響應(yīng)面優(yōu)化辣木葉低聚糖提取工藝

李運(yùn)超,薛雅儒,楊羽琪,鄭 杰,聞?wù)?鄭 斌

(浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院,浙江舟山 316022)

辣木(MoringaoleiferaLam.),別名鼓槌樹,是多年生熱帶喬木。辣木起源于熱帶的印度,在當(dāng)?shù)赜兄捌孥E之樹”的美譽(yù)[1]。辣木的根、莖、葉、果實(shí)都具有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),其中以辣木葉營(yíng)養(yǎng)含量最為豐富,2012年辣木葉被我國(guó)批準(zhǔn)為新資源食物。辣木葉中含有多種多樣的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生物活性成分[2],在印度作為基礎(chǔ)食品和傳統(tǒng)藥材。辣木葉還具有極大的商業(yè)潛力,目前已經(jīng)應(yīng)用于食品[3]、畜牧業(yè)[4],應(yīng)用于醫(yī)療業(yè)[5-9]和保健品[10]市場(chǎng)有巨大前景。辣木葉的活性成分眾多,蛋白質(zhì)、多糖、黃酮類[11]等有較好的抗氧化活性。但辣木葉中的天然低聚糖還沒有被開發(fā)利用,在提取辣木多糖的同時(shí)往往被棄除掉。低聚糖作為一種腸道益生菌的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),無(wú)法被消化吸收,但可以作為益生元[12-13]供給腸道菌群,有益于身體健康。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于辣木葉低聚糖的研究鮮見報(bào)道。

低聚糖的提取方法包括水提法、酶解法、超聲波輔助法等。Zhai等[14]用水提法提取三七低聚糖,發(fā)現(xiàn)其可以抑制細(xì)胞復(fù)制性衰老;嵇威等[15]用木聚糖酶解玉米秸稈制備低聚糖,提取率達(dá)到59.24%;郭澤鑌等[16]用微波輔助法提取蓮子低聚糖,該提取工藝低聚糖得率達(dá)到10.525%。該研究以辣木葉為原料,用熱水浸提法提取辣木葉中的天然低聚糖成分;使用苯酚硫酸法測(cè)定其低聚糖含量,通過單因素試驗(yàn)探究各個(gè)因素對(duì)提取液中低聚糖含量的影響,再進(jìn)一步通過響應(yīng)面分析,綜合各因素分析得到提取辣木葉低聚糖的最優(yōu)工藝條件,為辣木葉低聚糖活性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1試材。無(wú)水乙醇(20170413)、三氯甲烷(191108558F)、正丁醇(20210508)、硫酸(10021618)、苯酚試劑(20171020)均為分析純,來自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;辣木葉,采購(gòu)自北京金日豐科貿(mào)有限責(zé)任公司。

1.1.2儀器。HH-W600數(shù)顯三用恒溫水箱,金壇市醫(yī)療儀器廠;TDZ5-WS臺(tái)式低速離心機(jī),長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司;90-2定時(shí)恒溫磁力攪拌器,上海精科實(shí)業(yè)有限公司;MULTISKAN GO 酶標(biāo)儀,賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;FD-1E 冷凍干燥機(jī),北京德天佑科技發(fā)展有限公司;N-100 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海保玲儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1辣木葉低聚糖的提取流程。辣木葉干燥后粉碎,過60目篩,得到辣木葉粉末。稱取50 g辣木葉粉末,加入1 500 mL 水,70 ℃水浴加熱30 min,過濾后得上清液。上清液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至400 mL,倒入100 mL的Sevage試劑(三氯甲烷∶正丁醇=4∶1)脫蛋白,600 r/min磁力攪拌1 h,4 000 r/min離心15 min取上清,重復(fù)操作至無(wú)蛋白析出。再次通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀來減壓濃縮,60 ℃旋蒸30 min去除殘留的Sevage試劑并濃縮糖溶液。糖溶液中加入無(wú)水乙醇調(diào)至含乙醇量80%,加乙醇時(shí)不斷攪動(dòng)溶液,4 ℃保存24 h,離心棄除多糖沉淀,上清液濃縮后冷凍干燥,即得到辣木葉低聚糖。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。將葡萄糖干燥,稱取0.01 g葡萄糖,加10 mL水溶解,配制成1 mg/mL的葡萄糖溶液,分別吸取40、80、120、160、200 μL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液于試管中,不足200 μL的加水補(bǔ)齊至200 μL,向試管中分別加入100 μL苯酚、300 μL濃硫酸,之后放入85 ℃水浴鍋加熱15 min,在室溫下冷卻,于490 nm處測(cè)定吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

1.2.3糖溶液的配制及含量測(cè)定。

1.2.3.1辣木葉總糖溶液的配制。辣木葉經(jīng)過烘干后粉碎,過60目篩,稱取1 g辣木葉粉末,加適量水,70 ℃水浴加熱3 min,得到總糖溶液。

1.2.3.2辣木葉多糖溶液的配制。吸取1 mL總糖溶液至10 mL 離心管,加入5 mL無(wú)水乙醇,充分搖勻后放入4 ℃離心機(jī)內(nèi)靜置1 h,隨后4 000 r/min離心10 min,棄除上清液,并用80%乙醇潤(rùn)洗沉淀,之后沉淀加1 mL水溶解,得到多糖溶液。

1.2.3.3辣木葉總糖含量測(cè)定。將“1.2.3.1”步驟中總糖溶液稀釋至10倍,利用苯酚硫酸法測(cè)定總糖含量。

1.2.3.4辣木葉多糖含量測(cè)定。利用苯酚硫酸法,測(cè)定“1.2.3.2”步驟多糖溶液中的多糖含量。

1.2.3.5辣木葉低聚糖含量?？偺呛繙p去多糖含量即為低聚糖含量[17]。

1.2.4單因素試驗(yàn)。

1.2.4.1提取溫度對(duì)辣木葉低聚糖含量的影響。設(shè)置料液比為1∶30(g∶mL)、提取時(shí)間30 min,研究一定梯度內(nèi)溫度(50、60、70、80、90 ℃)對(duì)辣木葉低聚糖含量的影響。

1.2.4.2料液比對(duì)辣木葉低聚糖含量的影響。設(shè)定溫度 70 ℃、提取時(shí)間 30 min,改變料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、 1∶50、1∶60)研究其變化對(duì)辣木葉低聚糖含量的影響。

1.2.4.3提取時(shí)間對(duì)辣木葉低聚糖含量的影響。在確定料液比1∶30、提取溫度 70 ℃時(shí),改變提取時(shí)間(15、30、45、60、90、120 min),研究提取時(shí)間對(duì)辣木葉低聚糖含量的影響。

1.2.5響應(yīng)面試驗(yàn)。根據(jù)單因素試驗(yàn)設(shè)置合適梯度的提取溫度(A)、料液比(B)和提取時(shí)間(C),使用Design-Expert 8.0 軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn),其因素和水平見表1。通過交叉作用探究其中各因素對(duì)低聚糖含量的影響程度,方便在提取過程中更好地控制低聚糖含量穩(wěn)定。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1料液比對(duì)辣木葉低聚糖含量的影響。從圖2可以看出,料液比對(duì)辣木葉低聚糖含量的影響呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),在料液比1∶30時(shí)辣木葉低聚糖含量最佳。在料液比不足1∶30時(shí),水作為媒介用量不足以讓辣木葉粉末中的低聚糖全部溶出;所以,在確定1∶30為最佳料液比的情況下,選擇與其相鄰的1∶20和1∶40為響應(yīng)面試驗(yàn)考察因素。

圖2 料液比對(duì)辣木葉低聚糖含量的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on oligosaccharide content from Moringa oleifera leaf

2.1.2提取時(shí)間對(duì)辣木葉低聚糖含量的影響。從圖3可以看出,短時(shí)間的加熱使辣木葉低聚糖含量達(dá)到頂峰,之后出現(xiàn)斷崖式的下降。辣木葉低聚糖含量在提取時(shí)間為30 min時(shí)達(dá)到最大值。這可能是辣木葉低聚糖提取過程中,低聚糖不斷溶出伴隨其他雜質(zhì)的溶出,雜質(zhì)增多的情況下使得低聚糖的溶出量降低[18],導(dǎo)致低聚糖含量下降。所以,選擇提取時(shí)間為15、30、45 min為響應(yīng)面試驗(yàn)考察因素。

圖3 提取時(shí)間對(duì)辣木葉低聚糖含量的影響Fig.3 Effect of extraction time on oligosaccharide content from Moringa oleifera leaf

2.1.3提取溫度對(duì)辣木葉低聚糖含量的影響。從圖4可以看出,在50～90 ℃,溫度對(duì)辣木葉低聚糖含量的影響呈現(xiàn)出先升后降趨勢(shì),且具有一定程度的對(duì)稱性。這可能是因?yàn)闇囟冗^高導(dǎo)致了低聚糖的分解。70 ℃為辣木葉低聚糖的最佳提取溫度,選擇與其相鄰的60和80 ℃為響應(yīng)面試驗(yàn)考察因素。

圖4 提取溫度對(duì)辣木葉低聚糖含量的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on oligosaccharide content from Moringa oleifera leaf

2.2 辣木葉低聚糖提取工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)以提取溫度(A)、料液比(B)、提取時(shí)間(C)為自變量,低聚糖含量為響應(yīng)值,根據(jù)Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果(表2),得到二次多項(xiàng)回歸方程:低聚糖含量=19.084+0.782 50A- 0.578 75B+ 0.728 75C-1.020 0AB-0.925 0AC-0.602 5BC-3.423 25A2-5.060 75B2-5.525 75C2。

表2 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

表3 回歸模型方差分析

從各因素之間的交互作用的3D響應(yīng)面圖(圖5～7)來看,分析2個(gè)因素之間的相互影響作用,在其中一個(gè)為定量不變時(shí),辣木葉低聚糖含量的變化均隨另一個(gè)因素呈先增后減波動(dòng),但波動(dòng)程度略有差異。提取溫度和料液比的交互作用,提取溫度一側(cè)的陡峭程度較料液比高,說明提取溫度對(duì)交互作用的影響更大,對(duì)低聚糖含量的影響也更大;提取溫度和提取時(shí)間的交互作用,提取溫度和提取時(shí)間對(duì)低聚糖含量的影響大致相同;料液比和提取時(shí)間的交互作用,提取時(shí)間對(duì)低聚糖含量的影響更大,在實(shí)際操作中,應(yīng)關(guān)注敏感因素提取溫度對(duì)工藝的影響。從等高線進(jìn)行分析,等高線的形狀可反映交互效應(yīng)的強(qiáng)弱,橢圓形表示兩因素交互作用顯著,而圓形則與之相反,提取溫度-料液比和提取溫度-提取時(shí)間的等高線圖都略呈橢圓形,交互作用接近,但料液比-提取時(shí)間的等高線圖近乎是圓形,兩者的相互作用沒有顯著性。

圖5 提取溫度-料液比交互作用3D響應(yīng)面和等高線Fig.5 Effect of extraction temperature-liquid ratio interaction 3D response surface and contour plot

圖6 提取溫度-提取時(shí)間交互作用3D響應(yīng)面和等高線圖Fig.6 Extraction temperature-extraction time interaction 3D response surface and contour plot

圖7 提取時(shí)間-料液比交互作用3D響應(yīng)面和等高線圖Fig.7 Extraction time-solid-liquid ratio interaction 3D response surface and contour plot

根據(jù)Design-Expert 8.0運(yùn)行結(jié)果,辣木葉低聚糖最優(yōu)提取條件是提取溫度71.185 9 ℃、料液比1∶29.268 1、提取時(shí)間30.03 min,在此工藝條件下提取液中辣木葉低聚糖含量為19.17 mg/mL。為了方便試驗(yàn)操作,最優(yōu)提取條件定為提取溫度70 ℃、料液比1∶30、提取時(shí)間30 min,此工藝條件下提取液中辣木葉低聚糖含量約為19.50 mg/mL。

3 結(jié)論與討論

辣木因其豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和良好的藥用效果,逐漸被人們所熟知和關(guān)注[2]。低聚糖在保健品等市場(chǎng)有巨大潛力,將辣木葉低聚糖作為功能因子[17-20]納入保健品能夠拓寬辣木葉的銷售渠道,提高辣木葉的綜合利用價(jià)值。所以對(duì)辣木葉低聚糖進(jìn)行開發(fā)和利用,提供一種簡(jiǎn)單且高效提取辣木葉低聚糖工藝具有重要的戰(zhàn)略意義。目前對(duì)辣木葉低聚糖的研究鮮見報(bào)道,辣木葉低聚糖在辣木葉多糖提取過程中往往被丟棄,該研究提供了一種簡(jiǎn)單高效提取辣木葉低聚糖的方法,在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面分析,根據(jù)Design-Expert 8.0運(yùn)行結(jié)果,辣木葉低聚糖最優(yōu)提取條件為提取溫度71.185 9 ℃、料液比1∶29.268 1(g∶mL)、提取時(shí)間30.03 min,此時(shí)的低聚糖含量為19.17 mg/mL。為了方便試驗(yàn)操作,最優(yōu)提取條件定為提取溫度70 ℃、料液比1∶30、提取時(shí)間30 min,試驗(yàn)所提取的低聚糖含量約為19.50 mg/mL,且該低聚糖樣品易吸潮,需要覆蓋封口膜保存在干燥皿內(nèi),以免吸潮影響其質(zhì)量和活性。該試驗(yàn)用熱水浸提法提取辣木葉低聚糖,方法可靠,為之后水提法提取辣木葉低聚糖提供了可靠的方法。在此方法之后,可以嘗試使用超聲輔助提取和酶解法,進(jìn)一步探究提取低聚糖的經(jīng)濟(jì)高效方法。該研究提取的辣木葉低聚糖純度還有待提高,后續(xù)可經(jīng)大孔樹脂脫色、凝膠色譜柱以及高效液相色譜分離獲得更高純度的低聚糖,利用核磁和質(zhì)譜技術(shù)對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定,并進(jìn)一步探究其活性,為辣木葉低聚糖打開銷售市場(chǎng)提供技術(shù)支持。