組蛋白乳酸化通過(guò)HDAC2影響抗結(jié)核藥物性肝損傷炎癥的機(jī)制研究

龍奕妃 李雪瑩 劉越 李金鳳

華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 河北唐山 063210

抗結(jié)核藥物性肝損傷(Anti-tuberculosis drug-induced liver injury,ADLI)是結(jié)核病治療中多藥聯(lián)合應(yīng)用產(chǎn)生的最為嚴(yán)重的副反應(yīng)[1],其發(fā)生與遺傳[2-3]和環(huán)境[4-5]密不可分,而表觀遺傳學(xué)正是連接環(huán)境與基因的紐帶。2019 年 Zhang等[6]研究報(bào)道組蛋白乳酸化是一種全新的表觀遺傳修飾,自此開(kāi)啟了組蛋白乳酸化這種全新的翻譯后修飾的研究。HDAC2在1996年由Yang等[7]發(fā)現(xiàn),屬于I類HDAC中的一員,其活性位點(diǎn)具有催化機(jī)制,在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞周期等過(guò)程中起重要作用[8],而且有研究發(fā)現(xiàn)HDAC2可以加速糖酵解[9],與組蛋白乳酸化密切相關(guān)。門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartate transaminase,AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine aminotransferase,ALT)是檢測(cè)肝臟功能的常用指標(biāo),二者異常升高提示出現(xiàn)肝損傷[10],AST分布在肝細(xì)胞胞核和線粒體,其升高提示肝損傷可能已經(jīng)損傷細(xì)胞器;ALT則主要分布在肝細(xì)胞胞漿,其數(shù)值升高則反映胞膜的破壞。因此本研究采用異煙肼、利福平、吡嗪酰胺三聯(lián)用藥方案在AML12細(xì)胞中構(gòu)建ADLI細(xì)胞模型,并外源添加組蛋白乳酸化促進(jìn)劑和抑制劑,旨在研究組蛋白乳酸化通過(guò)HDAC2對(duì)ADLI炎癥的影響,為組蛋白乳酸化治療ADLI提供理論支持。

1 材料和方法

1.1細(xì)胞與試劑 AML12細(xì)胞購(gòu)自上海中科院;異煙肼、利福平、吡嗪酰胺購(gòu)自日本TCI公司;乳酸、草氨酸鈉購(gòu)自美國(guó)MedChemExpress生物科技公司;CCK8、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;ALT、AST試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1溶液配制 異煙肼:利福平:吡嗪酰胺按照3:6:16的比例,取異煙肼0.15g,利福平0.3g,吡嗪酰胺0.8g,溶解于5mL DMSO,得到(30000+60000+160000)μg/mL的三聯(lián)藥原液;取8μL乳酸溶解到1.11mL DEPC水中,得到100mmoL/L的乳酸原液;取500mg草氨酸鈉粉末溶解到9mL DEPC水,得到500mmoL/L的草氨酸鈉原液。以上原液均4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2細(xì)胞活性檢測(cè) 使用CCK8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)密度達(dá)到80%～90%時(shí),將其調(diào)整到3×104個(gè)/mL后接種到96孔板,貼壁生長(zhǎng)后分別加入含不同濃度促進(jìn)劑和抑制劑的培養(yǎng)基,37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)24h后,每孔加入100μL的CCK8稀釋液培養(yǎng)4h檢測(cè)各孔OD值,計(jì)算細(xì)胞活性。以對(duì)照組為參照,取細(xì)胞活性為80%時(shí)所在濃度為最終應(yīng)用濃度。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞分組 AML12細(xì)胞在37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng),并分為對(duì)照組、三聯(lián)藥組、乳酸組、草氨酸鈉組、三聯(lián)藥+乳酸組、三聯(lián)藥+草氨酸鈉組。細(xì)胞培養(yǎng)24h后收集培養(yǎng)基上清液。

1.2.4mRNA相對(duì)表達(dá)量檢測(cè) RT-PCR方法測(cè)定各指標(biāo)mRNA表達(dá)水平。冰上操作,TRIZOL法提取總RNA,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書制備cDNA,克隆目的基因PCR。擴(kuò)增程序如下:變性98℃, 10 sec;退火68℃, 30 sec;延伸72℃,Forever,45個(gè)循環(huán)。引物序列如表1所示。

表1 引物序列

1.2.5蛋白表達(dá)水平 Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞炎癥蛋白表達(dá)水平。冰上操作,裂解細(xì)胞后BCA蛋白定量試劑盒定量至5μg/μL,之后金屬浴5min蛋白變性,備用。蛋白上樣,經(jīng)凝膠電泳后轉(zhuǎn)至 PVDF 膜,用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉2h,加入HDAC2一抗(1:5000)、NFκB一抗(1:5000)、GAPDH一抗(1:1000)4 ℃孵育過(guò)夜。TBST漂洗三次,用HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(1:5000)室溫孵育2h,TBST漂洗三次,ECL發(fā)光液顯影。

1.2.6AST、ALT酶活性檢測(cè) 取適量細(xì)胞培養(yǎng)上清液,使用測(cè)試盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi) AST、ALT酶活性,酶標(biāo)儀510 nm波長(zhǎng)檢測(cè)各組OD值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用單因素方差分析,兩組間的比較采用Student-t檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。采用Pad Prism軟件(Ver. Prism 8)繪制統(tǒng)計(jì)圖。

2 結(jié)果

2.1乳酸濃度確定 AML12細(xì)胞活性在乳酸濃度0～40 mmoL/L范圍內(nèi)逐漸升高,但乳酸濃度超出40 mmoL/L后,細(xì)胞活性降低。故其培養(yǎng)濃度取8mmoL/L。見(jiàn)表2。

表2 不同濃度乳酸中細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果(%)

乳酸濃度(mmoL/L)01520304050AML12細(xì)胞活性100198.38±0.099200.21±0.283211.42±0.080223.49±0.14067.85±0.202

2.2草氨酸鈉濃度確定 AML12細(xì)胞活性隨著草氨酸鈉濃度的升高而降低,見(jiàn)表3。故其培養(yǎng)濃度取其最高值18mmoL/L。

表3 不同濃度下抑制劑草氨酸鈉中AML12細(xì)胞活性(%)

草氨酸鈉濃度(mmoL/L)01416182030AML12細(xì)胞活性10085.19±0.04083.43±0.03879.35±0.08475.05±0.20570.23±0.337

2.3組蛋白乳酸化水平變化對(duì)ADLI蛋白和mRNA表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比,三聯(lián)藥組HDAC2的mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低,NF-κB表達(dá)明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與三聯(lián)藥組相比,HDAC2的mRNA和蛋白在三聯(lián)藥+乳酸組表達(dá)升高,在三聯(lián)藥+草氨酸鈉組表達(dá)降低;而NF-κB mRNA和蛋白在三聯(lián)藥+乳酸組表達(dá)降低,在三聯(lián)藥+草氨酸鈉組表達(dá)明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組細(xì)胞中HDAC2、NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)情況注:*表示與對(duì)照組比較P<0.05;#表示與三聯(lián)藥組比較P<0.05。

2.4乳酸、草氨酸鈉對(duì)上清AST、ALT酶活性的影響 與對(duì)照組相比,三聯(lián)藥組的AST、ALT酶活性顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與三聯(lián)藥組相比,三聯(lián)藥+乳酸組的AST、ALT酶活性顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 各組細(xì)胞上清液中AST、ALT酶活性注:*表示與對(duì)照組比較P<0.05;#表示與三聯(lián)藥組比較P<0.05。

3 討論

ADLI是抗結(jié)核治療過(guò)程中危害最大且最常見(jiàn)的藥物不良反應(yīng),嚴(yán)重時(shí)能導(dǎo)致肝衰竭危及生命,故其治療顯得至關(guān)重要。組蛋白乳酸化是全新的翻譯后修飾調(diào)控,2019 年 Zhang等在人和小鼠細(xì)胞的核心組蛋白上鑒定發(fā)現(xiàn)了28個(gè)乳酸化位點(diǎn),為理解乳酸的非代謝功能及其參與感染、免疫等過(guò)程提供了新角度。組蛋白乳酸化是糖酵解的結(jié)果,在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、胚胎發(fā)育、神經(jīng)元活動(dòng)等生理過(guò)程中起關(guān)鍵作用[11-13],更在病理過(guò)程中具有調(diào)節(jié)免疫的功能,其水平的高低常常與疾病的預(yù)后密切相關(guān)[14-16],甚至可以驅(qū)動(dòng)腫瘤基因表達(dá)并加速腫瘤發(fā)生[17]。

HDAC2在細(xì)胞增殖、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、癌癥發(fā)生和進(jìn)展、炎癥和基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用,其主要靶向組蛋白H3和H4[18]。HDAC2已經(jīng)被多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)證明有減輕炎癥反應(yīng)的功能[19]。另外有研究指明嚴(yán)重哮喘患者體內(nèi)HDAC2表達(dá)降低,其介導(dǎo)的糖皮質(zhì)激素受體乙酰化狀態(tài)改變能刺激NF-κB的活化,進(jìn)而促進(jìn)嚴(yán)重哮喘的發(fā)生[20];2018年P(guān)eter J也提及在嚴(yán)重哮喘和COPD患者的上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和外周血白細(xì)胞中HDAC2表達(dá)降低,而募集HDAC2可以逆轉(zhuǎn)核心組蛋白的乙?；?繼而關(guān)閉氣道中激活的炎癥基因[21]。2019年Lai團(tuán)隊(duì)觀察到暴露在室內(nèi)塵螨環(huán)境中的HDAC2+/-小鼠出現(xiàn)明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)增強(qiáng),認(rèn)為HDAC2是通過(guò)抑制了T-2細(xì)胞因子和IL-17A表達(dá)水平而起作用,證實(shí)了HDAC2過(guò)表達(dá)可阻止炎癥因子的進(jìn)一步發(fā)展[22];同年Tang團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)p300/YY1/miR-500a-5p/HDAC2信號(hào)軸調(diào)控人類結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖,其中HDAC2是miR-500a-5p的功能靶點(diǎn),也是該miRNA的靶基因,介導(dǎo)了miR-500a-5p對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲,而這些功能離不開(kāi)HDAC2對(duì)腫瘤微環(huán)境炎癥的調(diào)控作用[23]。

NF-κB能控制DNA轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞因子的產(chǎn)生和細(xì)胞存活[24]。NF-κB信號(hào)通路在慢性炎癥和自身免疫性疾病中的研究最為豐富,其激活與癌癥、自身免疫性疾病、心血管疾病等病理過(guò)程相關(guān)[25]。NF-κB在接收到刺激的第一時(shí)間被激活,引起免疫反應(yīng)相關(guān)基因的激活,發(fā)揮促進(jìn)炎癥的作用,在炎癥消退后又可恢復(fù)至正常。

AST存在于心肌細(xì)胞和肝細(xì)胞的線粒體中,當(dāng)肝組織受到嚴(yán)重?fù)p害血清AST會(huì)升高[26]。ALT主要存在于肝細(xì)胞胞質(zhì)中,在重型肝炎、肝硬化、肝癌藥物中毒性肝細(xì)胞壞死等病理進(jìn)程中,AST、ALT會(huì)大量釋放入血,血清中二者含量急速升高。

本研究在AML12小鼠肝細(xì)胞中構(gòu)建ADLI模型,通過(guò)改變組蛋白乳酸化狀態(tài)發(fā)現(xiàn),組蛋白乳酸化促進(jìn)劑乳酸可升高HDAC2的表達(dá)水平,同時(shí)抑制NF-κB的活性,降低細(xì)胞上清液中ALT、AST酶活性,在一定程度上緩解肝臟損傷;而組蛋白乳酸化抑制劑草氨酸鈉的作用與之相反,與已有研究結(jié)果一致[27-29]。組蛋白乳酸化修飾水平升高可在一定程度上修復(fù)ADLI損傷,提示組蛋白乳酸化可能是治療ADLI的新途徑,本研究為ADLI的治療提供理論支持。