miR-150-5p在枸杞多糖緩解小鼠腎臟纖維化中的作用研究

陳俊儒,張馨予,康 平,田福燕,張執(zhí)中

眾多慢性腎病(CKD)病程發(fā)展的終末階段共同表現(xiàn)為腎臟纖維化［1-3］,表現(xiàn)為腎小管上皮間質(zhì)細胞纖維化、腎小球出現(xiàn)硬化、腎小球濾過作用受阻、細胞外基質(zhì)過度沉積,導(dǎo)致腎臟功能進行性減弱,甚至最終喪失［4］。研究表明,LBP作為枸杞中發(fā)揮作用的主要活性成分之一,具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能、抵抗細胞氧化、預(yù)防衰老和抗腫瘤等作用［5］。有研究發(fā)現(xiàn),LBP可以緩解心肌組織膠原纖維沉積,抑制慢性心力衰竭大鼠心肌纖維化,改善大鼠心功能［6］。在小鼠腎臟纖維化模型中的研究也表明,LBP能夠緩解腎臟纖維化,但是具體機制尚不明確。目前許多證據(jù)表明微小RNA(miRNA)在腎臟纖維化調(diào)控過程中發(fā)揮著作用,通過靶向調(diào)控相關(guān)基因的表達從而影響疾病的進程［7］。本研究通過結(jié)扎左側(cè)輸尿管構(gòu)建腎臟纖維化模型,給予LBP干預(yù)后,探討miR-150-5p在LBP抑制腎臟纖維化過程中的作用。

1 資料與方法

1.1 實驗動物:實驗所用小鼠均為18～20 g的雌性Balb/c小鼠,購自北京維通利華公司,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,待小鼠適應(yīng)環(huán)境后,采用手術(shù)的方法構(gòu)建腎臟纖維化小鼠模型。

1.2 實驗材料與試劑:枸杞多糖(純度>95%)購自西安草根生物工程有限公司;所有熒光定量PCR引物均委托上海生工進行合成;RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑購自Thermo公司;離心管等耗材購自武漢塞維爾公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及模型的構(gòu)建:21只雌性Balb/c小鼠隨機分成3組,即假手術(shù)組、模型組和LBP干預(yù)組,每組7只小鼠。假手術(shù)組小鼠麻醉后,側(cè)臥位,分離出左側(cè)輸尿管,不結(jié)扎,清理傷口后縫合;模型組小鼠麻醉后,分離出左側(cè)輸尿管,6號線結(jié)扎2道,在其間剪斷輸尿管,清理傷口并縫合;LBP干預(yù)組小鼠在模型組的基礎(chǔ)上每天灌胃0.1 mg/g的LBP,假手術(shù)組和模型組小鼠灌胃100 μL生理鹽水,連續(xù)灌胃21 d。取材后進行后續(xù)實驗。

1.3.2 小鼠取材及腎臟指數(shù)的計算:稱取小鼠體重后,眼球取血,摘取左側(cè)腎臟組織,剔除多余的脂肪組織,用分析天平稱重,計算各組小鼠腎臟指數(shù)。腎臟指數(shù)=腎臟濕重(g)/小鼠體重(g)×100%。

1.3.3 小鼠腎臟RNA的提取與逆轉(zhuǎn)錄:上述摘取左側(cè)腎臟組織用預(yù)冷的生理鹽水洗去血液,剪碎后置于預(yù)冷的研缽中,加入適量液氮進行研磨。待其成為粉末后,轉(zhuǎn)移至無酶EP管中,加入Trizol后徹底混勻,室溫避光靜置5 min。避光加入200 μL氯仿,劇烈混勻后靜置5 min,離心后吸取上層清液至新的EP管中,加入400 μL異丙醇,室溫靜置10 min,離心,加入預(yù)冷的75%酒精1 mL,離心棄上清液,用50 μL 雙蒸水重新懸浮。檢測RNA的濃度后按照試劑說明書進行逆轉(zhuǎn)錄。

1.3.4 小鼠腎臟基因表達水平的檢測:將10 μL 2x SYBR GreenERTM qPCR Super Mix,0.5 μL上游引物,0.5 μL下游引物,1μL cDNA模板,0.4 μL Rox和7.6μL ddH2O依次加入八聯(lián)管,形成20 μL的反應(yīng)體系;反應(yīng)條件為94 ℃ 3 min預(yù)變性,94 ℃ 30 s變性,57 ℃ 30 s退火,72 ℃ 30 s是延伸過程,總共完成40個循環(huán),循環(huán)結(jié)束后,讀取CT值,根據(jù)2-ΔΔCT方法計算基因與GAPDH的相對比值,將對照組的比值換算成1,繪制條形圖。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3.5 ELISA檢測小鼠血清中纖維化指標(biāo):向包被抗體的酶標(biāo)板中加入稀釋的小鼠血清(1∶200),置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育1 h,PBST洗板3次,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育30 min,PBST洗板3次。加入底物,37 ℃避光孵育10 min,最后加入終止液,在酶標(biāo)儀450 nm波長下讀取數(shù)值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)值計算并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,將各組的均值代入公式計算樣品中各細胞因子含量。

1.3.6 生物信息學(xué)預(yù)測miR-150-5p靶基因:使用Targetscan數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-150-5p靶基因,并利用qRT-PCR驗證靶基因Mtmr1和Prickle mRNA在各組肝臟組織中的表達。

2 結(jié)果

2.1 LBP對左腎纖維化小鼠腎臟指數(shù)的影響:與假手術(shù)組相比,模型組小鼠腎臟濕重、小鼠體重以及腎臟指數(shù)均顯著下降,LBP干預(yù)組小鼠腎臟濕重和小鼠體重顯著下降(P<0.05),腎臟指數(shù)沒有明顯改變;與模型組小鼠相比,LBP干預(yù)組小鼠腎臟濕重、小鼠體重均顯著上升(P<0.05),腎臟指數(shù)降低(P<0.05),見表2。

表2 LBP對左腎纖維化小鼠體重、腎臟濕重及腎臟指數(shù)的影響

2.2 LBP對左腎纖維化各組小鼠腎組織纖維化相關(guān)因子mRNA表達水平的影響:與假手術(shù)組相比,模型組小鼠腎臟組織中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、FN及α-SMA的mRNA的表達水平顯著上升(P<0.05);LBP干預(yù)組小鼠腎臟組織中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、FN及α-SMA較假手術(shù)組顯著上升(P<0.05);與模型組小鼠相比,LBP干預(yù)組小鼠腎臟組織中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、FN及α-SMA mRNA表達水平顯著下降(P<0.05),見圖1(目次后)。

2.3 LBP對左腎纖維化小鼠腎組織miR-150-5p表達水平的影響:與假手術(shù)組相比,模型組、LBP干預(yù)組miR-150-5p表達均降低(P<0.05);與模型組相比,LBP干預(yù)組miR-150-5p的表達上升(P<0.05),見圖2(目次后)。

2.4 miR-150-5p靶基因的預(yù)測:經(jīng)過Targetscan在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-150-5p靶基因,結(jié)果顯示miR-150-5p靶基因總共有326個,篩選出與纖維化相關(guān)的靶基因總共有2個,分別是肌微管蛋白相關(guān)蛋白1(Mtmr1),Prickle,見圖3(目次后)。

2.5 LBP對左腎纖維化小鼠腎組織miR-150-5p靶基因Mtmr1和 Prickle mRNA表達水平的影響:與假手術(shù)組相比,模型組Mtmr1與Prickle的mRNA表達水平均顯著上升(P<0.05),LBP干預(yù)組Mtmr1 mRMNA表達水平顯著上升(P<0.05),Prickle mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與模型組相比,LBP干預(yù)組Mtmr1 mRNA表達水平顯著降低(P<0.05),Prickle表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見圖4(目錄后)。

3 討論

腎臟纖維化是CKD發(fā)展到終末階段的共同結(jié)果。截至目前腎臟纖維化機制尚未闡明,臨床對腎臟纖維化病人的治療措施也有限,這就使腎臟纖維化成為一種嚴重影響人類健康的疾病。枸杞多糖作為枸杞主要活性成分之一,已被證實具有免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、抗氧化和抗腫瘤等作用。近年來有研究表明LBP具有抗纖維化作用,干預(yù)改善了心肌組織膠原纖維沉積,能夠抑制慢性心力衰竭大鼠心肌纖維化,改善心功能。左側(cè)輸尿管結(jié)扎是構(gòu)建腎臟纖維化小鼠模型常用的一種方式［8］。本研究通過該種方式構(gòu)建實驗動物模型,發(fā)現(xiàn)小鼠腎臟濕重和腎臟指數(shù)顯著降低,此外RT-qPCR結(jié)果也顯示纖維化指標(biāo)Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、FN和α-SMA的mRNA表達水平顯著上升,這就表明腎臟纖維化小鼠模型構(gòu)建成功。給予LBP干預(yù)后,小鼠腎臟濕重上升,纖維化指標(biāo)Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、FN和α-SMA mRNA表達顯著下調(diào) ,腎臟纖維化得到緩解,這就提示LBP具有緩解腎臟纖維化的作用,這與文獻報道的LBP作用相同。

miRNA是一種非編碼RNA的參與多種生命活動的調(diào)節(jié),如基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯等,長度約為 22 個核苷酸,其能夠與靶基因 miRNA的3’-UTR完全或不完全配對,在轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)揮抑制基因表達的作用［9-12］。近年來大量研究表明miRNA廣泛參與腎臟纖維化調(diào)控,這些靶向腎臟纖維化相關(guān)的miRNA可能成為抗纖維化治療的潛在手段［13］。研究表明miR-34a通過下調(diào)klotho緩解腎臟纖維化［14］;miR-21通過靶向阻斷腎臟中的PTEN激活成纖維細胞,從而調(diào)節(jié)腎纖維化［15］。Peng等人發(fā)現(xiàn)miR-135a可以結(jié)合circRNA_010383緩解糖尿病腎病引起的腎臟纖維化［16］。越來越多的miRNA被鑒定出來,這些miRNAs可以作為潛在的診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn),在腎臟纖維化模型中miR-150-5p表達下調(diào),LBP干預(yù)后miR-150-5p表達上調(diào),這就表明miR-150-5p可能參與LBP抑制腎臟纖維化進程。通過生物信息學(xué)預(yù)測的miR-150-5p靶基因總共有326個,經(jīng)過篩選得到與纖維化相關(guān)的mRNA有2個,分別是Mtmr1和Prickle。經(jīng)驗證發(fā)現(xiàn)Mtmr1和Prickle在模型組小鼠腎臟組織中顯著上調(diào),給予LBP干預(yù)后,Mtmr1表達水平顯著下調(diào),Prickle表達沒有明顯改變。這就提示miR-150-5p可能上調(diào)緩解腎臟纖維化,這還需雙熒光素酶報告基因進行證實。

綜上所述,LBP能夠通過調(diào)節(jié)miR-150-5p的表達,起到改善腎臟纖維化的作用,其機制可能是通過靶向Mtmr1實現(xiàn)的,這可能為腎臟纖維化的診斷和治療提供新思路。