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    不同品種諾麗果發(fā)酵前后品質(zhì)、揮發(fā)性風(fēng)味成分和抗氧化活性比較

    2023-09-28 03:49:46孫碧琪毛祥飛柳美穗崔亞娟
    中國釀造 2023年9期
    關(guān)鍵詞:葉型酵素西沙

    田 亮,孫碧琪,毛祥飛,柳美穗,崔亞娟,劉 洋*

    (1.海南西沙諾麗生物科技有限公司,海南 三亞 572024;2.北京科技大學(xué) 化學(xué)與生物工程學(xué)院,北京 100083;3.北京市營養(yǎng)源研究所,北京 100069)

    諾麗(Morinda citrifoliaL.)是茜草科海巴戟屬的一種植物,其果實被稱為諾麗果。原產(chǎn)于東南亞、大洋洲和澳大利亞等,生長范圍從波利尼西亞延伸到印度,遍布熱帶地區(qū),在許多國家都有大規(guī)模的種植[1]。諾麗在我國主要分布于海南,按照葉片和果實形狀可將其分為橢圓形葉大果、卵圓形葉大果和卵圓形葉小果三種類型。其中,橢圓形葉大果原產(chǎn)于印度尼西亞,卵圓形葉大果原產(chǎn)于美國夏威夷,卵圓形葉小果原產(chǎn)于我國西沙群島,這3種諾麗皆為野生品種[2]。近年來,從西沙群島引種在三亞馴化栽培的諾麗品種—西沙諾麗抗氧I號果,以及經(jīng)過馴化后的卷葉型長果,此外也有其他不同果形及大小的果實隨著馴化逐漸被區(qū)分開來,形成各具特色的諾麗品種。

    諾麗被用于治療一些疾病已有2 000多年的歷史,它可以刺激免疫系統(tǒng),從而抵抗細菌、病毒、寄生蟲和真菌的感染,可以防止惡性腫瘤的形成和擴散,對高血壓,心臟方面的疾病也具有一定的輔助治療作用[3-4]。諾麗鮮果和諾麗發(fā)酵汁也具有清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基能力[5],諾麗果汁還能顯著降低老齡老鼠肝組織中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)的活力,降低血中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量[6]。諾麗果具有優(yōu)越的抗氧化能力,可被加工為諾麗酵素保健產(chǎn)品。

    近年來對諾麗果化學(xué)成分進行了廣泛研究,已知被報道存在于果實中的生物活性化合物主要有東莨菪亭、酚類、黃酮、維生素C、環(huán)烯醚萜類、生物堿和甾醇等[9]。這些化合物對多種疾病的治療均有良好的功效,具有出色的抗菌和抗氧化等生物活性[10-11]。諾麗果中揮發(fā)性化合物含量則決定著果實的整體氣味,其中酯類、辛酸和己酸等含量影響著人們的食用意愿[14]。

    目前,對諾麗果的研究多集中在單一品種功能性及發(fā)酵產(chǎn)品化學(xué)成分的研究[16],對不同品種在同一個地方種植后的品質(zhì)、揮發(fā)性成分及抗氧化活性研究較少。本研究為了比較不同品種諾麗果(卵圓形葉大果、橢圓形葉大果、卷葉型長果、西沙諾麗抗氧I號果)發(fā)酵前后品質(zhì)、揮發(fā)性成分及抗氧化活性差異,通過常規(guī)方法檢測其品質(zhì)指標,采用氣質(zhì)聯(lián)用(gaschromatography-massspectrometry,GC-MS)技術(shù)分析其揮發(fā)性風(fēng)味成分,并通過其對羥基、2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid),ABTS)、DPPH自由基清除能力及還原力檢測,考察諾麗酵素的抗氧化能力。旨在為探究不同品種的諾麗果酵素產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ),為今后諾麗果的種植、加工提供理論參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    1.1.1 原料

    卵圓形葉大果、橢圓形葉大果、卷葉型長果、西沙諾麗抗氧I號果:海南省三亞紅花村種植,四個品種諾麗果外觀形態(tài)如下:

    1.1.2 化學(xué)試劑

    30%過氧化氫(分析純):廣東廣試試劑科學(xué)有限公司;水楊酸鈉、硫酸亞鐵、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、六水合三氯化鐵、三氯化鐵、磷酸二氫鉀、過硫酸鉀(均為分析純):天津市大茂化學(xué)試劑廠;無水乙醇(分析純):廣東光華科技股份有限公司;氫氧化鈉、鹽酸(均為分析純):西隴科學(xué)股份有限公司;2,2'-聯(lián)氮-雙-(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS):北京索萊寶科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(分析純):上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    BS224S分析天平:德國賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;ZHWY-110X30往復(fù)式恒溫水浴搖床:上海智誠分析儀器制造有限公司;T-6新世紀紫外可見分光光度計:北京普析通用儀器有限公司;1260高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)儀:美國安捷倫公司;UPLC I-Class TQ-S超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀、50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取頭:美國Waters公司;SP-756P紫外分光光度計:上海光譜儀器有限公司制造;QL-902漩渦振蕩儀:海門市其林貝爾儀器制造有限公司;H1650醫(yī)用離心機:湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;FD150N離心機:昆山前衛(wèi)機械科技有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 分析檢測

    總多酚(以沒食子酸計)測定:參考團體標準T/AHFIA 005—2018《植物提取物及其制品中總多酚含量的測定分光光度法》;總黃酮(以蘆丁計)測定:參照《保健食品功效成分檢測方法》中的分光光度法;葉黃素測定:參考國標GB 5009.248—2016《食品安全國家標準食品中葉黃素的測定》;粗多糖測定:參考中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準SN/T 4260—2015《出口植物源食品中粗多糖的測定苯酚-硫酸法》;總皂苷測定:參考《保健食品及其原料安全性毒理學(xué)檢驗與評價技術(shù)指導(dǎo)原則》(2020 年版);原花青素測定:參考地方標準DB12/T 885—2019《植物提取物中原花青素的測定紫外/可見分光光度法》;木質(zhì)素測定:參考農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T 3494—2019《農(nóng)業(yè)生物質(zhì)原料纖維素、半纖維素、木質(zhì)素測定》;香草酸、綠原酸、沒食子酸、阿魏酸、原兒茶酸、龍膽酸、咖啡酸、丁香酸、P-香豆酸、芥子酸、槲皮素測定:參考農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T 3949—2021《植物源性食品中酚酸類化合物的測定高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》;香豆酸、東莨菪亭、環(huán)烯醚萜類(車葉草苷酸)、環(huán)烯醚萜類(去乙酰車葉草苷酸)測定:參考文獻[17-18]的方法。

    1.3.2 揮發(fā)性風(fēng)味成分的測定

    揮發(fā)性風(fēng)味成分測定采用GC-MS法。

    采用固相萃?。╯olid phase extraction,SPE)法提取,在40 ℃條件下加熱,插入萃取頭萃取5 min,后插入進樣口解吸5 min。

    氣相色譜條件:Rtx-WAX毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 mm),升溫程序為初始溫度40 ℃;30 ℃/min升溫至60 ℃;10 ℃/min升溫至180 ℃;20 ℃/min升溫至220 ℃,保溫2 min。分流比15∶1,流速1 mL/min,載氣為高純氦氣(He)。質(zhì)譜條件:電子電離(electronic ionization,EI)源,電子能量70 eV,進口溫度230 ℃,離子源溫度200 ℃,掃描范圍35~450 m/z。

    定性定量方法:測定結(jié)果通過美國國家標準技術(shù)研究所(national institute of standards and technology,NIST)08標準質(zhì)譜圖庫檢索比對,并參考相關(guān)文獻進行揮發(fā)性風(fēng)味成分定性,采用峰面積歸一化法進行揮發(fā)性風(fēng)味成分定量。

    1.3.3 諾麗果酵素的制備

    分別挑選無腐爛4個品種的諾麗鮮果,經(jīng)過清洗后瀝干。將4種諾麗鮮果分別裝入不銹鋼罐,常溫密封入罐發(fā)酵6個月,取出發(fā)酵后的諾麗果經(jīng)離心機離心(800 r/min、濾布300目)過濾后取濾液,即得到諾麗果酵素。

    1.3.4 抗氧化能力測定

    (1)羥自由基清除能力測定

    采用Fenton法[19]測定羥自由基清除率,其計算公式如下:

    式中:A0為空白組吸光度值;A1為實驗組吸光度值;A2為樣品本底吸光度值。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 諾麗鮮果品質(zhì)分析

    不同品種諾麗鮮果品質(zhì)指標測定結(jié)果見表1。由表1可知,在四個品種的諾麗鮮果中,卷葉型長果總多酚、粗多糖、總皂苷、原花青素、木質(zhì)素、去乙酰車葉草苷酸、槲皮素含量最高,分別為190 mg/100 g、380 mg/100 g、270 mg/100 g、4.56 mg/100g、3 000 mg/100 g、127 mg/100 g、0.095 6 mg/100 g。卵圓形葉大果總黃酮(以蘆丁計)、東莨菪亭、車葉草苷酸含量較高,分別為48.4 mg/100 g、2.36 mg/100 g、93.2 mg/100 g。西沙諾麗抗氧I號果香草酸和葉黃素含量較高,分別為1.11 mg/100 g、36.1 mg/100 g,而橢圓形葉大果中品質(zhì)指標普遍較低。

    表1 不同品種諾麗果品質(zhì)指標測定結(jié)果Table 1 Determination results of quality indexes of different varieties of Noni fruit mg/100 g

    值得注意的是,卷葉型長果中的槲皮素比其他果實高出近10倍,近些年的研究表明,槲皮素由于其強大的抗氧化作用和促凋亡作用,因而可作為有效的抗衰老、抗癌藥物[23]。卷葉型長果中的去乙酰車葉草苷酸和卵圓形葉大果中車葉草苷酸含量比其他兩個品種果實高出數(shù)倍,環(huán)烯醚萜類化合物具有抗炎的功效[9,24],并且除了可以抑制乙酰膽堿活性從而增強記憶力外,還具有通過降低血清中細胞因子水平從而增強血清抗氧化能力并抑制癌細胞發(fā)展的作用[25],因此具有很高的藥用價值,但在自然界可供食用的水果中并不常見。

    酚類、原花青素、黃酮和東莨菪亭等化合物已經(jīng)被多次報道存在于諾麗果中,并且均具有良好的抗氧化及抗菌效果,在本實驗樣品中測得的含量均高于以往報道中的其他品種[10,26]。從四個品種諾麗果中分離出的化合物大部分與果實的抗菌、抗氧化等功能相契合[27],印證了諾麗果實強大的輔助治療能力是來源于其內(nèi)化合物這一事實。綜合考慮,在以諾麗鮮果為原料生產(chǎn)的諾麗果干、諾麗果干粉時可以優(yōu)先考慮使用卷葉型長果作為原料,其次可使用卵圓形葉大果,若需要提取大量葉黃素單一特色物質(zhì),則可以考慮使用西沙諾麗抗氧I號果。

    2.2 諾麗果酵素品質(zhì)分析

    不同品種諾麗果酵素品質(zhì)指標測定結(jié)果見表2。由表2可知,諾麗果酵素中,西沙諾麗抗氧I號果總多酚、總皂苷、原花青素、東莨菪亭、總環(huán)烯醚萜(車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸)、原兒茶酸、咖啡酸、槲皮素含量較高,分別為150 mg/100 g、178 mg/100 g、4.94 mg/100 g、16.5 mg/100 g、242.6 mg/100 g、0.658 mg/100 g、1.25 mg/100 g、0.143 mg/100 g。卷葉型長果酵素多酚、黃酮含量較高,分別為190 mg/100 g、61.4mg/100g。卵圓形葉大果酵素粗多糖最高,為280mg/100g。橢圓形葉大果發(fā)酵后各種化合物含量有所增加,但與其他品種相比仍有不足。

    發(fā)酵過程是植物內(nèi)生微生物利用營養(yǎng)物質(zhì)積累次生代謝物的過程,經(jīng)過發(fā)酵的植物中化合物成分及含量會發(fā)生顯著的變化[28]。諾麗果實的成熟過程十分短暫,其易腐的特性使發(fā)酵過程也易于進行,因此制作諾麗發(fā)酵汁主要采用自然發(fā)酵的方式[29]。與表1比較分析可知,4個品種諾麗果在發(fā)酵后成分含量均發(fā)生了變化,去乙酰車葉草苷酸和東莨菪亭含量因代謝而在總體上大幅增加,卵圓形葉大果酵素和西沙諾麗抗氧I號果酵素中尤甚,但在卷葉型長果中增加較少;香草酸也有略微增加,在卷葉型長果和橢圓形葉大果中增加更多。諾麗果中的葉黃素和木質(zhì)素主要存在于果渣中,而酵素中含量很少,因此發(fā)酵后含量大幅下降;車葉草苷酸和皂苷在發(fā)酵汁中含量也呈現(xiàn)總體下降的趨勢。

    四個品種諾麗果發(fā)酵前后品質(zhì)變化的原因,推測:第一,由于微生物的作用,會消耗一些營養(yǎng)物質(zhì),導(dǎo)致部分物質(zhì)下降;同時微生物也會產(chǎn)生一些次級代謝產(chǎn)物,導(dǎo)致部分物質(zhì)上升;第二,物質(zhì)與物質(zhì)之間可能會進行相互反應(yīng),從而產(chǎn)生新的代謝物;第三,在發(fā)酵過程中與氧氣結(jié)合發(fā)生氧化反應(yīng),導(dǎo)致一些物質(zhì)因為氧化而降解。具體某一種物質(zhì)的變化機理還需更進一步研究。

    不添加任何輔助原料的自然發(fā)酵過程使得果實中的微生物利用原有的化合物進行代謝活動,發(fā)酵后諾麗果部分成分含量下降,比如多糖。微生物產(chǎn)生的水解酶可將不溶性果膠纖維素細胞壁降解為可溶性多糖,并將多糖分解為低聚糖或單糖,導(dǎo)致發(fā)酵過程中多糖濃度的減少[30]。而鮮果中占比較大的功能性化合物,如多酚、黃酮等,含量的變化可能是由于復(fù)雜的多酚在發(fā)酵過程中被酶分解為更簡單的黃烷醇[31]。但四個品種諾麗發(fā)酵汁中多酚和黃酮含量的增減并不顯著,其他功能性化合物含量也普遍呈增加趨勢,表明對諾麗果進行發(fā)酵后,酵素中化合物的成分含量雖有變動,但并不影響果實原有的主要功能,還會使一些特色成分的含量增加,與鮮果的優(yōu)勢不同。對比以往報道,測定的四種諾麗果實與其酵素所含功能性化合物的平均含量要更高一些[10],可以看出諾麗鮮果和諾麗果酵素在工業(yè)生產(chǎn)中均具有很大潛力。從品質(zhì)指標綜合表現(xiàn),西沙諾麗抗氧I號果進行發(fā)酵生產(chǎn)最為適宜,其次是卵圓形葉大果。

    2.3 諾麗果酵素揮發(fā)性風(fēng)味成分測定

    四個品種的諾麗果酵素中揮發(fā)性風(fēng)味成分含量GC-MS分析結(jié)果見表3。由表3可知,四個品種的諾麗果酵素中共鑒定出31種揮發(fā)性風(fēng)味成分,其中酯類17種,酸類8種,醇類4種,呋喃類1種和酮類1種。卵圓形葉大果、卷葉型長果、橢圓形葉大果、西沙諾麗抗氧I號果中分別共檢出20種、20種、18種、20種揮發(fā)性風(fēng)味成分。酯類在果汁風(fēng)味中起著重要作用,己酸甲酯是普遍存在于果實中的成分,它和水楊酸甲酯在果實中表現(xiàn)出明顯的花果香。酸類也是新鮮諾麗果中含量較大的揮發(fā)性風(fēng)味成分,辛酸和己酸是所有樣品中最重要的酸性化合物,其氣味類似于奶酪和汗液,具有微弱的刺激性特征[32]。3-甲基-3-丁烯-1-醇的存在使果實具有草本氣味[33],2-庚酮會產(chǎn)生奶酪狀氣味,2-乙?;秽ǔT谑澄镏谐尸F(xiàn)焦甜味[34]。含硫化合物可能會對果汁的感官特性產(chǎn)生負面影響,諾麗果酵素通常會產(chǎn)生令人不快的氣味和味道,類似大蒜、洋蔥或硫磺[32],這些主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)共同構(gòu)成了諾麗果酵素復(fù)雜的植物氣味。

    在四種諾麗果實中,卷葉型長果酵素的刺激性氣味相比于其他品種更弱一些,酯類物質(zhì)(己酸甲酯、辛酸甲酯、辛酸乙酯)含量較高,酸類的含量在四個品種中最低;而西沙諾麗抗氧I號果酵素中酯類和酸類和2-庚酮含量均為最高,氣味較為濃郁;橢圓形葉大果酵素整體上氣味更為單一,檢測出的成分種類為四種果實里最少;卵圓形葉大果中酸的含量較高,酯類含量較少,氣味較其他果實更刺鼻。研究表明,隨著果實發(fā)酵,酸的含量會逐漸降低,果實的刺激性氣味也會相應(yīng)緩和[35]。從揮發(fā)性風(fēng)味成分測定結(jié)果來看,選擇西沙諾麗抗氧I號果諾麗果品種制備諾麗果酵素最佳。

    2.4 不同品種諾麗果酵素的抗氧化活性

    不同品種諾麗果酵素的抗氧化活性測定結(jié)果見表4。由表4可知,橢圓形葉大果酵素、卵圓形葉大果酵素、西沙諾麗抗氧I號果酵素、卷葉型長果酵素對羥自由基清除能力分別為73.2%、82.5%、78.5%、75.5%,其卵圓形葉大果酵素羥自由基清除能力最強。

    表4 不同品種諾麗果酵素的抗氧化活性測定結(jié)果Table 4 Determination results of antioxidant activities of Jiaosu with different varieties of Noni fruit

    實驗利用鐵離子還原力,在波長700 nm處的吸光度值高低可以間接反映抗氧化性大小,吸光度值越大,還原力越強,反映其抗氧化活性越強。由表4可知,橢圓形葉大果酵素、卵圓形葉大果酵素、西沙諾麗抗氧I號果酵素、卷葉型長果酵素的還原力分別為0.350、0.553、0.594、0.544。四種諾麗果酵素中,還原力最強的是西沙諾麗抗氧I號果酵素;最弱為橢圓形葉大果酵素。

    ABTS經(jīng)氧化后生成穩(wěn)定的藍綠色ABTS自由基離子溶液,可與能清除自由基的樣品反應(yīng),從而使之褪色。根據(jù)在波長734 nm處測定吸光度值,吸光度值的大小可評價樣品抗氧化活性能力。由表4可知,西沙諾麗抗氧I號果酵素、橢圓形葉大果酵素、卵圓形葉大果酵素和卷葉型長果酵素對ABTS自由基清除率分別為79.3%、68.5%、70.1%、65.9%,西沙諾麗抗氧I號果酵素的ABTS自由基清除能力最強。

    DPPH自由基的醇溶液呈紫色,可與能清除自由基的樣品反應(yīng),使其顏色變淺,吸光度值的大小可判斷樣品的抗氧化能力。由表4可知,西沙諾麗抗氧I號果酵素、橢圓形葉大果酵素、卵圓形葉大果酵素和卷葉型長果酵素對DPPH自由基的清除能力分別為74.1%、63.0%、60.1%、60.1%;西沙諾麗抗氧I號果酵素對DPPH 自由基的清除能力最強。

    綜上,不同品種的諾麗果酵素其抗氧化活性效果存在差異,西沙諾麗抗氧I號果酵素的還原能力、ABTS自由基清除能力和DPPH自由基清除能力優(yōu)于其他3種,卵圓形葉大果酵素羥自由基清除能力最強。

    3 結(jié)論

    本研究對不同品種諾麗果及諾麗果酵素的品質(zhì)指標、揮發(fā)性成分及抗氧化活性進行了檢測,結(jié)果表明,諾麗鮮果中卷葉型長果的總多酚、粗多糖、總皂苷、原花青素、木質(zhì)素、去乙酰車葉草苷酸、槲皮素含量最高,綜合表現(xiàn)最好。而諾麗果酵素中西沙諾麗抗氧I號果酵素的總多酚、總皂苷、原花青素、東莨菪亭、總環(huán)烯醚萜(車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸)、原兒茶酸、咖啡酸、槲皮素含量最高,綜合表現(xiàn)最好。西沙諾麗抗氧I號果酵素風(fēng)味更加濃郁,刺激性氣味柔和,更讓人易接受。

    綜上所述,從工業(yè)生產(chǎn)角度考慮,生產(chǎn)諾麗果干或諾麗果干粉等產(chǎn)品建議選擇卷葉型長果;生產(chǎn)以諾麗果發(fā)酵制品,推薦西沙諾麗抗氧I號果。未來可以通過控制代謝來尋找不同品種果實最適宜的發(fā)酵時長,從而通過工業(yè)生產(chǎn)獲得更多的有益化合物,為藥用植物的工業(yè)產(chǎn)品生產(chǎn)提供更多思路。

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