一測多評法同時測定都梁丸中7 種成分的含量

袁子民，朱春璐，王 靜*

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600；2.石藥集團遠(yuǎn)大大連制藥有限公司，遼寧 大連116021）

都梁丸收載于2020 年版《中國藥典》，處方由酒燉白芷和川芎組成，具有祛風(fēng)散寒、活血通絡(luò)之功效，臨床多用于治療風(fēng)寒淤血阻滯脈絡(luò)所致的頭痛[1]。主要含有香豆素類、苯酞類、揮發(fā)油類、有機酸類等化學(xué)成分，通過改善血液黏度與血流動力學(xué)、調(diào)節(jié)血管舒縮相關(guān)因子及抗炎、鎮(zhèn)痛等藥理作用發(fā)揮藥效[2-4]。目前，都梁丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)報道中多以歐前胡素或阿魏酸為含量測定指標(biāo)[5-7]，缺少有效表征其多指標(biāo)化學(xué)成分的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。因此，本研究在對其血清藥物化學(xué)研究的基礎(chǔ)上[8]，采用HPLC 法建立一測多評法同時測定都梁丸中阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、水合氧化前胡素、白當(dāng)歸素、歐前胡素、洋川芎內(nèi)酯A、異歐前胡素含量，以期為都梁丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升及其改良型制劑的二次開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent1100 型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；都梁丸按2020 年版《中國藥典》（一部）制法自制（D1-D10）；歐前胡素（批號：110826-200307，純度≥98%）購于中國食品藥品檢定研究院；白當(dāng)歸素（批號：P01028SA13，純度≥98%）、水合氧化前胡素（批號：R25A6F2764，純度≥98%）、異歐前胡素（批號：ZM0531BB13，純度≥98%）均購于上海源葉生物科技有限公司，洋川芎內(nèi)酯A（批號：17051901，純度≥98%）、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ（批號：17121104，純度≥98%)、阿魏酸(批號：17092501，純度≥98%)均購于成都普菲德生物技術(shù)有限公司。乙腈、甲醇、磷酸均為色譜純；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18(5μm，250 mm×4.6 mm)；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫：0 ～ 50 min，5%→65%A； 50 ～ 70 min，65%→95%A；檢測波長：300 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣體積：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 分別取10 批都梁丸樣品，剪碎，混勻，取約3 g，精密稱定，精密加入等量的硅藻土，研勻，取約2 g，精密稱定，置容量瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定，超聲（250 W，40 kHz）1h，放冷，用70%甲醇補足失重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、水合氧化前胡素、白當(dāng)歸素、洋川芎內(nèi)酯A、歐前胡素、異歐前胡素對照品適量，置50 mL 容量瓶中，加甲醇制成濃度分別為0.232 mg/mL、0.209 mg/mL、0.136 mg/mL、0.060 mg/mL、0.422 mg/mL、0.160 mg/mL、0.125 mg/mL的對照品溶液，備用。分別精密量取洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、白當(dāng)歸素、歐前胡素、異歐前胡素對照品溶液各1.0 mL、阿魏酸對照品溶液0.5 mL、水合氧化前胡素對照品溶液0.25 mL、洋川芎內(nèi)酯A 對照品溶液2.0 mL 置10 mL 容量瓶中，加甲醇制成阿魏酸11.600 μg/mL、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ 20.900 μg /mL、水合氧化前胡素3.400 μg/mL、白當(dāng)歸素6.000μg /mL、洋川芎內(nèi)酯A 84.400 μg/mL、歐前胡素16.000 μg /mL、異歐前胡素12.500 μg/mL 的混合對照品溶液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按照都梁丸處方及制法分別制備不含酒燉白芷、川芎的陰性樣品，按“2.2.1”項下方法制備陰性樣品溶液，即得。

2.3 陰性干擾試驗

分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各10 μL，按“2.1”項下色譜條件依法進(jìn)樣測定分析，結(jié)果見圖1 ～ 4。由圖可知，各待測成分與相鄰色譜峰能分離較好，相應(yīng)陰性樣品溶液無干擾。

圖1 HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系試驗 分別精密吸取“2.3”項下混合對照品溶液2.5、5、10、15、20 μL，注入液相色譜儀。以對照品進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸，得到線性方程，結(jié)果見表1，表明各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 線性方程及線性范圍Tab.1 Linear equation and linear range

2.4.2 精密度試驗 取同一都梁丸供試品溶液10 μL，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，計算阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、水合氧化前胡素、白當(dāng)歸素、洋川芎內(nèi)酯A、歐前胡素、異歐前胡素峰面積的RSD，分別為0.68%、0.88%、0.46%、0.73%、0.76%、0.28%、0.50%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取同一都梁丸供試品溶液10 μL，于0、2、4、8、10、12 h 在“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，計算阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、水合氧化前胡素、白當(dāng)歸素、洋川芎內(nèi)酯A、歐前胡素、異歐前胡素峰面積的RSD，分別為0.63%、0.67%、0.48%、0.54%、0.72%、0.24%、0.38%，表明都梁丸供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗 取同一都梁丸6 份，精密稱定，分別按供試品溶液制備方法制備6 份，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，分別測定阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、水合氧化前胡素、白當(dāng)歸素、洋川芎內(nèi)酯A、歐前胡素、異歐前胡素含量并計算RSD，分別為0.99%、1.55%、1.47%、1.16%、0.91%、1.34%、1.37%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 取已知含量都梁丸約3 g，平行6 份，分別加入等量的硅藻土，研勻，分別取約 1 g，精密稱定，分別加入阿魏酸（0.232 mg/mL）0.65 mL、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ（0.209 mg/mL）0.35 mL、水合氧化前胡素（0.136 mg/mL）0.25 mL、白當(dāng)歸素（0.060 mg/mL）0.55 mL、洋川芎內(nèi)酯A（0.422 mg/mL）1.8 mL、歐前胡素（0.160 mg/mL）2.2 mL、異歐前胡素（0.125 mg/mL）1.5 mL，其余按供試品溶液制備方法操作，分別計算加樣回收率和RSD，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率測定結(jié)果（n = 6）Tab.2 Determination results of sample recovery（n = 6）

2.5 一測多評法的建立

2.5.1 相對校正因子的計算 取歐前胡素為內(nèi)參物（S），按公式fk/m＝fk/fm＝Wk/Wm×（Am/Ak）分別計算阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、水合氧化前胡素、白當(dāng)歸素、洋川芎內(nèi)酯A、異歐前胡素的相對校正因子，式中Wk和Ak分別為內(nèi)參物的峰面積和濃度，Wm和Am分別為其他組分m 的峰面積和濃度[9]。阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、水合氧化前胡素、白當(dāng)歸素、洋川芎內(nèi)酯A、異歐前胡素和內(nèi)參物歐前胡素間的校正因子分別為1.236 2、0.427 3、2.600 4、1.247 9、0.108 8、0.846 4。

2.5.2 相對校正因子及色譜峰定位的相對保留值的重復(fù)性考察 主要考察安捷倫1100 和島津LC-20AT 高效液相色譜儀， Agilent（250 mm×4.6 mm，5μm）和Diamonsil（250 mm×4.6 mm，5μm）色譜柱以及三種不同溫度（25、30、35℃）對相對校正因子及色譜峰定位的相對保留值的影響，結(jié)果各成分相對校正因子的RSD ≤1.75%，各成分的色譜峰定位的相對保留值的RSD ≤0.3%，結(jié)果穩(wěn)定可靠，符合一測多評法的相關(guān)要求。

2.5.3 一測多評法（QAMS）與外標(biāo)法含量測定結(jié)果的比較 精密吸取10 批都梁丸供試品溶液各10μL，按“2.1”項下的色譜條件測定，分別采用外標(biāo)法與QAMS 法計算都梁丸中7 種成分含量[10]，結(jié)果表明兩種方法測定的結(jié)果RSD 均小于2%，表明QAMS 法適用于都梁丸多成分的測定，測定結(jié)果見表3。

表3 10 批都梁丸樣品中7 種成分含量測定結(jié)果（%，n = 3）Tab.3 Determination results of 7 components in 10 batches of Duliang pills (%, n = 3)

3 討論

目前都梁丸含量測定主要以歐前胡素或阿魏酸為含量測定指標(biāo)，對于都梁制劑的其他劑型中有些采用了多指標(biāo)含量測定，如采用HPLC 法同時對都梁軟膠囊中花椒毒酚、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、異歐前胡素、氧甲基異歐前胡內(nèi)酯進(jìn)行測定[11]，對都梁滴丸中的阿魏酸、5-甲氧基補骨脂素、歐前胡素、異歐前胡素進(jìn)行測定[12]。但指標(biāo)的選擇依據(jù)不足，對白芷測定的成分較多，川芎測定成分較少。本研究結(jié)合都梁丸指紋圖譜色譜峰分離度、含量及血清藥物化學(xué)研究結(jié)果[8]，選擇入血原型成分阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、水合氧化前胡素、白當(dāng)歸素、歐前胡素、洋川芎內(nèi)酯A、異歐前胡素7 種成分作為都梁丸含量測定的多指標(biāo)成分，涵蓋了酒燉白芷中4 種成分，川芎中3種成分，能夠表征測定都梁丸中藥效物質(zhì)，提高都梁丸的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

在含量測定研究中，根據(jù)7 種成分的紫外吸收波長，選取了254 nm 和300 nm 對測定波長進(jìn)行考察，結(jié)果在300 nm 測定波長下，待測成分信號強，雜質(zhì)干擾少，故確定300 nm 為測定波長。對甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-水等流動相系統(tǒng)進(jìn)行了考察，結(jié)果以乙腈-0.1%磷酸溶液系統(tǒng)的待測成分的分離效果最佳，基線波動平穩(wěn)。采用稀乙醇和70%甲醇對供試品溶液制備的提取溶劑進(jìn)行考察，結(jié)果采用70%甲醇提取較為完全，雜質(zhì)干擾少，故選擇70%甲醇作為提取溶劑。

4 結(jié)論

本研究采用HPLC 法與QAMS 法建立了同時測定都梁丸中7 種成分的含量測定方法，方法簡單、準(zhǔn)確可行，可用于都梁丸的質(zhì)量評價和指紋圖譜及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的深入研究。