小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的T細(xì)胞應(yīng)答在大鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎中的致病作用

周翔魚,李 娜,王 佳,儲(chǔ)晨晨,祁莉鳳,楊世勝,華 冰, 曹羿堃

多發(fā)性硬化(MS)是一種由炎癥所致的自身免疫性疾病,可導(dǎo)致脫髓鞘和神經(jīng)退行性病變［1-3］。目前多發(fā)性硬化(MS)的病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確,實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)由于具有多發(fā)性硬化的許多臨床、組織病理學(xué)和免疫學(xué)特征,是一種公認(rèn)的多發(fā)性硬化動(dòng)物模型［4-5］。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)常駐單核細(xì)胞,也是抗原提呈細(xì)胞(APCs),可以向M1樣和M2樣巨噬細(xì)胞極化。M1樣巨噬細(xì)胞通過(guò)提高Ⅱ類MHC分子和共刺激分子CD80/CD86等表達(dá)達(dá)到將外源性抗原呈遞激活CD4+T細(xì)胞促炎的作用［6-8］。同時(shí)作為有核細(xì)胞,也可以經(jīng)MHC I類分子途徑呈遞內(nèi)源性抗原誘導(dǎo)CTL應(yīng)答而參與EAE/MS。對(duì)于MS/EAE而言,如何在長(zhǎng)期缺乏外源性抗原刺激下維持以時(shí)間-空間多發(fā)性為特征的慢性病理過(guò)程是關(guān)鍵問題,其本質(zhì)是髓鞘損傷與修復(fù)之間的平衡不斷被打破后形成傾向于損傷程度加重的一種新的平衡狀態(tài)［6-7］。因此,小膠質(zhì)細(xì)胞的極化方向和MHC分子表達(dá)類型決定了EAE/MS中CNS免疫應(yīng)答模式。本研究旨在量化維持CNS炎癥的小膠質(zhì)細(xì)胞、T細(xì)胞亞群之間的相互效應(yīng)關(guān)系,以期部分解釋這種慢性CNS自身免疫疾病時(shí)間-空間多發(fā)性產(chǎn)生的原因。

1 資料與方法

1.1 試劑與儀器:透射電子顯微鏡(泰思肯貿(mào)易有限公司,中國(guó));Novocyte流式細(xì)胞儀(ACEA,中國(guó));熒光顯微鏡(Zeiss公司,德國(guó));熒光定量 PCR 儀(Bio-Rad 公司,美國(guó));百日咳毒素(PTX);人工合成的鼠源性髓鞘堿性蛋白(MBP68-86)(純度>95%,Eurogentec);完全弗氏佐劑(CFA,美國(guó)Sigma公司);anti-MHCI(美國(guó)Novus Biologicals 公司)、anti-MHCII(英國(guó)Abcam公司);CD3-APC(美國(guó)BD-Pharmen公司)、CD4-PE(美國(guó)BD-Pharmen公司) 、CD8-Percp(美國(guó)BD-Pharmen公司)、CD206-PE-Cy5(美國(guó)BD-Pharmen公司)、CD86-PE(英國(guó)Biorbyt公司);FcgR2B抗體(美國(guó)CUSABIO公司);TGF-β抗體(英國(guó)Abcam公司);IL-10抗體(英國(guó)Abcam公司);anti-IBAI (英國(guó)Abcam公司);HRP-conjugated anti-rabbit or anti-mouse(美國(guó)Abbkine公司);ECL試劑盒(荷蘭KeyGEN公司);BCA定量試劑盒(美國(guó)Sigma公司)。

1.2 EAE模型的制備:采用6～8周齡雌性Lewis大鼠(購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)公司),體重(150±10)g。溫度維持在20～25 ℃、光照周期24 h、相對(duì)濕度40%～60%的可控環(huán)境中飼養(yǎng)一周。將大鼠按照體重隨機(jī)分為兩組,正常對(duì)照組(n=10)與EAE模型組(n=30)。用無(wú)菌水溶解MBP粉末配成濃度為5mg/mL的溶液,用生理鹽水稀釋溶解后的MBP與含有1mg/mL結(jié)核桿菌的CFA按1∶1制成油包乳劑。將配成500 μg/mL/支的MBP溶液在側(cè)腦室注射12 μL,并于脊柱兩側(cè)四點(diǎn)通過(guò)皮下注射200 μL MBP抗原肽與CFA的乳化劑,腹腔注射200 μL濃度為2.5 μg/mL的PTX。注射當(dāng)天為第0 d,48 h后再通過(guò)腹腔注射相同劑量的PTX2.7 mg/kg。MBP68-86多肽氨基酸殘基序列為YGSLPQKSQRSQDENPV。

1.3 透射電子顯微鏡觀察腦組織超微結(jié)構(gòu)變化:在發(fā)病高峰期將2組各3只大鼠安樂死,生理鹽水左心室灌注沖洗后取腦組織置于3%戊二醛中固定,隨后取1 mm×1 mm×1 mm大鼠腦胼胝體后部組織于3%戊二醛4 ℃固定2 h,用0.1 mol/L 二甲砷酸鈉緩沖液洗滌3次,每次2h,1%鋨酸浸泡2 h,0.1 moL/L 二甲砷酸鈉緩沖液沖洗2次,每次15 min。按照以下步驟進(jìn)行脫水,4 ℃、30%酒精、10 min,50%酒精、10 min,70%酒精、10 min、室溫,80%酒精、10 min,90%酒精、10 min,100%酒精、15 min兩次,環(huán)氧丙烷滲透15 min、兩次,1∶1(環(huán)氧丙烷不完全包埋)滲透、1 h,2∶1(環(huán)氧丙烷不完全包埋)、1 h,完全包埋液滲透、過(guò)夜。然后進(jìn)行包埋,完全包埋液浸泡,35 ℃溫箱 6 h,轉(zhuǎn)移至包埋板(完全包埋液),42 ℃溫箱過(guò)夜,60 ℃溫箱48 h。透射電子顯微鏡下觀察腦組織超微結(jié)構(gòu)變化。

1.4 免疫熒光:分離實(shí)驗(yàn)動(dòng)物脾臟組織和腦組織,4%多聚甲醛固定20 min,0.3% Triton-X-100通透30 min,1%BSA封閉1 h,用anti-MHCI、anti-IBAI、anti-MHCII、anti-CD4和anti-CD8孵育過(guò)夜,隔天用抗小鼠IgG綠色熒光和抗兔鼠IgG紅色熒光避光孵育1 h,DAPI染細(xì)胞核10 min,用熒光顯微鏡進(jìn)行拍照分析。

1.5 流式細(xì)胞術(shù):在發(fā)病高峰期采集兩組大鼠的外周血加入到流式管中每管50 μL,加入適當(dāng)比例CD3-APC、CD4-PE 、CD8-Percp 4 ℃抗體避光孵育30 min,300 μL溶血素孵育10 min,最后加300 μL PBS上機(jī)。將分離得到的腦組織單個(gè)核細(xì)胞混懸液1×106個(gè)細(xì)胞［9］加入流式管中,CD86-PE和CD206-PE-Cy5抗體孵育30 min,350×g離心5 min,加300 μL PBS洗滌兩次后置Novocyte流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)后分析。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法:將分離的腦組織單個(gè)核細(xì)胞［9］用RIPA裂解液裂解后通過(guò)BCA試劑盒定量。8%～12%的凝膠分離蛋白樣品后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5%BSA封閉1～2 h。在4℃孵育一抗anti-MHCI、anti-MHCII、FcgR2B抗體、TGF-β抗體和IL-10抗體過(guò)夜。隔天用HRP-conjugated anti-rabbit or anti-mouse二抗孵育1 h。ECL試劑盒檢測(cè)膜上的特異性抗體。

1.7 逆轉(zhuǎn)錄定量PCR:使用Trizol從兩組大鼠腦組織中提取總RNA。根據(jù)Aidlab 公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作合成cDNA,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為42 ℃ 40 min、65 ℃ 10 min。根據(jù)SYBR Premix ExTaq TM試劑盒說(shuō)明書將合成的cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng),反應(yīng)體系10 μL,反應(yīng)條件為95 ℃ 3 min、 95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s(循環(huán)39次),對(duì)每個(gè)樣板進(jìn)行3次平衡檢測(cè),取平均值為最終結(jié)果。引物設(shè)計(jì)見表1。

表1 逆轉(zhuǎn)錄定量PCR引物

2 結(jié)果

2.1 MBP68-86成功誘導(dǎo)EAE大鼠模型:經(jīng)MBP68-86免疫Lewis大鼠后會(huì)出現(xiàn)尾癱、雙后肢無(wú)力、雙后肢癱、雙前肢癱直至死亡。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后通過(guò)透射電子顯微鏡觀察兩組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)EAE模型組大鼠可見神經(jīng)元核膜不完整、核仁溶解、核染色質(zhì)邊集。髓鞘溶解破壞明顯,形成電子透亮腔,可識(shí)別的完整髓鞘板層結(jié)構(gòu)較對(duì)照組明顯減少。微血管明顯變形且管腔狹窄,內(nèi)皮細(xì)胞間連接擴(kuò)張部分融合、附近基膜突向管腔且周圍炎癥反應(yīng)明顯,所以MBP68-86可以成功誘導(dǎo)EAE大鼠模型。

2.2 外周APCs接觸抗原后經(jīng)MHCII途徑激活Th細(xì)胞:如圖1A所示(封二),制備EAE模型成功后,免疫熒光結(jié)果顯示脾臟組織中MHCII類分子表達(dá)增加,MHCI類分子表達(dá)未見明顯改變。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析EAE大鼠外周血中T淋巴細(xì)胞亞群,外周血中CD4+T(28.01%)和CD8+T(12.81%)的數(shù)量明顯增加,如圖1B所示(封二)。此結(jié)果提示,MBP68-86肽段可激活外周的Th細(xì)胞和CTL細(xì)胞生成。

2.3 中樞神經(jīng)系統(tǒng)T細(xì)胞免疫應(yīng)答效應(yīng):EAE模型組大鼠腦組織中MHCI類分子表達(dá)明顯增加,而MHCII類分子的表達(dá)無(wú)明顯改變,CD86+CD206-M1樣巨噬細(xì)胞的數(shù)量明顯多于CD86-CD206+M2樣巨噬細(xì)胞,小膠質(zhì)細(xì)胞向M1樣巨噬細(xì)胞方向極化的同時(shí)MHCI類分子表達(dá)增加,見圖2A、 2B(封二)。EAE組CNS中MHCI表達(dá)上調(diào),Th2相關(guān)細(xì)胞因子IL-10、TGF-β和CD32b表達(dá)明顯上調(diào),見圖2C(封二)。如圖2D所示(封二),與CTL殺傷效應(yīng)相關(guān)的顆粒酶 B、穿孔素、FASL分子表達(dá)明顯上調(diào),提示CNS存在小膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)MHCI類分子途徑提呈內(nèi)源性抗原并誘導(dǎo)CTL細(xì)胞發(fā)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。

3 討論

主要組織相容性復(fù)合體(MHC)是一組細(xì)胞表面蛋白,分為兩大類,分別稱為Ⅰ類和Ⅱ類分子,它們?cè)谶m應(yīng)性免疫中起著重要作用。雖然MHCⅠ類分子幾乎在所有細(xì)胞中都普遍表達(dá),但MHCⅡ類分子主要由抗原呈遞細(xì)胞(APC)表達(dá),如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。這些細(xì)胞通過(guò)在MHCⅡ類分子將抗原提呈至CD4+T細(xì)胞。當(dāng)肽-MHCⅡ類分子復(fù)合物與T細(xì)胞受體 (TCR) 相互作用時(shí),并存在由APC上的共刺激分子(如CD40、CD80和CD86)及其配體在T細(xì)胞上相互作用傳遞的信號(hào)時(shí),就會(huì)發(fā)生細(xì)胞活化［10-11］。

通常小膠質(zhì)細(xì)胞極化為M1樣巨噬細(xì)胞優(yōu)先合成表達(dá)MHCII類分子［10-11］。本研究結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)EAE大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞采用了MHCI類分子途徑呈遞抗原,外周免疫系統(tǒng)產(chǎn)生強(qiáng)烈的CD4+細(xì)胞應(yīng)答,而CNS內(nèi)以CD8+細(xì)胞反應(yīng)為主。同一免疫原會(huì)引起CNS與外周免疫系統(tǒng)應(yīng)答模式的差異,而且小膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)偏離單核細(xì)胞極化后的常規(guī)免疫學(xué)表型的原因有一種合理解釋為小膠質(zhì)細(xì)胞與外周APCs對(duì)抗原是“自我”還是“非我”的性質(zhì)認(rèn)定存在不同。外周免疫系統(tǒng)將它作為外源性蛋白,通過(guò)MHCII途徑引起強(qiáng)烈的Th細(xì)胞反應(yīng)。小膠質(zhì)細(xì)胞卻視為“自我”的內(nèi)源性組織成分,在CNS誘發(fā)的Th免疫應(yīng)答缺失或很輕微;并在IL-10、TGF-β和CD32b等抑制MHCII表達(dá)和促進(jìn)Th2細(xì)胞分化的細(xì)胞因子輔助下,優(yōu)先選擇MHCI類分子途徑進(jìn)行呈遞。這可能是小膠質(zhì)細(xì)胞在進(jìn)化過(guò)程中形成的一種固有免疫防御特征,以便在DC缺失時(shí)及時(shí)有效處理CNS組織細(xì)胞損傷產(chǎn)物并通過(guò)招募記憶CTL維持炎癥慢性化。

本研究表明,接觸MBP68-86肽段后,小膠質(zhì)細(xì)胞、CTL和Th細(xì)胞以小膠質(zhì)細(xì)胞為核心共同構(gòu)成一個(gè)CNS免疫應(yīng)答環(huán)路,最終導(dǎo)致髓鞘慢性炎癥損傷和組織修復(fù)交替的病理過(guò)程。外周免疫系統(tǒng)將MBP68-86肽段視為侵入性抗原,通過(guò)MHCII類分子呈遞誘發(fā)CD4+T細(xì)胞為主的免疫反應(yīng)。外周致敏T細(xì)胞經(jīng)損傷的BBB進(jìn)入CNS,激活小膠質(zhì)細(xì)胞的促炎途徑后共同引起髓鞘破壞使抗原持續(xù)生成。局部IL-10、TGF-β和CD32b等細(xì)胞因子促進(jìn)Th2細(xì)胞分化,誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)MHCI類分子途徑招募CTL細(xì)胞至CNS使炎癥反應(yīng)擴(kuò)大和慢性化,造成病變?cè)诓煌课欢啻螐?fù)發(fā)。

綜上所述,EAE免疫應(yīng)答過(guò)程中CNS存在一個(gè)以小膠質(zhì)細(xì)胞為核心,由CTL和Th2細(xì)胞共同參與的免疫應(yīng)答環(huán)路,這或許是維持MS/EAE時(shí)間-空間多發(fā)性的主要機(jī)制。阻斷CNS中M1樣巨噬細(xì)胞促炎作用或MHCI呈遞途徑引起的CTL效應(yīng)將成為治療MS/EAE一種可行的干預(yù)策略。