傳染性脾腎壞死病毒滅活疫苗對鱖腸道微生物的影響研究

何潤真,朱凝瑜,梁倩蓉,鄭曉葉,陳小明,姚高華,丁雪燕

( 浙江省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站,浙江 杭州 310023 )

鱖(Sinipercachuatsi)是我國具有重要經(jīng)濟價值的優(yōu)質(zhì)淡水品種,有“淡水石斑”之美稱。隨著鱖養(yǎng)殖規(guī)模的擴大和養(yǎng)殖密度的提高,鱖養(yǎng)殖中的疾病增多,其中病毒病由于傳播快、發(fā)病率高、死亡率高、無特效藥等特點危害最大。傳染性脾腎壞死病毒病是自1994年以來在鱖養(yǎng)殖中暴發(fā)的一種流行性疾病,病原是一種雙鏈DNA病毒,直徑約150 nm,主要感染鱖的脾臟和腎臟[1-2]。感染該病的鱖主要臨床癥狀包括:頭、下頜、鰓蓋、鰭條基部、體表等有點狀或片狀出血,鰓貧血,肝臟有出血點,脾臟和腎臟腫大,腸道內(nèi)有黃色液體等[2]。病毒可以在鱖體內(nèi)長期潛伏,發(fā)病10 d內(nèi)致死率高達90%以上[3]。因此,有必要對其開展深入研究,探索該病的防治方法。

疫苗是預(yù)防和控制魚類病毒性疾病最為有效的方式,目前主要有滅活疫苗、重組亞單位疫苗和DNA疫苗3種病毒疫苗,其中滅活疫苗因為安全性高、免疫效果穩(wěn)定、制備方式成熟等優(yōu)點是當(dāng)前研發(fā)重點。Dong等[4]建立病毒敏感的鱖仔魚細(xì)胞系,研制出傳染性脾腎壞死病毒滅活疫苗在實驗室和大塘兩種環(huán)境下,疫苗對鱖的免疫保護率均超過90%。Fu等[5]用鱖腦細(xì)胞敏感細(xì)胞系制備的病毒滅活疫苗也獲得了較好的免疫保護效果。此外,潘厚軍等[6]采用感染傳染性脾腎壞死病毒的鱖病變組織制備的勻漿疫苗也獲得了較強的免疫保護效果。

已有的研究表明,腸道微生物群落通過參與物質(zhì)代謝、營養(yǎng)吸收、免疫應(yīng)答和疾病防御來維持宿主的健康[7-8]。腸道微生物的組成與豐度受到養(yǎng)殖環(huán)境[9]、水質(zhì)[10]、飼料[11]、性別[12]、生長階段[13]和病原感染[14]的影響。正常生理狀態(tài)下,腸道微生物可以通過脂多糖、脂蛋白和代謝產(chǎn)物等特定組分調(diào)控宿主的免疫反應(yīng),促進免疫系統(tǒng)發(fā)育[15]。腸道微生物可以刺激杯狀細(xì)胞分泌黏蛋白,維持腸道黏液層的完整[16-17]。在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)腸道菌群可以通過樹突狀細(xì)胞刺激腸道黏膜相關(guān)淋巴組織的發(fā)育成熟[18-19]。部分腸道細(xì)菌被證實直接調(diào)控宿主的免疫反應(yīng),如分節(jié)絲狀菌能夠誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化[20],脆弱擬桿菌產(chǎn)生的多糖A能刺激Treg細(xì)胞分化[21],梭狀芽孢桿菌Ⅳ簇和Ⅺ Ⅴa簇能誘導(dǎo)T細(xì)胞分化為Treg細(xì)胞[22]。大量的研究表明,腸道微生物在調(diào)節(jié)免疫方面發(fā)揮了重要的作用,但目前對水產(chǎn)用疫苗免疫引起的宿主腸道微生物的變化方面的研究較少。筆者擬通過宏基因組高通量測序技術(shù)探究傳染性脾腎壞死病毒滅活疫苗免疫后鱖腸道微生物的結(jié)構(gòu)變化和功能基因篩選,旨在揭示疫苗對腸道微生物的影響機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用鱖來自浙江嘉善縣新源水產(chǎn)種業(yè)養(yǎng)殖場,體質(zhì)量(20±1.8) g,共800尾。養(yǎng)殖水溫(25±2) ℃,pH 8.0,溶解氧(6±1) mg/L。日投喂2次,飼料為普通商業(yè)飼料。將鱖暫養(yǎng)14 d后,隨機選取10尾用于細(xì)菌和病毒檢測,確保魚體健康無病。免疫試驗用傳染性脾腎壞死病毒滅活疫苗為中山大學(xué)何建國教授研究團隊饋贈。

1.2 免疫試驗

將魚均分為對照組和免疫組2組,每組50尾,在免疫前1 d暫停飼料投喂。疫苗使用前混合均勻,免疫組鱖進行腹腔注射免疫,0.1 mL/尾;對照組注射等體積無菌生理鹽水。對照組和免疫組放入同一池塘中養(yǎng)殖,池塘中間用紗網(wǎng)隔開確保將2組魚分隔開。試驗過程中每日投喂2次,并根據(jù)天氣情況進行適當(dāng)調(diào)整。

1.3 腸道微生物基因組DNA提取

在免疫后28 d取對照組和免疫組鱖各10尾收集腸道糞便樣本,將每組樣本分別混合,液氮冷凍后-80 ℃保存?zhèn)溆?。按照QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit(德國)的使用說明提取糞便樣品中的微生物基因組DNA,提取的DNA用微量分光光度計檢測DNA純度,并通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA片段的完整性。

1.4 文庫構(gòu)建及高通量測序

采用Illumina試劑盒進行雙末端文庫構(gòu)建,文庫質(zhì)檢合格后用NovaSeq 6000 PE150進行高通量測序分析。將測序得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過預(yù)處理后進行組裝得到重疊群,利用MetaGeneMark對各個樣本及混合組裝的重疊群(≥500 bp)進行編碼區(qū)預(yù)測,并且根據(jù)預(yù)測結(jié)果將編碼區(qū)長度小于100 nt的序列進行過濾。隨后根據(jù)編碼區(qū)預(yù)測結(jié)果,利用CD-HIT軟件進行去冗余,獲得非冗余的基因,同時以95%一致性、90%覆蓋度進行聚類,并選取最長的序列為代表性序列;利用Bowtie2將各樣本的有效數(shù)據(jù)比對到基因序列上,計算各個基因在各樣品中比對上的讀長數(shù)目;過濾掉在所有樣品中比對上讀長數(shù)目≤2的基因,獲得最終用于后續(xù)分析的序列。根據(jù)比對上的讀長數(shù)目及各個基因長度,計算各基因在每個樣品中的豐度信息,計算公式如下:

式中,Gk是某個基因在樣本中的TPM(Transcripts Per Million)值,k代表某個基因,n是檢測到有讀長覆蓋的基因數(shù)目,r為比對上基因的讀長數(shù)目,L為基因的長度。

利用DIAMOND軟件將序列與NR_meta庫進行比對(BLASTP,e≤10-5);比對后對每個Unigene的比對結(jié)果,選取比對指標(biāo)最好的比對結(jié)果進行物種分類。結(jié)合美國國家生物技術(shù)信息中心的物種分類系統(tǒng)可以得到不同分類學(xué)水平的具體物種注釋信息。將物種分類信息與Unigene的豐度信息結(jié)合,可以得到各個分類等級的豐度信息,某個分類等級的豐度等于注釋到該分類等級的Unigene豐度的加和。經(jīng)過種水平注釋信息統(tǒng)計,計算Alpha多樣性、Beta多樣性。將序列在物種分類、功能注釋、基因水平上進行豐度統(tǒng)計及差異比較分析,并進行GO和KEGG數(shù)據(jù)庫富集分析。該部分主要由杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 鱖腸道微生物Alpha多樣性分析

對測序獲得的序列進行組裝后共獲得8133條重疊群,其中:對照組有7166條重疊群,總長度為6 775 657 bp,N50為973 bp;免疫組有967條重疊群,總長度為756 549 bp,N50為753 bp。對樣本的重疊群(≥500 bp)進行編碼區(qū)預(yù)測,過濾掉小于100 nt的序列,去除冗余序列,最終獲得有效的序列。以95%一致性、90%覆蓋度進行聚類分析,2組樣本共獲得9669條序列,平均長度為543 bp,其中對照組有8736條序列、免疫組有933條序列,2組樣本共有序列為933條(圖1)。Alpha多樣性分析結(jié)果表明,Chao1指數(shù)在對照組中更高,Goods_coverage指數(shù)免疫組和對照組相同,香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)在免疫組中更高,這些結(jié)果表明,免疫組中微生物的多樣性和豐富度更高(圖2)。

圖2 腸道微生物Alpha多樣性分析Fig.2 Alpha diversity analysis of intestinal microflora

2.2 鱖腸道微生物組成結(jié)構(gòu)分析

物種豐富分析結(jié)果顯示,在門水平上共鑒定出37個門。其中:對照組腸道微生物以變形菌門和厚壁菌門為優(yōu)勢菌門,相對豐度分別為72.23%和1.99%;免疫組腸道微生物以變形菌門、衣原體門、厚壁菌門、放線菌門和藍細(xì)菌為優(yōu)勢菌門,相對豐度分別為28.57%、11.13%、6.38%、3.13%和1.00%(圖3)。

圖3 腸道菌群組成結(jié)構(gòu)分析Fig.3 The composition of intestinal bacterial community

在屬水平上對照組腸道微生物以氣單胞菌屬(Aeromonas)、梭菌屬(Clostridium)、伯克霍爾德氏菌屬(Paraburkholderia)和衣原體屬(Chlamydia)為主要優(yōu)勢屬,其中氣單胞菌屬相對豐度最高達71.73%;免疫組腸道微生物以衣原體屬、埃希氏桿菌屬(Escherichia)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)和腸球菌屬(Enterococcus)為主要優(yōu)勢屬,相對豐度分別為11.57%、8.70%、6.18%、5.48%、5.14%和3.53%(圖3)。

在種水平上對照組腸道微生物主要包括維氏氣單胞菌(A.veronii)和嗜水氣單胞菌(A.hydrophila),相對豐度分別為51.67%和1.73%;免疫組腸道微生物主要包括沙眼衣原體(C.trachomatis)、大腸桿菌(E.coli)、鮑曼不動桿菌(A.baumannii)、糞腸球菌(E.faecium)、綠膿假單胞菌(P.aeruginosa)和肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae),相對豐度分別為9.05%、8.91%、4.70%、3.61%、3.39%和3.20%(圖3)。

2.3 差異基因功能注釋分析

免疫組與對照組相比,共篩選出9656個差異豐度基因,其中有840個基因高豐度,8816個基因低豐度。GO富集分析結(jié)果顯示,差異基因在生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能上均有富集,其中:生物學(xué)過程主要包括DNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、磷酸化信號傳遞系統(tǒng)、氧化還原過程、趨化性、蛋白水解作用等過程;細(xì)胞組分主要包括細(xì)胞溶質(zhì)、質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)和膜等組分;分子功能主要包括蛋白結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、核糖體的結(jié)構(gòu)成分、ATP結(jié)合和DNA結(jié)合等功能(圖4)。

圖4 差異基因GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of differential genes

對差異基因進行KEGG富集分析,前20位的分析結(jié)果顯示,差異基因主要富集在雙組分系統(tǒng)、ABC轉(zhuǎn)運子、嘌呤代謝、群體感應(yīng)、細(xì)菌趨藥性、鞭毛組裝和細(xì)菌分泌系統(tǒng)等通路,通路中的絕大部分基因在免疫組中的豐度均低于對照組(表1)。

表1 注釋到序列數(shù)目最多的20條KEGG通路

3 討 論

3.1 疫苗接種對鱖腸道微生物組成的影響

由于水生動物所處的水體環(huán)境以及食性的不同,其腸道微生物的主要類群也各不相同。腸道中含有大量的微生物,近年來的研究表明,腸道微生物對宿主的生命活動有重要的影響,在宿主的消化吸收、抗逆性、免疫反應(yīng)等方面均具有一定的作用[23-24]。腸道微生物可通過抑制病原微生物定殖,增強腸道免疫應(yīng)答來保護機體免受感染與侵害[25]。

魚類腸道中一般有變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門3門核心微生物。草食性的魚類如草魚(Ctenopharyngodonidellus)和團頭魴(Megalobramaamblycephala)腸道細(xì)菌主要來自變形菌門、梭桿菌門和厚壁菌門[26]。雜食性魚類如鰱(Hypohthalmichthysmolitrix)、鳙(Aristichthysnobilis)腸道細(xì)菌主要來自變形菌門和厚壁菌門[27]。肉食性魚類如鱖和翹嘴鲌(Culteralburnus)腸道微生物以鹽單胞菌屬(Halomonas)、梭桿菌屬(Fusobacterium)等以產(chǎn)生蛋白酶為主要功能的微生物為優(yōu)勢腸道菌群[28]。蝦腸道細(xì)菌主要來自厚壁菌門、放線菌門、梭桿菌門和變形菌門[29]．三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)腸道優(yōu)勢細(xì)菌來自厚壁菌門、放線菌門和變形菌門[30]。腸道微生物的組成為揭示不同類型微生物在宿主生命活動中的作用提供了重要的參考依據(jù)。

對健康和病變的圓口銅魚(Coreiusguichenoti)的腸道微生物進行16S rRNA測序分析,發(fā)現(xiàn)病變魚腸道細(xì)菌多樣性低于健康魚,且病變魚中變形菌門豐度顯著高于健康魚,其中占比最高的氣單胞菌屬可能是造成疾病的關(guān)鍵病原[31]。采用16S rDNA測序技術(shù)分析海藻希瓦氏菌感染對半滑舌鰨腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),健康半滑舌鰨腸道微生物豐度及多樣性均高于感染后[32]。本試驗結(jié)果顯示:對照組腸道微生物以變形菌門為優(yōu)勢菌門,相對豐度達到72.23%;免疫組腸道微生物以變形菌門、衣原體門、厚壁菌門、放線菌門和藍細(xì)菌門為主。對照組微生物的種類更多,而免疫組中微生物的多樣性和豐富度更高,這與之前的研究結(jié)果類似。張正等[33]在患腹水病和皮膚潰爛病半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)、劉志剛等[34]在患鏈球菌病的尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)的研究中也發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果。不同養(yǎng)殖環(huán)境的魚類中腸道優(yōu)勢菌群不同,淡水魚中主要以氣單胞菌屬、假單胞菌屬和擬桿菌屬(Bacteroides)為主要優(yōu)勢菌群[35]。本試驗結(jié)果顯示,疫苗免疫后鱖的優(yōu)勢菌群從對照組的氣單胞菌屬(71.73%)轉(zhuǎn)變?yōu)槊庖呓M的衣原體屬(11.57%)、埃希氏桿菌屬(8.7%)、不動桿菌屬(6.18%)、假單胞菌屬(5.48%)和腸球菌屬(3.53%)。腸道微生物多樣性的提高有助于出現(xiàn)拮抗特性的菌群,從而幫助魚體應(yīng)對病原菌的入侵,而抗生素的不當(dāng)使用則會降低腸道微生物的多樣性,促使病原體的定殖[36]。腸道微生物的多樣性已被用作魚類健康的生物標(biāo)志物[37],大量研究發(fā)現(xiàn),腸道微生物的多樣化程度越高,對宿主的保護作用越大[38-39]。因此,本試驗中傳染性脾腎壞死病毒滅活疫苗免疫的鱖腸道微生物多樣性增加,有利于減少感染致病性病原菌的風(fēng)險。

3.2 疫苗接種對鱖腸道益生菌組成的影響

乳酸菌和芽孢桿菌是廣泛使用的益生菌,它們通過調(diào)節(jié)腸道黏膜免疫、與共生菌群或潛在有害病原體相互作用、產(chǎn)生代謝產(chǎn)物(如短鏈脂肪酸和膽汁酸)、激活信號通路作用于宿主細(xì)胞來調(diào)節(jié)腸道微生態(tài),這些機制有助于抑制和消除潛在病原體,改善腸道微環(huán)境,增強腸道屏障,減輕炎癥,增強抗原特異性免疫應(yīng)答[40-41]。Liu等[42]用枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)E20飼喂點帶石斑魚(Epinepheluscoioides)4周后,其生長指標(biāo)、固有免疫性能和疾病防御能力均有明顯提高。Son等[43]研究發(fā)現(xiàn),在石斑魚的飼料中添加植物乳桿菌可顯著提高石斑魚的存活率、飼料轉(zhuǎn)化率和平均體質(zhì)量。Carnevali等[44]從成年金頭鯛(Sparusaurata)中分離出的兩株食果糖乳桿菌(Lactobacillusfructivorans)可顯著提高金頭鯛魚苗的成活率。Bagheri等[45]研究發(fā)現(xiàn),飼料中添加枯草芽孢桿菌可顯著提高虹鱒(Onchorhynchusmykiss)幼苗的存活率。Zokaeifar等[46]研究發(fā)現(xiàn),枯草芽孢桿菌投喂8周后的凡納濱對蝦(LitopenaeusVannamei)具有更強的抵抗哈維氏弧菌的能力。益生菌具有增加腸道皺襞面積和厚度,提高腸道消化酶活性、促進腸道內(nèi)雙歧桿菌(Bifidobacterium)或乳酸菌的生長的作用[47]。筆者發(fā)現(xiàn),一些腸道益生菌如乳桿菌屬、芽孢桿菌屬和類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)的細(xì)菌在免疫組中均有顯著上升。此外,免疫后的鱖腸道維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌的數(shù)量明顯減少,大腸桿菌和糞腸球菌等明顯增加。維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌是廣泛存在于水體環(huán)境中的條件致病菌,在魚體免疫力降低或體表損傷時容易侵入魚體導(dǎo)致其發(fā)病。免疫組鱖腸道維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌數(shù)量的明顯減少可能與魚體接種疫苗后免疫力增強有關(guān)。

一些腸道微生物與T細(xì)胞分化有關(guān),如克雷伯氏菌(Klebsiellasp.)的異常定殖可以誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞吞噬作用并釋放促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-12、腫瘤壞死因子,促進輔助性T淋巴細(xì)胞1的極化作用[48];脆弱擬桿菌(B.fragilis)是一種寄生于人體消化道的共生厭氧菌,它在腸道中定殖可預(yù)防小鼠腸道炎癥性疾病[49]。筆者發(fā)現(xiàn),克雷伯氏菌和脆弱擬桿菌在免疫組中均有顯著增加,該變化可能有助于增強魚體的炎癥免疫應(yīng)答。

4 結(jié) 論

已有的研究表明,腸道微生物在調(diào)節(jié)免疫方面發(fā)揮了重要的作用,筆者通過高通量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn),傳染性脾腎壞死病毒滅活疫苗免疫后鱖腸道微生物的組成和功能基因出現(xiàn)明顯變化,可引起致病菌維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌比例的減少,同時引起乳酸菌屬、芽孢桿菌屬和類芽孢桿菌屬等有益細(xì)菌比例增加,這為了解疫苗的作用機制提供了新的思路。此外,通過腸道微生物組成的改變有利于篩選出新的“疫生菌”,對于預(yù)防和控制疾病開辟新的治療方案。