重慶東部地區(qū)鲊廣椒乳酸菌分離鑒定及細菌菌群多樣性分析

程馳新笑，易宗偉，王玉榮，崔夢君，趙慧君，郭 壯*

（1.湖北文理學院 湖北省食品配料工程技術研究中心，湖北 襄陽 441053；2.湖北文理學院 乳酸菌生物技術與工程襄陽市重點實驗室，湖北 襄陽 441053）

“鲊”是指將面粉或米粉混以瓜果、蔬菜、魚肉及食鹽腌制而成的發(fā)酵食品，發(fā)源至今已有2 000多年歷史[1]。作為“鲊”的一種，鲊廣椒是以二荊條辣椒（Capsicum annuumL.）和玉米粉為原料，輔以食鹽、土豆絲或芋頭絲等輔料，置于陶壇中密封發(fā)酵而成[2]。乳酸菌是鲊廣椒發(fā)酵過程中的重要菌群，賦予了鲊廣椒酸香可口的特點[3]，ZHANG Z D等[4]相繼從鲊廣椒中分離出了4個乳酸菌新種，分別為鲊廣椒伴生乳桿菌（Companilactobacillus zhachilii）HBUAS52074T、恩施促生乳桿菌（Lactobacillus enshiensis）HBUAS57009T[5]、土家促生乳桿菌（Levilactobacillus tujiae）HBUAS51241T[6]和安琪嗜戊糖乳桿菌[6]（Secundilactobacillus angelii）HBUAS 51383T，表明鲊廣椒中蘊含了豐富而獨特的乳酸菌資源。

重慶市東部區(qū)地處武陵山區(qū)，毗鄰鄂湘黔三省，屬亞熱帶季風性濕潤氣候[7]，生態(tài)多樣性較高，加之當地少數民族眾多且居民具有食用鲊廣椒的習俗，因而該地區(qū)鲊廣椒中可能蘊含了豐富的乳酸菌資源。近年來，Illumina MiSeq 高通量測序技術突破了傳統(tǒng)微生物純培養(yǎng)方法的限制[8]，在鲊廣椒微生物多樣性解析方面亦有了一定的應用，如GUO Z等[9]利用該技術發(fā)現(xiàn)伴生乳桿菌屬（Companilactobacillus）、乳植物桿菌屬（Lactiplantibacillus）和棒狀桿菌屬（Corynebacterium）是湖南懷化市和貴州銅仁市兩個地區(qū)鲊廣椒中的核心優(yōu)勢細菌屬，且不同地區(qū)的鲊廣椒其細菌多樣性存在一定的差異。重慶東部地區(qū)亦有食用鲊廣椒的習俗，但民間認為鲊廣椒起源于重慶市中東部地區(qū)，因而開展重慶東部地區(qū)鲊廣椒源乳酸菌菌株的挖掘工作，同時對其鲊廣椒細菌菌群多樣性進行解析，對全面剖析鲊廣椒這一地方特色發(fā)酵食品的微生物類群具有積極的意義。

本研究從重慶東部的石柱縣、云陽縣、彭水縣、萬州區(qū)和黔江區(qū)共采集鲊廣椒樣品51份，使用傳統(tǒng)微生物純培養(yǎng)技術對其蘊含的乳酸菌進行了分離鑒定，使用Illumina MiSeq高通量測序技術對其細菌菌群多樣性進行了解析，以期為鲊廣椒中乳酸菌資源的挖掘提供菌株支持，為鲊廣椒的產業(yè)化推動提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鲊廣椒：采集自重慶東部5個地區(qū)的51份樣品，均為農戶使用當地原材料自制而成，樣品信息概述見表1；MRS培養(yǎng)基、碳酸鈣（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；基因組提取試劑盒：德國QIAGEN公司；rTaq酶、10×Buffer、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）：北京全式金生物技術有限公司；高通量測序配套試劑：美國Illumina公司。

表1 樣品采樣地及編號Table 1 Sampling place and code of samples

1.2 儀器與設備

DG250厭氧工作站：英國DWS公司；LRH-150生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學儀器有限公司；ECLIPSE Ci生物顯微鏡：日本Nikon公司；Veriti FAST梯度聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國ABI公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)：美國Protein Simple公司；PE300高通量測序平臺：美國Illumina公司；R920機架式服務器：美國DELL公司。

1.3 方法

1.3.1 鲊廣椒中乳酸菌菌株的分離純化

準確稱取10 g鲊廣椒，加入裝有90 mL生理鹽水的錐形瓶內，37℃振蕩30min，使其充分混勻制成10-1梯度，依次進行10倍梯度稀釋，取10-4、10-5和10-6稀釋液進行涂布，將涂布后的培養(yǎng)皿置于厭氧工作站（含80%N2、10%H2和10%CO2），30 ℃培養(yǎng)48 h[10]。挑選具有溶鈣圈的單菌落，進行三區(qū)域劃線純化，將革蘭氏染色為陽性，過氧化氫接觸酶為陰性，鏡檢結果合格的菌株，使用30%甘油保存于-80 ℃超低溫冰箱備用。

1.3.2 鲊廣椒中乳酸菌菌株的鑒定

采用十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethyl ammonium bbromide，CTAB）法進行分離菌株DNA的提取，將檢測合格的DNA產物進行PCR擴增和連接轉化。將瓊脂糖電泳檢測合格的克隆子送往上海桑尼生物科技有限公司進行測序，返回序列拼接后于美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）網站進行比對，并進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構建。

1.3.3 鲊廣椒中微生物宏基因組DNA提取及Illumina MiSeq測序

按照每個地區(qū)樣品數不少于2個不多于6個的原則，從51個鲊廣椒樣品中累計選取24個樣品進行Illumina MiSeq測序，其中石柱縣、萬州區(qū)和云陽縣各選取6個，編號分別為SZ1～SZ6、WZ1～WZ6和YY1～YY6，彭水縣4個，編號為PS1～PS4，黔江區(qū)2個，編號為QJ1～QJ2。

準確稱取2.0 g鲊廣椒樣品，按照基因組提取試劑盒說明書內容進行DNA的提取。參照李潔等[11]的擴增體系使用通用引物338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）和806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）對檢測合格的樣品DNA進行擴增，將擴增成功的PCR產物送至上海美吉生物醫(yī)藥有限公司進行高通量測序。

1.3.4 生物信息學分析

在2018年全國教育工作會議上，習近平指出，要把“立德樹人”融入教育實施各環(huán)節(jié)，學科體系、教學體系、教材體系、管理體系要以此為目標來設計，教師教學、學生求學都要圍繞這個目標?！傲⒌聵淙恕奔仁呛暧^層面的根本任務和目標，也是微觀層面的操作辦法和實施路徑，筆者主要討論課堂教學活動層面的“立德樹人”。立何“德”、樹何“人”？何以立“德”、何以樹“人”？是貫穿在各教學環(huán)節(jié)的主要問題，也是教學預警指標設計的主要參考點。

使用QIIME（QuantitativeInsightsIntoMicrobialEcology，v1.9.1）平臺對下機后的序列進行質量控制[12]，按照97%的相似度進行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）矩陣劃分；使用UCHIME去除嵌合體后[13]，選取代表性序列通過核糖體數據庫項目（ribosomal database project，RDP）[14]、GREENGENE[15]和SILVA數據庫[16]進行物種的注釋，進而對其分類學地位進行確定。

1.3.5 數據分析

使用MEGA 7.0的和R（v4.1.3）軟件對乳酸菌分離株的系統(tǒng)發(fā)育樹進行構建；使用Origin 2018軟件對平均相對豐度大于1.0%細菌門和細菌屬的堆積圖進行繪制。

2 結果與分析

2.1 鲊廣椒樣品乳酸菌的分離、鑒定及統(tǒng)計

通過純培養(yǎng)技術，51個鲊廣椒樣品共分離純化得到122株乳酸菌，經同源性比對隨機挑選同一種的各一株菌作為代表系列與模式菌株序列利用MEGA7.0和R軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構建，結果見圖1。

圖1 基于16S rRNA基因序列的部分乳酸菌分離株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of some lactic acid bacteria isolates based on 16S rRNA gene sequence

由圖1可知，所有乳酸菌歸屬于5個屬下的22個種，分別為隸屬于乳酸桿菌屬（Lactobacillus）的戊糖乳桿菌（L.pentosus）、消化乳桿菌（L.alimentarius）、植物乳稈菌（L.plantarum）、酸魚乳桿菌（L.acidipiscis）、類植物乳桿菌（L.paraplantarum）、蘇氏乳桿菌（L.suantsaii）、副干酪乳桿菌（L.paracasei）、清酒乳桿菌（L.sakei）、彎曲乳桿菌（L.curvatus）、福菜乳桿菌（L.futsaii）、肉糜乳桿菌（L.insicii）、短乳桿菌（L.brevis）、布氏乳桿菌（L.buchneri）和類谷糠乳桿菌（L.parafarraginis）共14個種，隸屬于魏斯氏菌屬（Weissella）的綠色魏氏菌（W.viridescens）、赫倫魏斯氏菌（W.hellenica）和泰蘭氏魏氏菌（W.thailandensis）共3個種，隸屬于片球菌屬（Pediococcus）的戊糖片球菌（P.pentosaceus）和乳酸片球菌（P.acidilactici）共2個種，隸屬于腸球菌屬（Enterococcus）的耐久腸球菌（E.durans）和屎腸球菌（E.faecium）共2個種，隸屬于明串珠菌屬（Leuconostoc）的腸膜明串珠菌（L.mesenteroides）共1個種?；诩兣囵B(yǎng)技術，對鲊廣椒乳酸菌進行分離鑒定，其多樣性分析見表2。

表2 基于純培養(yǎng)技術鲊廣椒中乳酸菌多樣性分析Table 2 Diversity analysis of lactic acid bacteria in zha-chili samples by pure culture technology

由表2可知，隸屬于乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、片球菌屬（Pediococcus）、腸球菌屬（Enterococcus）和明串珠菌屬（Leuconostoc）的菌株共分離出102株、10株、4株、3株和3株，分別占總分離株的83.61%、8.20%、3.27%、2.46%和2.46%。在分離到的102株乳酸桿菌菌株中，共分離出戊糖乳桿菌（L.pentosus）、消化乳桿菌（L.alimentarius）和植物乳桿菌（L.plantarum）32株、25株和23株，分別占乳酸桿菌分離株的31.37%、24.51%和22.55%，占乳酸菌總分離株的26.23%、20.49%和18.85%。由此可見，重慶東部地區(qū)鲊廣椒中乳酸菌類群以乳酸桿菌屬（Lactobacillus）為主，且L.pentosus、L.alimentarius和L.plantarum為其主要乳酸桿菌類群。本研究發(fā)現(xiàn)L.pentosus是重慶東北地區(qū)鲊廣椒中的優(yōu)勢乳酸菌之一，而席啦等[17-18]研究發(fā)現(xiàn)，湖北省宜昌市秭歸縣和荊州市洪湖市等地區(qū)鲊廣椒中的優(yōu)勢乳酸菌為L.plantarum，且均未分離出L.pentosus，與本研究存在一定差異。由此可見，不同地區(qū)的鲊廣椒其乳酸菌類群存在較大的差異，因而從不同地區(qū)鲊廣椒中收集和挖掘乳酸菌資源是極為必要的。

2.2 基于MiSeq測序技術鲊廣椒細菌群落組成分析

2.2.1 基于門水平鲊廣椒樣品細菌群落組成分析

在24個鲊廣椒樣品中平均相對含量大于1.0%的細菌門見圖2。

圖2 基于門水平鲊廣椒中細菌菌群多樣性分析結果Fig.2 Analysis results of bacterial community diversity in zha-chili samples at phylum level

由圖2可知，重慶東部地區(qū)鲊廣椒中平均相對含量大于1.0%的細菌門有3個，分別為厚壁菌門（Firmicutes）（80.36%）、變形菌門（Proteobacteria）（15.88%）和放線菌門（Actinobacteria）（3.38%）。CAI W C等[19]對湖南省湘西土家族苗族自治州的鲊廣椒細菌多樣性進行了解析，發(fā)現(xiàn)其優(yōu)勢細菌門亦為厚壁菌門、變形菌門和放線菌門，平均相對含量分別為81.14%、15.47%和2.99%，與本研究結果一致。由圖2亦可知，雖然厚壁菌門和放線菌門在各樣品中均存在，但其在各樣品中的含量存在一定的差異，如厚壁菌門在PS3等10個樣品中相對含量高達90%，但其在樣品QJ1和YY2中的相對含量均低于30%，放線菌門在樣品QJ1和YY2中的相對含量高達70%以上，而在PS3、SZ5、WZ2和YY6等樣品中相對含量均小于1.0%。

2.2.2 基于屬水平鲊廣椒樣品細菌群落組成分析

在24 個鲊廣椒樣品中平均相對含量大于1.0%的細菌屬見圖3。

圖3 基于屬水平鲊廣椒中細菌菌群多樣性分析結果Fig.3 Analysis results of bacterial community diversity in zha-chili samples at genus level

由圖3可知，重慶東部地區(qū)鲊廣椒中平均相對含量大于1.0%的細菌屬有7個，分別為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）（63.96%）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）（9.70%）、魏斯氏菌屬（Weissella）（9.16%）、乳球菌屬（Lactococcus）（3.15%）、棒桿菌屬（Corynebacterium）（2.96%）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）（1.50%）和腸桿菌屬（Enterobacter）（1.50%）。CAI W C等[20]對湖北和湖南地區(qū)鲊廣椒細菌菌群多樣性進行解析，結果發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌屬平均相對含量為74.17%，為樣品中含量最多的細菌，這與本研究結果一致，而其研究發(fā)現(xiàn)片球菌屬（Pediococcus）在樣品中的相對含量亦高達2.93%，與本研究存在一定的差異，究其原因可能是由于地域環(huán)境、生產工藝或原料存在差異導致的。乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）和乳球菌屬（Lactococcus）等乳酸菌廣泛存在于泡菜[21]和酸奶[22]中，在食品的發(fā)酵過程中起著重要的作用，亦對成品的品質產生重要影響。有研究表明，乳酸桿菌屬具有耐酸性較強的特點，能夠代謝碳水化合物產乳酸，可抑制其他雜菌的生長，從而起到了防腐的效果[23]；魏斯氏菌屬可以代謝產生纖維素，并且在發(fā)酵過程中會產生部分有機酸和酯類，提高產品風味[24]；乳球菌屬中的乳酸乳球菌（L.lactis）是干酪常用的發(fā)酵劑，能夠將乳糖轉化產生乳酸，具有促進蛋白質水解等作用，從而對乳制品風味產生重要影響[25]。值得關注的是，隸屬于棒桿菌屬（Corynebacterium）[26]和葡萄球菌屬（Staphylococcus）[27]的部分菌種為條件致病菌，因而在后續(xù)研究中篩選具有鲊廣椒優(yōu)良發(fā)酵特性的乳酸菌并實現(xiàn)產品的乳酸菌純種發(fā)酵，對提升鲊廣椒的食用安全性具有積極意義。由圖3亦可知，雖然Lactobacillus和Weissella在各樣品中均存在，但其在各樣品中的含量亦存在一定的差異，Lactobacillus在YY6等10個樣品中相對含量均＞90%，但其在YY2等6個樣品中的相對含量均＜30%，Weissella在樣品QJ2中的相對含量高達52.36%，而在WZ2等10個樣品中相對含量均＜1.0%。值得一提的是，其他5個平均相對含量＞1.0%的細菌屬并不存在于所有樣品中，這也進一步說明了重慶東部地區(qū)鲊廣椒細菌類群構成存在較大差異。

由此可見，重慶東部地區(qū)鲊廣椒中蘊含了豐富的乳酸菌資源，其乳酸菌類群主要以Lactobacillus、Weissella和Lactococcus為主。

3 結論

本研究采用純培養(yǎng)和Illumina MiSeq高通量測序技術相結合的方法對重慶東部地區(qū)鲊廣椒中乳酸菌進行了分離鑒定，同時對其細菌菌群多樣性進行解析。純培養(yǎng)結果發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)鲊廣椒中可培養(yǎng)乳酸菌以戊糖乳桿菌（L.pentosus）、消化乳桿菌（L.alimentarius）和植物乳桿菌（L.plantarum）為主，3類乳酸桿菌分離株累計占總分離株總數的65.57%。高通量測序結果表明，平均相對含量＞1.0%細菌門為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria），平均相對含量＞1.0%細菌屬為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）、魏斯氏菌屬（Weissella）、乳球菌屬（Lactococcus）、棒桿菌屬（Corynebacterium）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）和腸桿菌屬（Enterobacter），且乳酸桿菌屬（Lactobacillus）的平均相對含量為63.96%。