微型頭戴式單光子熒光顯微成像技術(shù)研究進(jìn)展

付 強(qiáng)，張智淼，趙尚男，劉 洋，董 洋

（1.中國科學(xué)院長春光學(xué)精密機(jī)械與物理研究所, 吉林 長春 130033；2.中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049）

1 引 言

在過去的幾十年，神經(jīng)科學(xué)得到了巨大發(fā)展，其研究方式也發(fā)生了巨大轉(zhuǎn)變，腦科學(xué)研究進(jìn)入到了新時代[1]。隨著鈣熒光指示劑的出現(xiàn)和不斷發(fā)展，研究人員能夠使用光學(xué)顯微鏡來直接觀察生物體內(nèi)的神經(jīng)活動[2-5]。腦成像技術(shù)為人類了解大腦的功能以及研究各種神經(jīng)疾病對大腦功能的影響及破壞提供了前所未有的幫助。但是，過去光學(xué)神經(jīng)成像通常使用笨重的臺式光學(xué)顯微鏡，這種顯微鏡體積龐大，需要對動物進(jìn)行麻醉或固定頭部，限制了能夠進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)類型。近年來隨著微型光學(xué)元件和電子設(shè)備的發(fā)展，光學(xué)神經(jīng)成像設(shè)備逐漸從臺式平臺向“頭戴式”平臺轉(zhuǎn)變[6]。

微型頭戴式熒光顯微鏡能夠以較高的分辨率對自由移動的動物大腦中的神經(jīng)活動進(jìn)行觀測[7]，既可以通過顱骨開窗對大腦皮層的神經(jīng)活動進(jìn)行成像，也可以通過結(jié)合梯度折射率（Gradient Index，GRIN）透鏡（將光學(xué)圖像從一端中繼到另一端）對大腦深部的神經(jīng)活動進(jìn)行成像，迅速增強(qiáng)了對大腦如何工作的理解。目前，微型頭戴式熒光顯微鏡的主流方案是基于單光子熒光成像的微型顯微鏡和基于雙光子熒光成像的微型顯微鏡。對于單光子熒光成像，熒光染料中的電子吸收激發(fā)光中的一個光子被激發(fā)到高能級，然后當(dāng)電子從高能級向低能級躍遷時會發(fā)出一個比激發(fā)光波長更長的光子。單光子熒光效應(yīng)比較容易發(fā)生，使用LED 作為激發(fā)光源提供寬場照明就能夠得到生物成像所需的熒光信號，系統(tǒng)構(gòu)建更加容易。但是寬場照明產(chǎn)生的離焦熒光會對成像質(zhì)量造成影響，并且由于激發(fā)光的波長相對較短，光束散射效應(yīng)也比較明顯。所以微型單光子熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)是成像視場更大、幀頻更高、成本更低、更易于組裝和維護(hù)，且允許動物有更加自由的運(yùn)動行為。其缺點(diǎn)是穿透深度小，軸向分辨率低，圖像的對比度也比較低。

對于雙光子熒光成像，熒光染料中的電子需要吸收激發(fā)光中的兩個光子被激發(fā)到高能級，然后當(dāng)電子從高能級向低能級躍遷時會發(fā)出一個比激發(fā)光波長短的光子。因此，與單光子熒光成像相比，雙光子熒光成像可以使用約二倍波長的光來提供激發(fā)光，光束的散射程度更低。但是雙光子熒光效應(yīng)發(fā)生的概率極低，需要使用峰值功率極高的飛秒激光作為光源，并且僅在激光束焦點(diǎn)處才能得到生物成像所需的熒光信號，因此需要進(jìn)行逐點(diǎn)掃描成像，這無疑會增加系統(tǒng)構(gòu)建的成本，但是這也避免了離焦熒光的影響，成像質(zhì)量更高。所以微型雙光子熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)是穿透深度更大，軸向和橫向分辨率更高，例如北京大學(xué)陳良怡、宗偉健等人[8]在2017 年報道的微型雙光子熒光顯微鏡的橫向分辨率為0.65 μm，軸向分辨率為3.3 μm。其缺點(diǎn)是系統(tǒng)構(gòu)建更加復(fù)雜，需要昂貴的近紅外飛秒激光器來提供激發(fā)光，并且還需要使用較粗的光纖束進(jìn)行圖像傳輸，對動物的行為會造成一定的影響。

從目前的期刊文獻(xiàn)和商業(yè)報道上看，由于微型單光子熒光顯微鏡更容易實(shí)現(xiàn)和性價比更高的特點(diǎn)，使其成為主流。近年來，微型單光子熒光顯微鏡技術(shù)日趨成熟，不僅有一些開源項(xiàng)目推動該領(lǐng)域的發(fā)展，還有Inscopix、Doric 等商業(yè)公司提供完整的解決方案。因此使用微型單光子熒光顯微鏡對活體動物的神經(jīng)活動進(jìn)行成像已經(jīng)成為了一種新興的趨勢，越來越受到腦科學(xué)研究者的歡迎，已經(jīng)被應(yīng)用到了神經(jīng)科學(xué)研究的各個研究領(lǐng)域。

本文簡要回顧了光學(xué)神經(jīng)成像的發(fā)展歷史，然后將目前報道的微型頭戴式單光子熒光顯微鏡分為小視場系統(tǒng)（Field of View，F(xiàn)OV<1mm）和大視場系統(tǒng)（FOV>7mm），對他們使用的光學(xué)系統(tǒng)方案進(jìn)行介紹，并分析其優(yōu)缺點(diǎn)。最后，對微型頭戴式單光子熒光顯微鏡目前的發(fā)展現(xiàn)狀進(jìn)行總結(jié)，對未來的發(fā)展趨勢進(jìn)行展望。

2 小視場微型單光子熒光顯微鏡

小視場微型單光子熒光顯微鏡（FOV<1mm）在近些年得到了巨大發(fā)展，技術(shù)日趨成熟，研究人員在設(shè)計滿足熒光成像的基本功能之上，還加入了很多其他功能，例如：加入無線功能以解除電線對動物行為的限制；利用三維成像解決單光子熒光成像穿透深度小的問題；開發(fā)雙區(qū)域成像功能實(shí)現(xiàn)同時對兩個腦區(qū)進(jìn)行成像；加入雙色/多色成像功能解決對不同神經(jīng)細(xì)胞群同時進(jìn)行成像的問題。

2.1 具有基本熒光成像功能的微型熒光顯微鏡

2011 年，Ghosh 等人對微型熒光顯微鏡的發(fā)展做出了里程碑式的工作[9]，開發(fā)出了第一個完全集成的微型頭戴式熒光顯微鏡，總重量僅為1.9 g，體積為2.4 cm3，如圖1（a）所示。該顯微鏡由光學(xué)系統(tǒng)、照明LED、CMOS 探測器、結(jié)構(gòu)外殼和電子線路組成。光學(xué)系統(tǒng)極為簡單，物鏡僅是一片GRIN 透鏡，管鏡為一片消色差雙膠合透鏡。照明光由LED 發(fā)出，經(jīng)過收集透鏡、激發(fā)濾光片、二向色鏡和物鏡后，照明神經(jīng)細(xì)胞；激發(fā)的熒光經(jīng)物鏡、二向色鏡、發(fā)射濾光片和管鏡成像在CMOS 上。該系統(tǒng)的成像質(zhì)量完全能與臺式顯微鏡相媲美，光學(xué)性能數(shù)據(jù)見表1[11-14]。

圖1 具有基本成像功能的系統(tǒng)。（a）Ghosh 等人的集成顯微鏡的橫截面圖[10]；（b）MiniScope V3 的分解圖; （c）戴著微型顯微鏡的小鼠示意圖[14]；（d）小鼠大腦中神經(jīng)元活動的熒光圖像[14]Fig.1 A system with a basic imaging function.(a) Cross sectional view of integrated microscope proposed by Ghosh et al; (b)exploded view of the MiniScope V3; (c) a schematic of a mouse wearing a miniature microscope; (d) fluorescent images of neural activity in a mouse brain

2016 年，Cai 等人在Ghosh 等人[9]工作的基礎(chǔ)上，設(shè)計了一款名為MiniScope V3[10]的微型顯微鏡，重約3 g，如圖1（b）所示。光學(xué)系統(tǒng)采用和Ghosh 等人相同的方案，具體數(shù)據(jù)見表1。Mini-Scope V3 是非常有代表性的微型熒光顯微鏡，其特點(diǎn)在于所有設(shè)計資料全部開源，并提供詳細(xì)的設(shè)計文檔、零件采購教程、組裝和實(shí)驗(yàn)應(yīng)用指南等，極大地方便了研究人員的使用，目前已經(jīng)被全世界幾百家實(shí)驗(yàn)室使用并應(yīng)用到神經(jīng)科學(xué)的研究中[11]。

2016 年，Barbera 等人設(shè)計了一款微型顯微鏡miniscope[12]，重約2.4 g，圖1（c）所示為戴著微型顯微鏡的小鼠示意圖。在光學(xué)系統(tǒng)部分，物鏡僅使用了一片直徑為4 mm 的非球面透鏡，并與中繼GRIN 透鏡結(jié)合來對小鼠的深腦區(qū)成像，CMOS 圖像傳感器拍攝到的小鼠大腦中神經(jīng)活動的圖片如圖1（d）所示。miniscope 的特點(diǎn)在于獲得同等單細(xì)胞分辨率的情況下視場比上述系統(tǒng)大1 倍，光學(xué)系統(tǒng)具體數(shù)據(jù)見表1。2018 年，他們詳細(xì)介紹了miniscope 的設(shè)計和組裝過程、GRIN透鏡植入小鼠腦中的手術(shù)過程、微型顯微鏡安裝在小鼠頭部的過程以及數(shù)據(jù)的采集和分析方法[13-14]。

2018 年， Jacob 等人設(shè)計并開源了一款微型顯微鏡CHEndoscope[15]，重約4.5g。光學(xué)系統(tǒng)采用和Ghosh 等人相同的方案，具體數(shù)據(jù)見表1。其特點(diǎn)在于：使用了3D 打印的顯微鏡外殼和集成相機(jī)模塊，方便顯微鏡的組裝與調(diào)試，非常適合喜歡使用現(xiàn)成組件的研究人員。

2020 年，Bagramyan 等人設(shè)計了一款重量僅為1.3 g 的微型顯微鏡[16]，是目前正式見刊的重量最輕的系統(tǒng)。物鏡由直徑僅為0.5 mm 的GRIN透鏡和中繼GRIN 透鏡組成；管鏡為一片平凸透鏡。這款顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)在于重量輕，且使用小直徑的GRIN 透鏡在植入動物大腦時對組織的損傷更小，缺點(diǎn)在于成像視場很?。▋H為105 μm），明顯低于現(xiàn)有的其他系統(tǒng)，光學(xué)性能數(shù)據(jù)見表1。

2.2 具有無線功能的微型熒光顯微鏡

2017 年，Liberti 等人設(shè)計并開源了一款無線微型顯微鏡FinchScope[17-19]，重約1.8 g，如圖2（a）所示。其特點(diǎn)是無線功能可選，選擇無線功能僅需要增加一塊重約0.6 g 的無線發(fā)射機(jī)和鋰聚合物電池。成像光路設(shè)計基于 Ghosh 等人先前描述的光路，具體數(shù)據(jù)見表2。FinchScope 是一款專門用于監(jiān)測斑馬雀在唱求偶歌時神經(jīng)活動的系統(tǒng)[20]，可以在進(jìn)行神經(jīng)成像時同步記錄聲音。

表2 具有無線功能的微型熒光顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光學(xué)性能參數(shù)Tab.2 Optical system and optical performance parameters of a miniature fluorescence microscope with wireless function

圖2 具有無線功能的系統(tǒng)。（a）FinchScope 的橫截面圖[19]；（b）無線miniscope 的內(nèi)部光學(xué)元件布局圖[22]Fig.2 A system with wiress function.(a) Cross sectional view of FinchScope; (b) internal optics element layout of wireless miniscope

2019 年，Shuman 等人設(shè)計并開源了一款無線微型顯微鏡Wire-free MiniScope[21]，重量為4～5 g。顯微鏡設(shè)計基于MiniScope V3[10]，二者的光學(xué)系統(tǒng)完全相同，具體數(shù)據(jù)見表2。但為了實(shí)現(xiàn)無線記錄，對電路部分進(jìn)行了重新設(shè)計，更換了一個重量更輕、功耗更低的CMOS 圖像傳感器，并加入了SD 卡（Secure Digital Memory Card）存儲CMOS 圖像傳感器輸出的數(shù)據(jù)。

2019 年，Barbera 等人在他們先前設(shè)計的有線版本基礎(chǔ)上[12]為系統(tǒng)加入了無線功能[22]，重約3.9 g，如圖2（b）所示。無線miniscope 與之前的有線版本相比，光學(xué)系統(tǒng)完全相同，具體數(shù)據(jù)見表2。為了實(shí)現(xiàn)無線記錄，無線miniscope 中加入了SD 卡用以記錄CMOS 圖像傳感器輸出的數(shù)據(jù)，并使用電池背包為系統(tǒng)供電。通過這些改進(jìn)解除了電線對動物行為的影響，可以同時對多個動物進(jìn)行記錄，研究動物在群居條件下的更復(fù)雜行為。

2023 年，Wang 等人設(shè)計了一款具有無線圖像傳輸功能的微型顯微鏡wScope[23]，重2.7 g。光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計基于MiniScope V3，具體數(shù)據(jù)見表2。wScope 與之前報道的使用SD 卡實(shí)現(xiàn)無線記錄的系統(tǒng)相比有巨大優(yōu)勢，不僅可以在記錄的過程中實(shí)時查看和記錄圖像，而且還能在實(shí)驗(yàn)過程中修改顯微鏡的參數(shù)。

2.3 具有三維成像功能的微型熒光顯微鏡

2018 年，Skocek 等人設(shè)計了一款具有三維成像功能的微型顯微鏡MiniLFM[24]，重量為4.7g，如圖3（a）所示。光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計基于MiniScope V3，具體數(shù)據(jù)見表3。為了實(shí)現(xiàn)三維成像，他們在原本的像平面處放置了一個微透鏡陣列（Microlens Array，MLA），將頭戴式顯微鏡技術(shù)與光場顯微鏡[25]（Light Field Microscope，LFM）技術(shù)和約 束 矩 陣 分 解 技 術(shù)（Seeded Iterative Demixing，SID）[26]結(jié)合使用，從而使二維圖像傳感器在單次曝光中能捕獲到三維體積信息。

表3 具有三維成像功能的微型熒光顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光學(xué)性能參數(shù)Tab.3 Optical system and optical performance parameters of the miniature fluorescence microscope with 3D imaging functionality

圖3 具有三維成像功能的系統(tǒng)。（a）MiniLFM 的橫截面圖[24]；（b）Miniscope3D 的橫截面圖[27];（c）Bagramyan 等人的顯微鏡橫截面圖[28]；（d）SIMscope3D 的橫截面圖[29]Fig.3 A system with 3D imaging functionality.(a) Cross sectional view of MiniLFM; (b) cross sectional view of Miniscope3D;(c) microscope cross section by Bagramyan et al; (d) cross sectional view of SIMscope3D

2020 年，Yanny 等人設(shè)計了一款具有三維成像功能的微型顯微鏡Miniscope3D[27]，重約2.5g。顯微鏡設(shè)計基于MiniScope V3，具體數(shù)據(jù)見表3。為了實(shí)現(xiàn)三維成像，在物鏡光闌處放置了一個相位掩模板，可以將三維樣本中的每個點(diǎn)在傳感器上生成獨(dú)特的高頻模式，從而可以在單次二維成像中編碼體積信息，如圖3（b）所示。相比于MiniLFM[24]，Miniscope3D 使用了新的硬件方案和圖像重建算法，在更大的成像視場上實(shí)現(xiàn)了高一倍的分辨率。

2021 年，Bagramyan 等人在他們先前報道的系統(tǒng)基礎(chǔ)上[16]，又設(shè)計了一款具有三維成像功能的系統(tǒng)[28]，重量僅為1.4g，如圖3（c）所示。光學(xué)系統(tǒng)與先前的設(shè)計基本相同，具體數(shù)據(jù)見表3。為了實(shí)現(xiàn)三維成像，他們在物鏡后面放置了一片可調(diào)諧液晶透鏡（Tunable Liquid Crystal Lens，TLCL）進(jìn)行軸向掃描成像。TLCL 是由他們自己設(shè)計定制的，重量僅為0.1g，直徑僅為0.5mm，可實(shí)現(xiàn)98μm 的深度調(diào)節(jié)。

2022 年，Supekar 等人設(shè)計了一款使用結(jié)構(gòu)光照明的具有三維成像功能的微型顯微鏡SIMscope3D[29]，重6.7g，如圖3（d）所示。為了實(shí)現(xiàn)高分辨率三維成像，他們首次將結(jié)構(gòu)光照明引入到了微型顯微鏡的設(shè)計中，消除了離焦熒光和散射光對成像的影響，然后結(jié)合電濕潤透鏡（Electrowetting Lens，EWL）進(jìn)行軸向掃描來實(shí)現(xiàn)三維成像。但是結(jié)構(gòu)光照明的范圍比較小，導(dǎo)致系統(tǒng)成像視場比較小（僅為207 μm），明顯低于現(xiàn)有的其他系統(tǒng)，具體數(shù)據(jù)見表3。

2.4 具有雙區(qū)域成像功能的微型熒光顯微鏡

2019 年，Gonzalez 等人設(shè)計了一款能夠?qū)π∈蟠竽X進(jìn)行雙區(qū)域成像的微型顯微鏡[30]。光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計基于Ghosh[9]等人的工作，具體數(shù)據(jù)見表4。外殼部分設(shè)計基于MiniScope V3[10]，電路部分設(shè)計基于FinchScope[17-19]，但是他們進(jìn)行了優(yōu)化設(shè)計，最終使顯微鏡的重量足夠輕且體積足夠小，可以在一只小鼠頭上同時安裝兩個進(jìn)行雙區(qū)域成像。

表4 具有雙區(qū)域成像功能的微型熒光顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光學(xué)性能參數(shù)Tab.4 Optical system and optical performance parameters of a miniature fluorescence microscope with dual region imaging functionality

2020 年，de Groot 等人設(shè)計開源了一款微型顯微鏡NINscope[31]，重1.6 g，如圖4（a）所示。光學(xué)性能數(shù)據(jù)見表4。與其他系統(tǒng)相比，NINscope重量輕、體積小，允許在一只小鼠的頭上安裝兩個，對不同大腦區(qū)域同時進(jìn)行成像，如圖4（b）所示。

圖4 具有雙區(qū)域成像功能的系統(tǒng)。（a） NINscope 的主體和內(nèi)部光學(xué)元件布局圖[31]；（b）一只安裝了兩個NINscope 的小鼠[31]Fig.4 A system with dual region imaging functionality.(a)NINscope body and internal optics element layout;(b) a mouse with two NINscopes mounted

2.5 具有雙色成像功能的微型熒光顯微鏡

2020 年，加州大學(xué)洛杉磯分校發(fā)布了新一代開源的微型顯微鏡MiniScope V4[32-33]，重量僅為2.6 g，如圖5（a）所示。光學(xué)系統(tǒng)的物鏡模塊使用了兩片消色差雙膠合透鏡，管鏡使用了一片消色差雙膠合透鏡，消除了色差引起的焦點(diǎn)偏移，可以進(jìn)行雙色熒光成像[34]，具體數(shù)據(jù)見表5。與上一代MiniScope V3[10]相比，重量更輕、視場更大，還加入了電濕潤透鏡，可以實(shí)現(xiàn)200 μm 焦距的電動調(diào)節(jié)。

表5 具有雙色成像功能的微型熒光顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光學(xué)性能參數(shù)Tab.5 Optical system and optical performance parameters of a miniature fluorescence microscope with two-color imaging functionality

圖5 具有雙色成像功能的系統(tǒng)。（a）MiniScope V4 的橫截 面 圖；（b）DCFIMM-SBI 的 橫 截 面 圖[35]；（c）DCFIMM-DBI 的橫截面圖[35]Fig.5 A system with two-color imaging functionality.(a)Cross sectional view of MiniScope V4; (b) cross sectional view of DCFIMM-SBI; (c) cross sectional view of DCFIMM-DBI

2022 年，藍(lán)凱秋等人設(shè)計了一款具有雙色成像功能的微型顯微鏡[35]，重量為6.2 g。為了實(shí)現(xiàn)雙色成像，必須要校正色散引起的焦移，因此在光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計上采用了全消色差光學(xué)元件。同時，為了對不同的大腦區(qū)域進(jìn)行成像，分別設(shè)計了如圖5（b）所示的用于大腦表層成像的光學(xué)系統(tǒng)DCFIMM-SBI（Superficial Brain Imaging，SBI），和如圖5（c）所示的用于大腦深層成像的光學(xué)系統(tǒng)DCFIMM-DBI（Deep Brain Imaging，DBI），具體數(shù)據(jù)見表5。

2.6 小 結(jié)

本節(jié)對目前報道的小視場微型單光子熒光顯微鏡進(jìn)行了詳細(xì)介紹，現(xiàn)將其光學(xué)系統(tǒng)和光學(xué)性能歸納到下表6。

表6 小視場微型單光子熒光顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)組成和光學(xué)性能參數(shù)Tab.6 Optical system composition and optical performance parameters of miniature single photon fluorescence microscope with a small field

從表6 可以看到，小視場微型單光子熒光顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計方案基本統(tǒng)一。

對于物鏡基本都使用GRIN 透鏡，使用GRIN透鏡作為物鏡的優(yōu)勢如下：

（1）GRIN 透鏡具有比球面透鏡更輕的質(zhì)量和更高的光學(xué)性能，僅用一片GRIN 透鏡就能在較高的數(shù)值孔徑（NA=0.5）下獲得很好的成像質(zhì)量。

（2）圓柱狀的GRIN 透鏡外形小巧，底部平坦，可以在較小損傷的條件下植入實(shí)驗(yàn)動物的大腦，更有利于實(shí)驗(yàn)動物的健康。

使用GRIN 透鏡作為物鏡的主要缺點(diǎn)為：

（1）GRIN 透鏡無法校正色差，只能應(yīng)用在單色熒光成像系統(tǒng)中。對于雙色熒光成像系統(tǒng)，需要使用消色差光學(xué)透鏡組進(jìn)行系統(tǒng)設(shè)計[35]。

（2）GRIN 透鏡的成像視場比較小，只能對光軸附近的光線良好成像。對軸外物點(diǎn)成像時像差很大且難以校正，所以用GRIN 透鏡作為物鏡的系統(tǒng)視場通常小于1 mm。

當(dāng)視場需求進(jìn)一步增加時，有些系統(tǒng)使用了非球透鏡作為物鏡，但是仍需要與GRIN 透鏡結(jié)合使用。當(dāng)需要雙色成像時，雙膠合透鏡得到應(yīng)用。

對于管鏡，基本都使用消色差雙膠合透鏡，消除了色差對成像質(zhì)量的影響。但是也有幾個對重量控制比較嚴(yán)格的系統(tǒng)，沒有校正色差，僅使用一片平凸透鏡。

3 大視場微型單光子熒光顯微鏡

大視場微型單光子熒光顯微鏡（FOV>7mm）可以對小鼠的整個大腦皮層的神經(jīng)活動進(jìn)行觀測，能進(jìn)一步了解各腦區(qū)間的相互作用關(guān)系，這對“打破神經(jīng)密碼”，即破譯神經(jīng)系統(tǒng)編碼、存儲、處理信息的方式有很大的幫助。但要想實(shí)現(xiàn)大視場，需要復(fù)雜的光學(xué)設(shè)計和光學(xué)裝調(diào)技術(shù)，目前研究的還很少，只有少數(shù)的幾篇文章報道了他們的設(shè)計，下面將分別進(jìn)行介紹。

3.1 現(xiàn)有的大視場系統(tǒng)

2018 年，Scott 等人設(shè)計開源了一款微型顯微鏡cScope[36]，重量為33 g。光學(xué)系統(tǒng)布局如圖6（a）所示，光學(xué)性能數(shù)據(jù)見表7。cScope 提供了超大的視場，可以同時對實(shí)驗(yàn)動物多個大腦區(qū)域進(jìn)行觀測，但是由于光學(xué)系統(tǒng)使用了現(xiàn)成的商用透鏡，導(dǎo)致系統(tǒng)設(shè)計比較復(fù)雜，整體重量比較大。

表7 大視場微型熒光顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光學(xué)性能參數(shù)Tab.7 Optical system and optical performance parameters of a large field miniature fluorescence microscope

圖6 現(xiàn)有的大視場系統(tǒng)。（a）cScope 的成像路徑光路圖[36]；（b）CM2 的成像路徑光路圖[37]；（c）完全組裝的mScope[46]Fig.6 Existing large filed of view system.(a) Imaging optical path of cScope; (b) imaging optical path of CM2; (c) fully assembled mScope

2020 年，Xue 等人[37]利用計算成像技術(shù)設(shè)計了一款微型顯微鏡CM2，重19 g。光學(xué)系統(tǒng)如圖6（b）所示，僅使用一片微透鏡陣列（MLA）作為成像元件，擺脫了傳統(tǒng)微型顯微鏡的物鏡或GRIN透鏡對視場的限制，具體數(shù)據(jù)見表7。CM2成像方法結(jié)合了集成成像[38-39]、光場顯微鏡[40-42]、復(fù)眼成像[43]、陣列顯微鏡[44]和孔徑編碼成像[45]的思想。其工作原理是首先使用MLA 收集單個二維測量值，然后基于點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（PSF）計算重建圖像。

2021 年，Rynes 等人設(shè)計了一款具有超大視場的微型顯微鏡mScope[46]，如圖6（c）所示，重量僅為3.8g。mScope 的光學(xué)系統(tǒng)極為簡單，僅使用一片雙凸透鏡進(jìn)行成像，具體數(shù)據(jù)見表7。mScope以很輕的重量實(shí)現(xiàn)了超大的視場，但是犧牲了系統(tǒng)的分辨率，最終系統(tǒng)分辨率只有幾十微米。

3.2 小 結(jié)

本節(jié)對目前報道的大視場系統(tǒng)進(jìn)行了詳細(xì)介紹，從中可以看到，目前對大視場微型單光子熒光顯微鏡的研究還很少，技術(shù)還不是很成熟。成像質(zhì)量相對較差，無法分辨單個神經(jīng)元，且系統(tǒng)的重量比較大，對動物的自由活動造成了一定的限制。雖然計算成像技術(shù)可以在獲得較高分辨率的同時保持比較輕的重量，但是計算成像對于活體動物體內(nèi)這種密集、低對比度的場景進(jìn)行圖像重建難度很大，事實(shí)上目前還沒實(shí)驗(yàn)證明這種技術(shù)在活體動物體內(nèi)有效。所以目前大視場微型單光子熒光顯微鏡的研究還處于起始階段，在未來還有很大的發(fā)展空間。

4 總結(jié)與展望

本文對目前報道的微型單光子熒光顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光學(xué)性能進(jìn)行了詳細(xì)介紹，可以看到，Ghosh 等人[9]做出的開創(chuàng)性工作為微型單光子熒光顯微鏡的發(fā)展奠定了重要基礎(chǔ)，后面有許多研究人員都根據(jù)Ghosh 等人的工作，做出了自己的設(shè)計。最為著名的是MiniScope V3[10]，因?yàn)镸ini-Scope V3 是開源的，提供了詳細(xì)的設(shè)計文件和參考指南。除此之外還有miniscope[12-14]、CHEndoscope[15]和Finchscope[17-19]等開源項(xiàng)目，它們的出現(xiàn)為微型單光子熒光顯微鏡的發(fā)展起到了巨大的推動作用。不僅成像視場從幾百微米發(fā)展到幾毫米，而且還加入了如無線記錄、三維成像、雙區(qū)域成像和雙色成像等功能。然而，面向未來的發(fā)展與應(yīng)用，微型單光子顯微鏡還有需要改進(jìn)的地方，下面介紹幾個發(fā)展方向：

（1）大視場高分辨率成像。以單細(xì)胞分辨率對半腦區(qū)或全腦區(qū)進(jìn)行高分辨率成像有助于進(jìn)一步了解大腦產(chǎn)生行為或心理狀態(tài)的原因。但是由于視場的增加，離軸像差對像質(zhì)影響嚴(yán)重。光學(xué)系統(tǒng)采用簡單的雙膠合和單片非球面透鏡已不能很好地校正像差，需要增加元件的數(shù)量和非球面的數(shù)量。但此時又會導(dǎo)致體積和重量的增加。為解決上述情況，類似手機(jī)鏡頭里的塑料鏡片方案提供了可行性。

（2）基于超構(gòu)透鏡的超輕微型熒光顯微鏡。超構(gòu)透鏡（Metalens）是一種二維平面透鏡結(jié)構(gòu)，是由超構(gòu)表面（具有亞波長厚度的平面二維超材料）制成的光學(xué)元件，利用納米結(jié)構(gòu)對入射光進(jìn)行聚焦成像。與傳統(tǒng)光學(xué)透鏡相比，超構(gòu)透鏡擁有體積更小、重量更輕、成本更低、成像更好、更易集成等優(yōu)點(diǎn)，為緊湊集成的光學(xué)系統(tǒng)提供了潛在的解決方案。將超構(gòu)透鏡應(yīng)用到熒光顯微鏡上，可以在NA 更大的條件下實(shí)現(xiàn)較大視場成像，物鏡僅為1 片，整機(jī)重量有望更輕。