產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的篩選與體外益生特性評價

◎ 李 悅，陳 靜，張曉雨，劉 義，韋云路

（1.西南科技大學生命科學與工程學院，四川 綿陽 621000；2.貴州食品工程職業(yè)學院，貴州 貴陽 550000）

胞外多糖(EPS)是乳酸菌向周邊環(huán)境產(chǎn)生的高分子化合物，主要由糖和糖的衍生物組成[1]，長期以來一直被安全地用于食品工業(yè)[2]。由于LAB通常被認為是一種安全的食品微生物，純化的LAB和EPS可以直接用于乳品行業(yè)，作為商業(yè)乳化劑和增稠劑的替代品，以改善酸奶的黏度、質(zhì)地和風味[3,4]。然而，雖然人們普遍認識到了LAB與EPS的各種好處，但只有少數(shù)產(chǎn)品已經(jīng)商業(yè)化和工業(yè)化生產(chǎn)。

分離能夠產(chǎn)生活性EPS的天然乳酸菌株，是廣泛使用和應用乳酸菌的先決條件。發(fā)酵食品大多是由乳酸菌發(fā)酵而成，可以作為產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的重要來源[5]。研究者發(fā)現(xiàn)一種土耳其飲料，以植物乳桿菌為主要菌種，并從天然發(fā)酵的青橄欖汁中篩選了17個以上的菌株[6-9]。

研究表明，產(chǎn)生胞外多糖的乳酸菌和發(fā)酵劑的結(jié)合，可以增加酸奶的黏度和改善口感，而酸奶的黏度主要由形成胞外多糖的數(shù)量及結(jié)構(gòu)決定[10-11]。Helen等[12]人提出，產(chǎn)胞外多糖乳酸菌在提高發(fā)酵乳硬度方面具有一定效果，且EPS產(chǎn)量越高，制品硬度越小。隨著穩(wěn)定劑在歐洲被禁止使用，出現(xiàn)了不使用添加劑的天然食品[13]。

本研究采用四川特色傳統(tǒng)發(fā)酵食品臘肉與泡菜作為原材料，篩選并鑒定高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌菌株，且對其抗氧化性與自聚集能力進行評價，以期為開展高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的開發(fā)與研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料：自然發(fā)酵的泡菜、四川農(nóng)家自制臘肉。

培養(yǎng)基：MRS固體培養(yǎng)基、MRS液體培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)公司。

試劑：胰蛋白酶，北京瑞達恒輝科技發(fā)展有限公司；濃硫酸、二甲苯、酚酞、過氧化氫、無水乙醇，成都金山化學試劑。

1.2 儀器與設備

TOMY SX-700立式高壓蒸汽滅菌鍋：櫻美迪生物科技(上海)有限公司；SW-CJ-1F水平流潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；SPX-250-B-Z微生物恒溫培養(yǎng)箱：上海博訊實業(yè)有限公司；UV-5800PC紫外分光光度計：上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分離、純化

取5 g產(chǎn)品進行處理，利用梯度稀釋將濃度降到10～5。每個梯度于MRS瓊脂上涂覆，置于37 ℃培養(yǎng)24～48 h。從平板上選取具有不同特征的單個菌落，對其展開分離和純化，反復進行以上步驟，直至產(chǎn)生純菌落,然后將所得的單一菌株進行排序，甘油保藏[14]。

1.3.2 菌株的篩選

1.3.2.1 菌株自聚集實驗

參考SON等[15]的方法作適當修改，將乳酸菌菌株5 000 r/min，離心10 min收集，利用PBS緩沖液洗滌菌體2次，PBS緩沖液重懸菌體用測OD600并調(diào)至1.0，于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置2 h，取0.1 mL上層懸液加入1.9 mL的PBS中測定OD600。

1.3.2.2 乳酸菌胞外多糖的提取

根據(jù)劉滔[16]和陳東[17]的方法做了修改， 3%接種量接種于MRS中， 37 ℃發(fā)酵24 h，離心（5 000 r/min、25 min）取上清液，加入三氯乙酸使其濃度為4 %， 4 ℃靜置過夜，離心（5 000 r/min、20 min）取上清液，加入3倍體積無水乙醇， 4 ℃靜置過夜，離心（5 000 r/min、20 min）去上清液，用蒸餾水使其溶解，在4 ℃下透析2 d，冷凍干燥，稱重量。

1.3.3 菌株的鑒定

（1）乳酸菌的16S rDNA 基因序列測定

由專業(yè)公司測序，將測序后獲得的16S rDNA基因序列遞交美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫；使用搜索工具（BLAST）進行同源性比對，對序列一致性分析[18]。

（2）乳酸菌細胞形態(tài)觀察

將篩選出的3株乳酸菌培養(yǎng)24 h，隨后用革蘭氏染色法對目標細菌的形態(tài)進行觀察。

1.3.4 菌株的體外益生特性

1.3.4.1 DPPH自由基清除率的測定

吸取不同發(fā)酵時段的發(fā)酵上清液2 mL于10 mL試管中，每支試管加入2 mL 、2×10-4mol·L-1的DPPH溶液，將其振蕩均勻，在黑暗處放置30 min，取上清液，測定波長為517 nm的吸光度。實驗設空白組、對照組、實驗組[19-20]。

式中，A1是DPPH溶液與被測定的液體的吸光度；A2是無水酒精與被測定的溶液的吸光度；A0為DPPH溶液與無水酒精的吸光度值。

1.3.4.2 乳酸菌細胞表面疏水性的測定

利用BATH測定細胞表面疏水性：取菌液5 mL于離心管，離心（3 000 r/min 、10 min）收集菌體。用5 mL的PBS緩沖液清洗兩次，以 PBS緩沖液作空白對照，用其調(diào)節(jié)OD600為1.00 nm，取4 mL于離心管內(nèi)，添加二甲苯0.8 mL,對照組未添加，震蕩30 s后放置10 s,再次震蕩30 s，靜置10 min待分層。測水相測定OD600nm值[21]。

式中，A0是與二甲苯混合前菌液OD值；A是與二甲苯混勻后菌液 OD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離結(jié)果

從四川傳統(tǒng)的發(fā)酵食品樣品中，分離純化出大約40株的乳酸菌單菌落，其固體培養(yǎng)基的形態(tài)，菌株均為白色，形狀為圓形，且表面濕潤和凸起，可以明顯分辨為乳酸菌單個菌落。其中，由泡菜篩選的菌株編號為P1-25，臘肉編號為L1-15，分離到的乳酸菌均采用甘油進行菌株保藏，以備后續(xù)試驗。

2.2 菌株的篩選及鑒定

2.2.1 菌株的篩選

2.2.1.1 自聚集能力

采用整群隨機抽樣的方法，從某省某高校二年級學生中選取120名非英語專業(yè)大學生為調(diào)查對象。其中男生57名，女生63名。

對篩選的乳酸菌進行培養(yǎng)，形成單菌落，初步觀察其菌落形態(tài)后，選取菌落較大、黏稠的菌株，并進行自聚集能力測定，測定結(jié)果顯示自聚集率最高的10株乳酸菌，分別為P2、P6、P10、P12、P15、P16、P18、P19、L2、L6（如表1所示）。

表1 菌株自聚集能力表

2.2.1.2 高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的篩選

將2.2.1.1中所得的10株菌進行培養(yǎng)并提取胞外多糖后經(jīng)真空冷凍干燥，獲得的乳酸菌胞外多糖樣品顏色為淡黃色或乳白色，結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)疏松多孔的形態(tài)；對每株菌產(chǎn)生的EPS進行稱重，篩選出來的3株高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌菌株分別是P2、P6、P19（如表2所示）。

表2 菌株多糖產(chǎn)量表

2.2.2 菌株的鑒定

2.2.2.1 乳酸菌的16S rDNA 基因序列

將從四川傳統(tǒng)發(fā)酵食品中獲得的高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌送公司鑒定，結(jié)果如表3所示，分別為P2（Leuconostoc mesenteroides）、P6（Lactobacillus sakei）、P9（Weissella viridescens）。

表3 菌株16S rDNA的測序結(jié)果表

對3株高產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌進行革蘭氏染色，結(jié)果見圖1，所有的細菌都是革蘭氏陽性，并且細胞形態(tài)呈現(xiàn)長杄、短杄、棒狀、球狀、細長形，無分枝。

圖1 顯微鏡下菌株細胞形態(tài)圖

2.3 乳酸菌益生特性

2.3.1 乳酸菌DPPH自由基清除能力

用 DPPH自由基清除速率來評估乳桿菌的抗氧化性。如圖2所示，乳桿菌發(fā)酵液具有一定的抗氧化活性，數(shù)據(jù)顯示，在乳酸菌的發(fā)酵過程中，3株菌的DPPH自由基清除率均隨著時間的延長而增長，30 h后，P2和P6有降低趨勢，清除率最低的是P2；18 h前，P19的清除能力最強；18h后，P19和P6對DPPH自由基的清除能力相當。

圖2 乳酸菌DPPH自由基清除能力圖

2.3.2 乳酸菌菌株的表面疏水性

在益生菌的體外篩選過程中，菌體的疏水度反應了菌體在生物體內(nèi)的定殖能力。本研究分別對篩選到的乳酸菌菌株P(guān)2、P6、P19的表面疏水性進行測定，結(jié)果由表4可知，各種類型的乳酸菌對二甲苯具有不同的吸附量。其中，P19的疏水率大于90 %，對二甲苯有較好的吸附性；P2、P6兩種材料的疏水性均低于50%，對二甲苯的吸附性比較差。

表4 菌株表面疏水性測定結(jié)果表

3 討論

本研究從四川傳統(tǒng)的發(fā)酵食物泡菜和臘肉中分離出乳酸菌，并且進行篩選，篩選出的乳酸菌單菌落形狀與陳東[17]等篩選出的乳酸菌菌落特征一致，初步認定為乳酸菌。在此基礎上，本研究對所獲取的17株通過自聚集進行篩選，結(jié)果表明，這17株乳酸菌的自聚集能力較強，均在90 %以上，說明所篩選的乳酸菌可快速繁殖、自行聚集成團，這一結(jié)果與陳孝勇[22]等在牦牛酸乳中選擇出的乳酸菌結(jié)果相似。隨后，本研究對自聚集能力較強的菌株進行胞外多糖產(chǎn)量的測定，得到P2、P6、P19菌株，并運用16S rDNA鑒定菌株，二者16S rDNA序列同源性均大于97.5%，表明二者為同種，這與陳明霞[23]等的研究結(jié)果相似。本研究最終篩選出的3株菌在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST相似性對比。其中，P2為Leuconostoc mesenteroides、P6為Lactobacillus sakei、P19為Weissella viridescens。隨后將這3株乳酸菌進行革蘭氏染色并在顯微鏡下觀察，可以看見明顯的紫色，為革蘭氏陽性菌，形態(tài)觀察與16S rDNA鑒定結(jié)果一致。

乳酸菌的抗氧化能力能夠幫助機體維持相對穩(wěn)定的狀態(tài)，本研究表明，3株菌株的自由基清除能力均隨著發(fā)酵時間增加而增強，30 h后P2和P6有降低趨勢。由此可見，選擇適當?shù)陌l(fā)酵時間，對于提高乳酸菌的抗氧化能力具有重要作用。

菌體的疏水度反應了菌體在生物體內(nèi)的定殖能力，本研究中，P19的疏水率大于90 %，P2、P6兩種材料的疏水性均低于50%。國內(nèi)學者從四川傳統(tǒng)干酪中篩選得到乳酸菌菌株N-4的疏水性達21.37%，篩選的降膽固醇乳酸菌 ZG2YLu05疏水性為 46.82%[25-26]。與上述研究結(jié)果相比，3株菌的優(yōu)勢明顯，可見其具有明顯的腸道定殖潛力。

4 結(jié)語

本研究從四川傳統(tǒng)發(fā)酵食品中共分離篩選出3株高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌，分別是P2、P6、P19，其產(chǎn)量分別為0.140、0.124、0.128 g/L，鑒定為Leuconostoc mesenteroides、Lactobacillus sakei、Weissella viridescens。在益生特性評價中，P2的抗氧化能力較弱，但對DPPH自由基的清除能力最弱；P19和P6抗氧化能力較強，對DPPH自由基的清除能力18 h后相當，18 h前P19的清除能力最強。此外，3株菌的表面疏水性有所不同，其中，P19的疏水率高于90%，這表明3株菌有在腸道定殖的潛力。因此，本研究結(jié)果表明，3株菌均有開展益生性能與胞外多糖研究的價值，可以為后續(xù)探究奠定基礎。