溶液中，在溶液中進行擴增反應(yīng)。因此，核酸擴增反應(yīng)產(chǎn)物不受空間位阻的影響，具有較高的擴增效率。例如，Zhou等［143］發(fā)展了競爭CHA擴增反應(yīng)，用于腫瘤EVs的高靈敏檢測（圖9c）。將核酸適配體偶聯(lián)于磁珠上，并與一段引發(fā)序列互補配對，EVs競爭性地與核酸適配體識別后釋放引發(fā)序列，引發(fā)序列在溶液中完成CHA擴增，該方法對EVs檢測靈敏度低至0.1顆粒/μl。Cheng等［144］發(fā)展了一種基于黏性末端介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)（TMSD）的雙色DNA納米裝置，用于高靈敏同時分析EVs表面CD63和MUC1蛋白（圖9d）。使用CD63和MUC1核酸適配體-磁珠納米復(fù)合物識別EVs后，釋放引發(fā)序列，觸發(fā)TMSD擴增，該方法對CD63+EVs和MUC1+EVs的檢測限分別為 67顆粒/μl和37顆粒/μl。除此之外，也可預(yù)先完成序列擴增，再通過EVs與功能化序列競爭核酸適配體的結(jié)合位點，釋放已擴增好的熒光信標，來實現(xiàn)信號擴增，簡化操作步驟［145］。

得益于核酸適配體的易化學修飾性以及可程序設(shè)計性，以核酸適配體為識別配體可以很容易地實現(xiàn)EVs的靈敏、特異性檢測。電化學方法具有快速、靈敏的特點，但易受環(huán)境干擾，需提高其在臨床樣本中的檢測性能。可視化方法根據(jù)肉眼可辨識的信號檢測待測物，具有快速、操作簡單、儀器便攜等優(yōu)勢。盡管可視化方法的靈敏度有待提高，其不依賴大型儀器的特點使其較適用于即時檢測（POCT）。SERS具有靈敏度高、分辨率高等特點，但其對臨床樣本定量檢測的準確度有限。熒光法利用熒光信號對EVs進行檢測，熒光標記策略發(fā)展以及豐富多樣的信號讀出裝置的開發(fā)，使其成為EVs檢測最常用的方法之一。但其依賴大型儀器的特點使其不適用于現(xiàn)場檢測。EVs的納米尺度為其高靈敏檢測提出了挑戰(zhàn)，核酸適配體的可程序設(shè)計性使其易于與多種放大機制結(jié)合。研究者們提出多種直接信號放大以及競爭性信號放大方法，大大提高了EVs檢測的靈敏度，為其臨床應(yīng)用提供了支撐。

4 總結(jié)與展望

EVs通過將蛋白質(zhì)、核酸、代謝物等傳遞到受體細胞中，改變受體細胞的生物學反應(yīng)，在諸多生物學過程，如免疫反應(yīng)、組織修復(fù)、干細胞維持中發(fā)揮重要作用。EVs還參與調(diào)控一系列病理過程，如癌癥、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、病原體感染等。因此，探究EVs的生物醫(yī)學機制，有助于理解疾病的發(fā)生發(fā)展過程并為疾病的治療提供指導(dǎo)。此外，EVs包含豐富的生物標志物，可為疾病的診斷和預(yù)后分析提供重要信息。EVs還可用作藥物運送的載體，用于疾病的治療。因此，EVs的高效分離和檢測在其臨床應(yīng)用中具有重要意義。核酸適配體作為一種高性能的識別配體，具有易合成、易化學修飾以及可程序化設(shè)計等特點，為EVs的高效分離和分析提供有效識別工具。本綜述全面概述了核酸適配體的篩選方法、基于核酸適配體的EVs分離方法、基于核酸適配體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方式的EVs檢測方法以及信號放大策略。

盡管EVs具有較好的臨床應(yīng)用潛力，基于核酸適配體的EVs的分離和檢測面臨諸多挑戰(zhàn)。首先，現(xiàn)有的特異性識別EVs表面蛋白的高性能核酸適配體較少，并且核酸適配體在復(fù)雜體系中的結(jié)合性能通常會降低，限制了其在臨床中的應(yīng)用。盡管研究者們已發(fā)展多種篩選方法以及工程策略，用于加速核酸適配體的發(fā)現(xiàn)，及提高核酸適配體的性能，但這些識別分子或元件在復(fù)雜樣本中的可靠性有待驗證。其次，EVs異質(zhì)性較強。除尺寸異質(zhì)性，不同EVs亞群顯示出不同的生物物理性質(zhì)，如電荷性和剛性，蛋白質(zhì)組、核酸組、糖組的差異［146］，以及來源的異質(zhì)性。不同的亞群的生物學功能以及與疾病的相關(guān)性不同。然而，這些異質(zhì)性的EVs表達的某些蛋白質(zhì)通常是重疊的，限制了不同亞群EVs的準確分離和分析。最后，現(xiàn)有EVs研究方法的生物學和臨床意義需進一步驗證?，F(xiàn)有方法通常分離分析培養(yǎng)的細胞系上清或體液中的EVs，失去了組織中多種共生細胞的相互作用信息［147］。此外，將細胞分泌的EVs摻入血清或血液樣品，以模擬臨床樣本的模型不能代表體液中EVs的真實生物狀態(tài)，需要足夠的臨床樣本評估其臨床價值。

隨著對EVs的生物學性質(zhì)的理解深入，對EVs高效、精準分離和分析的需求將持續(xù)增長。自動化技術(shù)以及生物信息學的發(fā)展將加速高性能核酸適配體的發(fā)現(xiàn)；DNA納米技術(shù)可用于構(gòu)建在臨床樣本中性能優(yōu)越的核酸適配體識別元件；結(jié)合多種核酸適配體以及其他識別分子的邏輯運算的方法可用于分離分析不同亞群的EVs。此外，隨著組織中EVs研究的逐漸開展，對EVs的生物學功能的理解將更加全面。總之，基于核酸適配體的EVs分離分析的臨床轉(zhuǎn)化將有助于疾病的精準診療。