不同炮制方法對川烏毒性成分的影響及其質(zhì)量評價

黃 琦 韓秉辰 陳丹丹 黃先菊 李 竣 陳 曉

1.中南民族大學(xué)藥學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.湖北藥昇中藥科技有限公司，湖北 棗陽 441200

川烏屬于毛茛科植物烏頭AconitumcarmichaeliiDebx.的干燥根部[1]，主要分布在四川、湖北、云南和陜西等地。生物堿是川烏的主要毒性成分和活性物質(zhì)，炮制后的川烏具有祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)止痛的功效，臨床上主要用來治療風(fēng)濕痹證[2]。另外，川烏是大毒之品，川烏中生物堿會導(dǎo)致心臟毒性和神經(jīng)毒性[3]，目前認(rèn)為川烏中主要毒性成分為雙酯型生物堿(新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿)，經(jīng)過炮制加工后，毒性較大的雙酯型生物堿水解為毒性為其1/2000～1/4000的單酯型生物堿(苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿)[3-7]。川烏炮制的方法有很多，歷代記載的炮制方法有70多種[8]?，F(xiàn)代川烏炮制工藝有水煮法，蒸法，微波法等[9-11]，也有采取川烏趁鮮切薄片后炮制的方法[12]。由于不同飲片加工企業(yè)炮制設(shè)備工藝存在差異，川烏飲片的質(zhì)量難以進(jìn)行控制。

此外，“口嘗微有麻舌感”是藥典中制川烏的評價方式之一，但針對川烏麻度分級國內(nèi)外尚未建立感官評價標(biāo)準(zhǔn)，“麻”作為質(zhì)量評價方式與炮制工藝中的技術(shù)指標(biāo)難以在產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)中明確規(guī)定及進(jìn)行檢驗。

本實驗通過對比常壓煮制、常壓蒸制、高壓煮制、高壓蒸制和切片后蒸煮法，探究不同的炮制方法中藥典規(guī)定的生物堿含量變化；并參照和借鑒花椒麻度評價，結(jié)合斯科維爾指數(shù)法川烏毒效成分含量，綜合川烏炮制過程中切片形貌顏色變化，建立了川烏麻度的感官評價分析，為優(yōu)選川烏炮制減毒的方法提供參考，為中藥感官評價分析標(biāo)準(zhǔn)提供思路。

1 儀器與材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀 Waters 2965：alliance；色譜柱ZORBAX Extend-C184.6 mm×150 mm 5-Micron：Agilent technologies；萬分之一天平CP224C：奧豪斯儀器有限公司；十萬分之一天平 AUW120D：島津公司；電子天平JM20002：余姚紀(jì)銘稱重校驗設(shè)備有限公司；移液槍：Eppendorf；高壓滅菌鍋YXQ-50SII：北京東南儀誠實驗設(shè)備有限公司；超聲波清洗器 KQ-500E：昆山市超聲儀器有限公司；高壓鍋、蒸煮鍋、25L食品級不銹鋼桶、C22-T2240多功能電磁爐：均購置廣東美的生活電器制造有限公司。

1.2 材料 川烏藥材由湖北藥昇中藥科技有限公司提供，并經(jīng)中南民族大學(xué)劉新橋副教授鑒定為毛茛科植物烏頭AconitumcarmichaeliiDebx.的干燥母根。色譜純乙腈：SIGMA-ALDRICH；冰醋酸，三乙胺，鹽酸，分析純甲醇均購置于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。純凈水：杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。烏頭堿(aconitioe，HPLC≥98%，批號：DST200729-006，樂美天醫(yī)藥德思物生物公司)；次烏頭堿(hypaconitine，HPLC≥98%，批號：20170324，寶雞市辰光生物科技有限公司)；新烏頭堿(mesacontine，HPLC≥98%，批號：Y12A7H19379，上海源葉生物科技有限公司)；苯甲酰烏頭原堿(benzoylacontine，HPLC≥98%，批號：P16A7F19499，上海源葉生物科技有限公司)；苯甲酰新烏頭原堿(benzoylmesaconitine，HPLC≥98%，批號：20170329，寶雞市辰光生物科技有限公司)；苯甲酰次烏頭原堿(benzoylhypalonitine，HPLC≥98%，批號：20170129，寶雞市辰光生物科技有限公司)。

2 炮制工藝

2.1 浸泡 取原藥材8000 g，除去雜質(zhì)，備用。從中取50 g留樣用于生川烏供試品制備。剩余生品在室溫(25 ℃)下于25 L食品級不銹鋼桶中用純凈水浸泡，液面高于藥材5 cm，每隔6 h取較大個切開，以內(nèi)無干心為浸泡終點。隨機取50 g左右浸泡好的川烏在通風(fēng)櫥晾干，留樣用于浸泡后川烏供試品制備。

2.2 炮制 取浸泡好的川烏分6組，每組取樣(1000±10)g，保證每組大小均勻，分別命名為川烏常壓蒸制組、川烏常壓煮制組、川烏高壓蒸制組、川烏高壓煮制組，剩余2組川烏通風(fēng)櫥風(fēng)干至6成干切片后命名為川烏切片蒸制組、川烏切片煮制組。

2.2.1 常壓蒸制和切片蒸制 將川烏常壓蒸制組，放入蒸煮鍋的蒸籠中，開水蒸制。分別在蒸制1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h時取樣切片觀察外觀性狀，內(nèi)無白心為炮制終點，通風(fēng)櫥干燥，備用。川烏切片蒸制組同法操作。

2.2.2 高壓蒸制 將川烏高壓蒸制組，高壓滅菌鍋中分別蒸制0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h時取樣切片觀察外觀性狀，以內(nèi)無白心為炮制終點，通風(fēng)櫥干燥，備用。

2.2.3 常壓煮制和切片煮制 將川烏常壓煮制組，加10倍量清水，開水煮制，分別在1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h時取樣切片觀察外觀性狀，以內(nèi)無白心為炮制終點，通風(fēng)櫥下干燥，備用。川烏切片煮制組同法操作。

2.2.4 高壓煮制 將川烏高壓煮制組放入高壓鍋中，加10倍水，高壓煮制，分別在煮制0.5 h、1 h、1.5 h、2 h時取樣切片觀察外觀性狀，內(nèi)無白心為炮制終點，通風(fēng)櫥干燥，備用。

3 方法

3.1 HPLC法

3.1.1 色譜條件 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動相A，以0.2%冰醋酸溶液(三乙胺調(diào)節(jié)pH值至6.20)為流動相B，按表1中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長為235 nm[1]。理論板數(shù)按新烏頭堿峰計算應(yīng)不低于2000。

表1 HPLC梯度洗脫程序

3.1.2 對照品溶液的制備 分別精密稱定對照品，用0.01%鹽酸甲醇溶液定容到10 mL，制成每1 mL含新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿各0.6 mg的混合對照溶液。單酯型生物堿對照品同法操作(每1 mL含苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿和苯甲酰新烏頭原堿各 0.6 mg)。取上述溶液各1 mL，分別置2 mL、5 mL、10 mL、25 mL量瓶中，加 0.01%鹽酸甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻。

3.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密吸取上述對照品混合溶液10 μL，按照上述色譜條件，以對照品混合溶液中生物堿的濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)色譜峰的峰面積值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。見表2。

表2 六種生物堿標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.1.4 供試品溶液制備 取藥材粉末(過三號篩)約 2 g，精密稱定后置具塞錐形瓶中，加氨試液3 mL，精密加入異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液 50 mL，稱定重量，超聲處理(功率 300 W，頻率 40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液25 mL，40 ℃以下減壓回收溶劑至干，殘渣加 0.01%鹽酸甲醇溶液使溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密吸取注入液相色譜儀，測定，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計算，即得。

3.1.5 精密度試驗 取同一批川烏的供試品10 μL，按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣5次，結(jié)果烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿和苯甲酰新烏頭原堿峰面積的RSD分別為0.37%、0.64%、0.49%、0.97%、1.57%、1.32%。

3.1.6 穩(wěn)定性試驗 取供試品1份，按“3.1.4”項操作，分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、36 h進(jìn)樣，結(jié)果烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿和苯甲酰新烏頭原堿的RSD分別為1.17%、1.39%、1.84%、1.38%、0.89%、1.74%。

3.1.7 重復(fù)性試驗及加樣回收試驗 取川烏樣品5份，按“3.1.4”項操作制備供試品，在“3.1.1”色譜條件下進(jìn)行測定，重復(fù)性試驗結(jié)果為烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿和苯甲酰新烏頭原堿的平均含量分別為0%、0.011%、0.027%、0.003%，0.015%、0.03%；RSD分別為0.23%、0.42%、0.36%、0.34%、0.51%、0.35%。

取樣品(生川烏)約1 g，共六份，精密稱定，分別加入烏頭堿(0.21 mg/mL)、次烏頭堿(0.42 mg/mL)、新烏頭堿(0.43 mg/mL)、苯甲酰烏頭原堿(0.57 mg/mL)、苯甲酰次烏頭原堿(0.41 mg/mL)和苯甲酰新烏頭原堿(0.56 mg/mL)對照品溶液適量，按“3.1.4”項操作，在“3.1.1”色譜條件下進(jìn)行測定，加樣回收試驗結(jié)果見表3。

表3 加樣回收試驗結(jié)果 (n=6)

3.2 川烏斯科維爾指數(shù)法麻度評價 取川烏不同炮制時間的炮制品切開觀察，以藥典規(guī)定內(nèi)無白心，口嘗有麻舌感為標(biāo)準(zhǔn)評價川烏炮制。麻舌感借鑒GB/T 38495-2020 花椒麻度評價[13]和GB/T 21265-2007辣椒辣度[14]的感官評價方法中斯科維爾指數(shù)法，結(jié)合文獻(xiàn)[15]進(jìn)行改進(jìn)。用食用乙醇提取被檢驗樣品中引起麻感的物質(zhì)，將該提取液按比例稀釋成不同濃度的醇水溶液，通過對比檢驗確定出評價小組恰好識別出有麻感時被檢樣液對應(yīng)的最大稀釋倍數(shù)，得到斯科維爾指數(shù)，確定麻度等級。

3.2.1 斯科維爾指數(shù)(Scoville index；Scoville pungency units；SPU)[16]在本標(biāo)準(zhǔn)測試條件下，被評價小組恰好識別出有麻感時被驗樣液的稀釋倍數(shù)，可按式(1)計算。

(1)

式中：V1為樣品提取液的移取體積，單位mL；V2為恰好識別出有麻感的樣液移取體積，單位mL。

3.2.2 樣品提取液制備 取炮制品粉末0.1 g，精密稱定，置棕色具塞錐形瓶中，加入乙醇50 mL，稱定重量，20 ℃恒溫超聲提取20 min，放冷，用乙醇補足減輕的重量，將混合溶液全部轉(zhuǎn)移至離心管中，2000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至容量瓶中。重復(fù)洗滌沉淀1次，洗滌所得上清液轉(zhuǎn)移至同一容量瓶中，乙醇定容至200 mL，搖勻備用。

參考GB/T 38495-2020 花椒麻度評價，評價小組(10人)初步確定樣品所屬的可能麻感區(qū)段在A1～D3區(qū)間。根據(jù)表4中A～J麻感區(qū)段對應(yīng)的取樣量，移取相應(yīng)體積(V1)的樣品提取液置于100 mL棕色容量瓶中，純凈水稀釋定容，制備成樣液，用于下一步確定最小樣液量。

表4 不同麻感區(qū)段對應(yīng)的樣品提取液稀釋方法

3.2.3 樣品最小樣液量的確定 將制備好的樣品提取液按GB/T 38495-2020不同麻感區(qū)對應(yīng)移取體積，移取相應(yīng)體積的供試品置于50 mL棕色容量瓶中，純凈水稀釋定容。從移取體積由小到大由感官評價小組品評，直到識別出有麻感時的樣液移取體積為最小樣液量。當(dāng)最大體積仍無麻感時，采用低一級麻味區(qū)段重復(fù)上述方法。

3.2.4 空白液制備 移取與被檢供試品等體積的乙醇至50 mL容量瓶內(nèi)，加純凈水定容，備用。

3.2.5 評價方法 根據(jù)GB 12310-2012，評價小組分別對供試品的最小樣液量及空白液進(jìn)行比對，評價結(jié)果為多次檢驗正確答案數(shù)的總和，根據(jù)二項式分布顯著性檢驗表，在置信度大于95%推出存在感官差別所需的最少正確答案數(shù)，按公式1計算SPU。SPU與麻度等級換算按表5換算。

表5 SPU與麻度等級換算關(guān)系

4 結(jié)果

4.1 含量測定結(jié)果 圖1、圖2、圖3為各生物堿和生川烏中色譜圖，各峰無干擾。根據(jù)表6、圖4可知，常壓煮制、常壓蒸制、高壓煮制、高壓蒸制4種炮制方法，雙酯型生物堿含量都在炮制1 h內(nèi)迅速降至藥典規(guī)定值0.04%以下，后期在最低值處平穩(wěn)。

①：苯甲酰新烏頭原堿；②：苯甲酰烏頭原堿；③：苯甲酰次烏頭原堿

④：新烏頭堿；⑤：烏頭堿；⑥：次烏頭堿

圖3 生川烏 HPLC色譜圖

A1：不同方法炮制的川烏中三種單酯型生物堿總含量變化圖；A2：不同方法炮制的川烏中三種雙酯型生物堿總含量變化圖；B1：不同方法炮制的川烏中烏頭堿含量變化圖；B2：不同方法炮制的川烏中次烏頭堿含量變化圖；B3：不同方法炮制的川烏中新烏頭堿含量變化圖；C1：不同方法炮制的川烏中苯甲酰烏頭原堿含量變化圖；C2：不同方法炮制的川烏中苯甲酰次烏頭原堿含量變化圖；C3：不同方法炮制的川烏中苯甲酰新烏頭原堿含量變化圖。

表6 不同樣品中浸泡24 h后各生物堿含量統(tǒng)計表 (n=3)

6種川烏炮制方法達(dá)到峰值的時間不同，常壓蒸制，單酯型生物堿在炮制5～6 h內(nèi)符合藥典規(guī)定值范圍0.07%～0.15%，5 h時達(dá)到峰值0.0779%，炮制7 h下降到規(guī)定最低值以下。高壓蒸制川烏在0.5～2.5 h單酯型生物堿內(nèi)全部可以達(dá)到藥典要求范圍0.07%～0.15%，并在炮制1 h時含量達(dá)最高0.1355%。川烏高壓煮制單酯型生物堿在1～2 h達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)范圍0.07%～0.15%，1 h時達(dá)到峰值0.1319%，2.5 h以后降到藥典規(guī)定值以下。川烏常壓煮制單酯生物堿2～3 h達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)，在2 h達(dá)到峰值0.1338%，3 h降到藥典規(guī)定值以下。川烏切片煮制、切片蒸制單酯型生物堿含量均未達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)范圍0.07%～0.15%，可能與單酯型生物堿過度水解有關(guān)。取每種方法單酯型生物堿達(dá)到峰值的時間為較優(yōu)工藝，每種方法炮制較優(yōu)工藝如表7所示。

表7 不同炮制方法的最佳炮制工藝 (n=3)

4.2 炮制過程的形貌及感官評價 因使用HPLC進(jìn)行對川烏炮制的過程進(jìn)行質(zhì)量檢測的難度大，無法精準(zhǔn)把控炮制達(dá)標(biāo)時間和達(dá)標(biāo)點，根據(jù)中國藥典2020版描述，炮制需要達(dá)到內(nèi)無白心口嘗微有麻舌感，課題組對不同炮制方法和不同炮制時間的川烏切片進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖5所示。川烏炮制過程中白心逐漸變黃，當(dāng)炮制時間繼續(xù)增加時，藥材切片的心由黃變暗黃色，最后接近黑色。

①：苯甲酰新烏頭原堿；②：苯甲酰烏頭原堿；③：苯甲酰次烏頭原堿；④：新烏頭堿；⑤：烏頭堿；⑥：次烏頭堿。川烏煮制色譜圖中從1～8分別為生川烏、煮制1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h。川烏蒸制色譜圖中從1～8分別為蒸制1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h。川烏高壓煮制色譜圖中從1～6分別為0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h。川烏高壓蒸制色譜圖中從1～5分別為0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h。

由評價小組對炮制的川烏進(jìn)行了感觀評價，結(jié)果見表8，麻度隨著炮制時間的增加而減少，結(jié)合含量測定結(jié)果可以看到麻度等級1對應(yīng)的炮制品都達(dá)到藥典規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。證明斯科維爾指數(shù)可以應(yīng)用在川烏炮制品的感官評價上，運用斯科維爾指數(shù)法實現(xiàn)“麻舌感”感官評價的定量，麻度等級為1時為炮制終點。

表8 川烏炮制品麻度等級表

5 討論

在標(biāo)品的檢測中，多數(shù)研究采用單、雙酯型生物堿混合檢測的方法，但在實驗過程中發(fā)現(xiàn)雙酯型生物堿標(biāo)品存在分解現(xiàn)象，為保證標(biāo)品結(jié)果的精確性，故將單、雙酯型生物堿標(biāo)品分開進(jìn)行檢測。

4種炮制方法單酯生物堿峰值差異不大，主要差異在炮制時間長短；煮制的方法較蒸制達(dá)到單酯型生物堿轉(zhuǎn)化最大值時間明顯減少，分析原因是煮制藥材暴露在水中會使水解反應(yīng)更加完全；高壓的方法較常壓的方法炮制時間也明顯縮短，表明在高溫高壓的條件下會加快水解反應(yīng)速率。

綜上所述，川烏在6種炮制方法中都可以在1h內(nèi)使雙酯型生物堿降至0.04%以下，單酯型生物堿呈增加后下降的趨勢，符合生物堿水解規(guī)律，雙酯型生物堿水解生成單酯型生物堿，此時雙酯型生物堿含量下降，單酯型生物堿含量升高，繼續(xù)加熱后單酯型生物堿進(jìn)一步水解生成醇胺型生物堿，單酯型生物堿含量因此下降。所以需要合適的炮制時間，時間過短，單、雙酯型生物堿不符合藥典要求，時間過長造成單酯型生物堿繼續(xù)變化。本研究中川烏炮制單酯生物堿含量最大值均在藥典規(guī)定范圍，故建議炮制達(dá)到單酯生物堿含量最大值時作為最佳炮制時間。結(jié)合實際生產(chǎn)工藝現(xiàn)實(設(shè)備、成本、環(huán)保)，為達(dá)到省時省工的目的，通過實驗表明常壓煮制的炮制工藝較其它幾種方法對設(shè)備需求低，炮制時間合適，是符合工業(yè)生產(chǎn)較佳方法。再與含量測定結(jié)果對比，結(jié)果顯示生川烏在常溫浸泡24 h，常壓煮制2 h為較佳生產(chǎn)工藝。

通過觀察不同炮制時間的藥材切片顏色和麻度評價，與含量測定結(jié)果進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)川烏炮制過程中顏色的變化和單酯型生物堿的生成存在相關(guān)性，川烏隨炮制時間的增加，白心逐漸變黃，此時單酯型生物堿呈現(xiàn)上升趨勢，當(dāng)炮制時間繼續(xù)增加時，藥材切片的心由黃變暗黃色，此時生物堿呈現(xiàn)平穩(wěn)下降趨勢，且蒸制法炮制暗黃色會加深，甚至接近黑色，此時單酯型生物堿急劇下降。可以觀察到藥材的中心為暗黃色時最佳，比對含量測定結(jié)果，均達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)。所以可以用切片顏色來判斷炮制終點，切開藥材，內(nèi)心為暗黃色可作為炮制終點。結(jié)合斯科維爾指數(shù)，麻度強度為1時，可以視為炮制終點。川烏無法炮制與HPLC檢測同時進(jìn)行，在炮制過程中含量檢測前，麻度評價與藥材切片顏色這兩項因素可以作為質(zhì)量評價的參考，判定炮制終點。最后結(jié)合含量測定，對川烏質(zhì)量評價做出明確判斷。

本研究為制川烏的規(guī)范化生產(chǎn)提供了選擇和參考，通過觀察川烏炮制過程中切片顏色，實現(xiàn)了川烏炮制過程中質(zhì)量評價和技術(shù)指標(biāo)的快速評判，并首次將斯科維爾指數(shù)應(yīng)用于川烏麻度評價，為川烏麻度評價的量化提供了參考，以及給炮制后川烏的質(zhì)量和臨床用藥安全提供一定的理論依據(jù)。